Curcumine-beladen chitosan – runderserumalbumine-nanodeeltjes mogelijk versterkte Aβ42-fagocytose en gemoduleerde macrofaagpolarisatie bij de ziekte van Alzheimer

Inleiding

De ziekte van Alzheimer (AD) is een neurodegeneratieve aandoening die wordt gekenmerkt door een sluipend begin en een progressie van cognitieve achteruitgang. Histopathologisch wordt amyloïde-β (Aβ) 42 als een peptide dat 42 aminozuren bevat geaggregeerd tot amyloïde β-peptide fibrillen die worden gekenmerkt door extracellulaire "seniele plaques" in AD, waardoor neuronale apoptose en het verlies van synapsen wordt geïnduceerd [1,2,3] . Over het algemeen zijn Aβ42-monomeren fysiologisch oplosbaar en niet-toxisch, terwijl de oligomeren in vitro en in vivo toxischer zijn [4, 5]. Daarom wordt het tussenkomen van Aβ42-aggregatie door het klaren van het Aβ42-monomeer algemeen beschouwd als het meest geschikte therapeutische doelwit voor AD [6,7,8,9]. Het is algemeen bekend dat Aβ-peptiden microgliale activering kunnen veroorzaken door interactie met verschillende Toll-like receptoren (TLR's), waaronder TLR4, en ze bevorderen ook CD14-, TLR4- of TLR2-afhankelijke fagocytose en de klaring van Aβ42 [10, 11,12]. Hoewel microgliale activatie de klaring van Aβ42 kan bevorderen, zijn microgliale cellen - een type mononucleaire macrofaag - mogelijk overgeactiveerd en gepolariseerd tot het M1-fenotype (gekenmerkt door de afgifte van potentieel neurotoxische oplosbare factoren en pro-inflammatoire cytokinen), wat leidt tot tot neuronale dood en verergering van de ontwikkeling van AD. Omgekeerd zijn sommige microgliale cellen van het klassiek geactiveerde (M2) fenotype dat wordt gekenmerkt door de productie van ontstekingsremmende cytokinen; deze verbeteren cognitieve disfunctie in AD [13,14,15,16]. Daarom kan de verhouding van macrofagen van het M1/M2-type de progressie van AD aanzienlijk beïnvloeden [17, 18]; bovendien zal de opregulatie die nodig is om pro-inflammatoire M1 om te zetten in anti-inflammatoire M2 macrofagen veelbelovend potentieel vertonen bij de preventie en behandeling van AD.

Curcumine, dat afkomstig is van een bestanddeel van de Indiase kruidenkurkuma (Curcumin longa) - een soort gember - is een krachtig ontstekingsremmend middel dat ontstekingen kan verminderen en mogelijk zelfs een rol speelt bij de behandeling van AD [19]. In de afgelopen jaren is ontdekt dat curcumine naar verluidt anti-amyloïdogene, ontstekingsremmende, anti-oxidatieve en metaalchelerende eigenschappen bezit die mogelijk neuroprotectieve effecten hebben [20, 21]. Curcumine moduleert macrofaagpolarisatie door remming van de toll-like receptor 4-mitogeen-geactiveerde proteïnekinase (TLR4-MAPK)/NF-KB-routes [22,23,24]. De slechte stabiliteit en biologische beschikbaarheid van curcumine beperken echter de klinische toepassing ervan. Bovendien voorkomt de aanwezigheid van de bloed-hersenbarrière (BBB) ​​ook de penetratie van curcumine bij de behandeling van AD [25,26,27].

Om het transport van medicijnen van het bloed naar de hersenen te verbeteren, kunnen nanodeeltjes (NP's) met een oppervlak dat is gefunctionaliseerd met peptiden [28] en antilichamen [29] de medicijnafgifte over de BBB ondersteunen en kan de penetratie-efficiëntie van de BBB van NP's aanzienlijk worden verbeterd via actieve transportmechanismen. dan eenvoudige passieve diffusie [30]. Chitosan (CS) NP's - een nano-drager voor associatie met Aβ - kunnen de BBB doordringen en zijn niet-immunogeen [31]. Bovendien werd serumalbumine gevonden in het circulerende plasma van het menselijk lichaam in concentraties van 50 g/l serum, en het was niet-toxisch en werd goed verdragen door het immuunsysteem [32, 33]. Er werd ook gemeld dat van runderserumalbumine (BSA) afgeleide nanodeeltjes langdurige afgifte-eigenschappen hebben die de halfwaardetijd van het geneesmiddel kunnen verlengen, waardoor de frequentie van toediening afneemt en de therapietrouw van de patiënt toeneemt [34]. Daarom hebben we CS en BSA als de twee biomaterialen gebruikt om met curcumine beladen CS-BSA NP's te bereiden om de beste BBB-penetratie te bereiken. De effecten van curcumine op de fagocytose van Aβ42, inflammatoire cytokinesecretie en de regulatie van de TLR4-MAPK/NF-KB-routes werden onderzocht om het moleculaire mechanisme van curcumine op macrofaagpolarisatie verder te bevestigen.

Materialen

CS met een deacetyleringsgraad van 80% en een molecuulgewicht van ongeveer 400 kDa werd gekocht bij Haixin Biological Product Co., Ltd. (Ningbo, Volksrepubliek China). BSA werd gekocht bij Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, VS) en curcumine werd gekocht bij Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd. (Dalian, Volksrepubliek China). FITC-β-amyloïde (1-42) werd gekocht van Chinese Peptide Co., Ltd. (Hangzhou, Volksrepubliek China). De andere gekochte chemicaliën waren van analytische kwaliteit en verkregen van Sigma-Aldrich Co. De macrofaagcellijn, RAW 264.7 (muizenleukemische monocyt macrofaagcellijn), en de hersenmicrovasculaire endotheelcellijn (hCMEC/D3), die als model diende van de menselijke BBB, werden opgericht door het Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai (Volksrepubliek China). Beide cellen werden op een temperatuur van 37 °C gehouden en met een 5% CO₂ atmosfeer, in Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) aangevuld met 10% (volume/volume) door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum en antibiotica (100 U/ml penicilline en 100 mg/ml streptomycine). Er werd gemeld dat RAW 264,7-cellen die zijn behandeld met lipopolysaccharide (LPS) aspecten van microgliale cellen recapituleren die zijn waargenomen bij neurodegeneratieve ziekten, geïllustreerd door AD [35, 36]. Daarom werden macrofaagcellijn RAW 264.7-cellen gepolariseerd naar M1-fenotype door lipopolysaccharide (LPS; 1 μg/ml) verder toegepast om microgliale cellen in AD te simuleren.

Voorbereiding van curcumine-geladen CS-BSA NP's

Volgens ons vorige rapport [37], onder een elektrostatische interactie, zou positief geladen CS kunnen conjugeren met negatief geladen BSA om NP's te vormen. De bereidingsmethode was als volgt:0,1% azijnzuur werd gebruikt om CS op te lossen om een ​​oplossing van 0,5 mg/ml CS te verkrijgen en 100 μL DMSO met 0,05 mg/ml curcumine werd toegevoegd aan de CS-oplossing voor grondig mengen onder magnetische roeren bij kamertemperatuur. Als een geschikte hoeveelheid BSA-oplossing werd 1,0 mg/ml langzaam in het mengsel van CS en curcumine gedruppeld; op dit punt verscheen het opalescentiefenomeen en CS-BSA NP's werden verder gecondenseerd tot vaste deeltjes. Bovendien werden de grootte, polydispersiteit, zeta-potentiaal en morfologie van de NP's onderzocht. In vitro geneesmiddelafgifte door NP's werd geschat met behulp van een eerder gerapporteerde methode [37]. De inkapselingsefficiëntie (EE,%) van curcumine in NP's werd berekend met behulp van de onderstaande vergelijking.

\( \mathrm{EE}\%=\frac{W_{\mathrm{total}}-{W}_{\mathrm{free}}}{W_{\mathrm{total}}}\times 100\% \ )

W _totaal was de hoeveelheid aanvankelijk toegevoegde curcumine, W _gratis was de hoeveelheid curcumine die in het supernatant achterbleef.

Evaluatie van celapoptose door MTT

Om de veiligheid van CS-BSA NP's op celapoptose te bepalen, werd een MTT-assay gebruikt om de levensvatbaarheid van de cellen te evalueren. Volgens het protocol van onze vorige studie werden verschillende hoeveelheden blanco CS-BSA NP's gebruikt om RAW 264,7-cellen (M1-fenotype) en hCMEC/D3-cellen gedurende 24 uur bij 37 °C te behandelen voor verdere analyse.

Penetratiestudies met een in vitro BBB-model

Een monolaag transwell-cultuur met behulp van de hersenmicrovasculaire endotheliale cellijn, hCMEC/D3, is een algemeen in vitro BBB-model dat wordt gebruikt om de levering van NP's door de hersenen te bestuderen. De hCMEC/D3-celmix (in 0,5-1,0 ml totaal volume) werd toegevoegd aan het inzetstuk in de bovenste kamer van een 12-well transwell-plaat voor monolaag celkweek met een transendotheliale elektrische weerstand>  300 Ω; PBS met een pH-waarde van 7,4 werd in de onderste kamer toegevoegd. Vrije curcumine en de suspensie van met curcumine beladen CS-BSA NP's werden in de bovenste kamer geplaatst voor continue incubatie gedurende 3 uur in een incubator ingesteld op 37 ° C, 5% CO₂ . Daarna werden gratis curcumine en met curcumine beladen CS-BSA NP's over de cellen overgebracht en in de onderste kamer ingevoerd. De kwantificering van de gepenetreerde NP's werd gedetecteerd met behulp van een microplaatlezer (Synergy-2; BioTek Instruments, Winooski, VT, VS) door de fluorescentie-intensiteit van curcumine te controleren, die wordt geëxciteerd bij 425 nm en uitgezonden bij 530 nm. De relatieve fluorescentieverhouding (RFR, %), die de penetratiesnelheden van NP's weergeeft, werd berekend door de verhouding te bepalen van de fluorescentie-intensiteit van de gepenetreerde met curcumine beladen CS-BSA NP's in de onderste kamer tot die van de aanvankelijk toegevoegde curcumine- geladen CS-BSA NP's in de bovenste kamer. Verschillende endocytische remmers, zoals chloorpromazine (dat door clathrine gemedieerde opname remt) bij 10 g/ml, genisteïne (caveolae-gemedieerde opname) bij 1 μg/ml, cytochalasine D (30 μM, macropinocytose) en 20 μg/ml natrium azide (een energieremmer), werden gebruikt om verschillende endocytische routes vast te stellen die betrokken zijn bij de verschillende penetratiemechanismen. De relatieve penetratieverhouding werd bepaald door de penetratiegraad van NP's die met remmers waren behandeld te vergelijken met die van NP's die met niet-remmers waren behandeld.

De cellulaire opname van met curcumine geladen CS-BSA NP's

De distributie en locatie van met curcumine beladen CS-BSA NP's in RAW 264.7-cellen (M1-fenotype) werd waargenomen met behulp van confocale laserscanningmicroscopie (FluoView FV10i; Olympus Corporation, Tokyo, Japan). De hCMEC / D3-celmix (in 0, 5-1, 0 ml totaal volume) werd toegevoegd aan het inzetstuk in de bovenste kamer van de 12-well Transwell-plaat voor monolaagcelcultuur met een transendotheliale elektrische weerstand> -300 Ω. RAW 264.7-cellen (M1-fenotype) werden in de onderste kamer gezaaid. Vrije curcumine en een suspensie van met curcumine beladen CS-BSA NP's werden in de bovenste kamer geplaatst voor continue incubatie in een incubator ingesteld op 37 ° C, 5% CO₂ . Met vooraf bepaalde tussenpozen werden de cellulaire distributies van vrije curcumine en met curcumine beladen CS-BSA NP's in RAW 264.7-cellen (M1-fenotype) waargenomen door de groene fluorescentie te detecteren die wordt uitgezonden door curcumine met behulp van confocale laserscanningmicroscopie.

Detectie van de fagocytose van Aβ 42 geïnduceerd door vrije curcumine en met curcumine geladen CS-BSA NP's

RAW 264,7-cellen (M1-fenotype) in volledige groeimedia werden gezaaid in een plaat met 12 putjes (1 × 10 ⁵ cellen/putje) en behandeld met vrije curcumine en met curcumine beladen CS-BSA NP's gedurende 24 uur bij 37 °C. Om niet-geïnternaliseerde curcumine en met curcumine beladen CS-BSA NP's te verwijderen, werd gedestilleerd water gebruikt om cellen in korte tijd twee keer te wassen. Er werd gevonden dat curcumine en met curcumine beladen CS-BSA NP's volledig uit het medium werden geëlimineerd, en er was geen duidelijk risico dat cellen uit gedestilleerd water een lage osmolariteit veroorzaakten omdat de morfologie van cellen gewassen met gedestilleerd water intact was en geen uitbarsting van cellen werd waargenomen. Ten slotte werd vrij FITC-gelabeld Aβ42 opgelost in PBS (pH 7,4) aan de plaat toegevoegd voor continue incubatie gedurende 3 uur. De fagocytose van FITC-gelabeld Aβ42 in RAW 264,7-cellen (M1-fenotype) werd weergegeven door het detecteren van de groene fluorescentie uitgezonden door FITC. De intracellulaire fagocytose en locatie van Aβ42 in de cellen werden verder bestudeerd met behulp van confocale laser scanning microscopie (FluoView FV10i; Olympus Corporation).

Western-blot-assay

Om het mogelijke moleculaire mechanisme van door curcumine gemedieerde macrofaagpolarisatie te onderzoeken, onderzochten we de expressieniveaus van pro-inflammatoire cytokines, zoals tumornecrosefactor (TNF)-α en interleukine (IL)-6, en de fosforylatieniveaus van ERK, JNK , p38 en NF-KB door Western blotting voor verdere studie-specifieke effecten van curcumine op de TLR4-MAPK/NF-KB-signaleringsroute.

Resultaten

De karakterisering van met curcumine geladen CS-BSA NP's

De kenmerken van NP's werden onderzocht om hun deeltjesgrootte, zeta-potentiaal en morfologie te bepalen met behulp van een Zetasizer (Nano ZS90; Malvern Instruments, Malvern, VK) en transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) (Jeol, Tokyo, Japan) bij een versnellende spanning van 200 kV. De resultaten getoond in Fig. 1 gaven aan dat CS-BSA NP's een gemiddelde grootte vertoonden bij 143,5 nm, een negatief zeta-potentiaal bij -10,8 mV en een polydispersiteit bij 0,021, respectievelijk. Er werd waargenomen dat de met curcumine beladen CS-BSA NP's bolvormig en monodispers waren. De resulterende suspensie die met curcumine beladen CS-BSA NP's bevatte, werd gecentrifugeerd om een ​​bovenstaande oplossing te verkrijgen om de absorptie van curcumine te bepalen en om het gehalte aan vrije curcumine in de bovenstaande oplossing te berekenen volgens de standaardcurve. De inkapselingsefficiëntie (EE,%) van curcumine in NP's werd geschat op 95,4%. In termen van het medicijnafgifteproces van de NP's, vertoonden met curcumine beladen CS-BSA NP's een bifasisch afgiftepatroon in het medium met een pH-waarde van 7,4. Ongeveer 11,3% van alle medicijnen werd binnen de eerste 3 uur vrijgegeven, wat aangeeft dat toen de NP's in de bloedsomloop kwamen voordat ze de BBB bereikten, curcumine goed werd beschermd en ingekapseld in de kern van de NP's. Bovendien lekten enkele medicijnen uit de NP's en kwamen ze binnen de eerste 3 uur in het bloed terecht. De meeste met curcumine beladen CS-BSA NP's kunnen rond de BBB worden getransporteerd en de medicijnconcentratie rond de hersenen verbeteren.

Karakterisering van met curcumine geladen CS-BSA NP's. een TEM-afbeelding van met curcumine geladen CS-BSA NP's. b Dynamische lichtverstrooiing (DLS) analyse van de verkregen curcumine geladen CS-BSA NP's. c Zeta-potentiaalanalyse van de verkregen met curcumine beladen CS-BSA NP's. d Het in vitro afgifteprofiel van de verkregen met curcumine beladen CS-BSA NP's in fosfaatgebufferde zoutoplossing met een pH van 7,4 bij 37 °C gedurende 48 uur

Penetratiestudies met een in vitro BBB-model

De penetratiesnelheden van vrije curcumine en de NP's werden beoordeeld door de fluorescentie-intensiteit van curcumine in de onderste kamer te controleren met behulp van een microplaatlezer (Synergy-2; BioTek Instruments), en ze werden berekend door de verhouding van de fluorescentie-intensiteit van gepenetreerde curcumine te bepalen -geladen CS-BSA NP's in de onderste kamer tot die van de aanvankelijk toegevoegde curcumine-geladen CS-BSA NP's in de bovenste kamer. De resultaten (Fig. 2) toonden aan dat het penetratieproces van vrije curcumine en met curcumine beladen CS-BSA NP's tijdsafhankelijke patronen volgde en dat de penetratiesnelheid met de tijd toenam. Dit suggereerde dat de penetratiegraad van vrije curcumine 12,3% was na 1 uur, 20,3% na 2 uur en 29,8% na 3 uur. Vergeleken met vrije curcumine was de penetratie-efficiëntie van met curcumine beladen CS-BSA NP's verbeterd, zoals weergegeven door de verhoogde penetratiesnelheden; de penetratiegraad steeg tot 37,7% na 1 uur, 45,6% na 2 uur en 60,2% na 3 uur. Dit gaf aan dat vrije curcumine moeilijkheden kan ondervinden bij het penetreren door cellen en een slechte permeabiliteit voor de BBB vertoonde [38, 39]. Deze observatie gaf ook aan dat met curcumine beladen CS-BSA NP's de penetratie van geneesmiddelen door cellen effectief zouden kunnen bevorderen, wat de rol suggereert die door verschillende endocytische routes wordt gespeeld. Een endocytose-remmingstest toonde aan dat, in overeenstemming met de eerdere rapporten [40], vrije curcumine afhankelijk was van passieve diffusie voor penetratie en dat er geen duidelijke variatie was in de penetratie-efficiëntie van vrije curcumine, ongeacht of een remmer werd toegevoegd of niet. Omgekeerd was de penetratie van NP's energieafhankelijk en was de relatieve penetratieverhouding behandeld met natriumazide 55,6%. Bovendien medieerden zowel caveolae als macropinocytose voornamelijk de endocytische routes van NP's. Vergeleken met behandeling met niet-remmers waren de relatieve penetratieverhoudingen in cellen die werden behandeld met genisteïne en cytochalasine D respectievelijk 67,8% en 60,3%.

Analyse van het penetratiemechanisme van vrije curcumine en met curcumine beladen CS-BSA NP's door hCMEC/D3-cellen. een Fluorescentiespectrumanalyse van de penetratiesnelheden van gratis curcumine en met curcumine beladen CS-BSA NP's. Resultaten worden uitgedrukt als gemiddelden ± standaarddeviatie (n = 3). *P < 0.05, **P < 0,01 versus de penetratiegraad van gratis curcumine na 1 uur. ^## P <-0,01 versus de penetratiesnelheden van met curcumine geladen CS-BSA NP's na 1 uur. b Effecten van endocytische remmers op het penetratievermogen van vrije curcumine en met curcumine beladen CS-BSA NP's. Resultaten worden uitgedrukt als gemiddelden ± standaarddeviatie (n = 3). ^## P < 0,01 versus relatieve gepenetreerde verhouding van met curcumine beladen CS-BSA NP's behandeld met chloorpromazine

Evaluatie van celapoptose door MTT

De cytotoxische effecten van blanco CS-BSA NP's tegen RAW 264,7-cellen (M1) en hCMEC/D3 werden in vitro geschat met een MTT-assay. Cellen werden behandeld met verschillende concentraties CS-BSA NP's die varieerden van 0 tot 2,0 mg/ml. Een cellevensvatbaarheidstest in Fig. 3 toonde aan dat er geen duidelijke cytotoxische activiteiten werden waargenomen in RAW 264.7-cellen en hCMEC/D3-cellen bij behandeling met blanco CS-BSA NP's [37].

Levensvatbaarheid van RAW 264.7-cellen (M1) en hCMEC/D3-cellen na incubatie met verschillende hoeveelheden naakte CS-BSA NP's gedurende 24 uur (n = 3)

Distributie en cellulaire opname van NP's

Vrije curcumine en met curcumine beladen CS-BSA NP's die dezelfde hoeveelheid curcumine bevatten bij 100 μg / ml, werden gebruikt om RAW 264,7-cellen (M1) te behandelen, en de distributie en cellulaire opname van curcumine werden waargenomen door confocale laserscanningmicroscopie (FluoView FV10i; Olympus). In figuur 4 is te zien dat de intracellulaire distributie van vrije curcumine en met curcumine beladen CS-BSA NP's een tijdsafhankelijk patroon volgde en dat de groene fluorescentie van curcumine zich in de cel had opgehoopt en door het hele cytoplasma was verspreid. Met het verstrijken van de tijd werd de groene fluorescentie-intensiteit in de cellen verbeterd. Dit toonde aan dat de groene fluorescentie die door vrije curcumine in de cellen werd uitgezonden, erg zwak was, wat erop wees dat het grootste deel van de vrije curcumine niet werd opgenomen door de macrofaagcellijn, RAW 264.7. Omdat NP's veelbelovend potentieel kunnen hebben voor zeer efficiënte intracellulaire medicijnafgifte [41, 42], werd waargenomen dat met curcumine beladen CS-BSA NP's een verhoogde fluorescentie-intensiteit vertoonden in vergelijking met cellen die werden behandeld met vrije curcumine, wat suggereert dat CS-BSA NP's zouden kunnen verbeteren de cellulaire opname van curcumine. Hierin gaf deze waarneming aan dat CS-BSA NP's de accumulatie van geneesmiddelen in de cellen effectief zouden kunnen bevorderen.

De opname van vrije curcumine en curcumine geladen CS-BSA NP's in RAW 264,7-cellen (M1) gedurende 6 uur. Curcumine vertoonde een groene fluorescerende kleur en gaf de intracellulaire locatie van vrije curcumine en curcumine geladen CS-BSA NP's aan. De kern werd gekleurd met Hoechst (blauw) gedurende 15 minuten bij 37 ° C. De schaalbalk is 50 μm en geldt voor alle figuurdelen

Fagocytose van Aβ 42 geïnduceerd door vrije curcumine en met curcumine geladen CS-BSA NP's

Zoals weergegeven in figuur 5 vertoonde curcumine rode fluorescentie bij een excitatiegolflengte van 550 nm en een emissiegolflengte van 570 nm. Bovendien vertoonde het ook groene fluorescentie bij de excitatie- en emissiegolflengten van FITC. Daarom, zodra curcumine- en FITC-gelabelde Aβ42 waren gefagocyteerd in RAW 264,7-cellen (M1), vertoonden ze allemaal groene fluorescentie bij de excitatie- en emissiegolflengten van FITC. In het co-lokalisatie-experiment werden rode fluorescentie en groene fluorescentie (die curcumine vertegenwoordigen) samengevoegd en de gele stippen vertegenwoordigden het intracellulaire bestaan ​​en de locatie van curcumine; sommige groene stippen bevonden zich niet op dezelfde plaats als de rode fluorescerende stippen, die het bestaan ​​en de fagocytose van FITC-gelabelde Aβ 42 in RAW 264.7-cellen (M1) vertegenwoordigen. Er werd waargenomen dat weinig hoeveelheden Aβ 42 werden gefagocyteerd door microglia [43], wat werd bewezen door de intracellulaire observatie van groene fluorescentie in de cellen. Zoals te zien is in de overlappende afbeelding in Fig. 5, waren er, vergeleken met vrije curcumine, meer van de gele fluorescerende stippen van curcumine in de cellen opgehoopt, wat suggereert dat een grote hoeveelheid met curcumine beladen CS-BSA NP's, zoals weergegeven door gele fluorescerende intensiteit, was opgehoopt in de cellen vanwege de interactie tussen NP's en RAW 264,7-cellen (M1). Dit induceerde hogere intracellulaire concentraties curcumine, wat leidde tot de verhoogde fagocytose van Aβ 42 [44], zoals weergegeven door de hogere groene fluorescentie-intensiteit. Er werd verondersteld dat met curcumine geladen CS-BSA NP's macrofaagpolarisatie induceerden, evenals ontstekingsremmende en neuroprotectieve effecten die bijdroegen aan de verhoogde fagocytose.

Fagocytose van Aβ 42 geïnduceerd door vrije curcumine en met curcumine geladen CS-BSA NP's. De schaalbalk is 50 μm en geldt voor alle figuurdelen

Western-blot-assay

Om de mogelijke moleculaire mechanismen van door curcumine gemedieerde macrofaagpolarisatie te onderzoeken, onderzochten we de algehele niveaus van TNF-α, IL-6 en TLR4 evenals fosforylatieniveaus van p38, ERK, JNK en IκBα door Western blotting om de specifieke effecten van curcumine op de TLR4-MAPK/NF-KB-signaalroute.

Figuur 6 liet zien dat in vergelijking met de normale RAW 264,7-cellen als controlegroep, RAW 264.7-cellen (M1-fenotype) meer potentieel neurotoxische oplosbare factoren en pro-inflammatoire cytokinen afgeven die worden gekenmerkt door de hogere expressieniveaus van TNF-α en IL-6, wat leidt tot neuronale dood en verergering van de ontwikkeling van AD. Vergeleken met controle en vrije curcumine bleken met curcumine beladen CS-BSA NP's de M1-macrofaagpolarisatie te remmen en de laagste expressie van TNF-α en IL-6 in RAW 264,7-cellen (M1-fenotype) te induceren. Bovendien verminderden met curcumine beladen CS-BSA NP's ook de TLR4-expressie, die de polarisatie van M1-macrofaag reguleerde en de fosforylering van ERK, JNK, p38 en NF-KB leek te zijn verminderd. Dit suggereert dat met curcumine beladen CS-BSA NP's de accumulatie van curcumine - en de daaropvolgende intracellulaire concentratie - in de cellen effectief bevorderden, waardoor de blokkerende effecten op de TLR4-MAPK / NF-KB-signaalroute worden versterkt en de M1-macrofaagpolarisatie verder wordt geremd.

Western-blot-analyses van de expressieniveaus van TNF-α, IL-6, TLR4 en fosforylering van ERK, JNK, p38 en nucleaire factor (NF)-KB in RAW 264.7-cellen (M1-fenotype) na behandelingen met vrije curcumine en curcumine geladen CS-BSA NP's

Discussie

AD is een van de meest voorkomende neurodegeneratieve aandoeningen en de belangrijkste doodsoorzaak in ontwikkelde landen. Met betrekking tot de behandeling van AD was het vermogen van de BBB om de toegang van de meeste exogene stoffen in de hersenen te voorkomen, het belangrijkste obstakel dat het gebruik ervan verhinderde. Om dit probleem aan te pakken, hebben we CS-BSA NP's ontworpen om het transport van curcumine door de BBB te verbeteren. De resultaten toonden aan dat vrij curcumine, in overeenstemming met de vorige studie [45], moeilijk door de cellen drong en BBB passeerde, wat resulteerde in lagere penetrerende effecten. Met curcumine geladen CS-BSA NP's zouden de penetratie van geneesmiddelen door de BBB effectief kunnen bevorderen met de bemiddeling van door caveolae en micropinocytose gemedieerde routes. Neuro-ontsteking veroorzaakt door Aβ-aggregatie is een van de kritische factoren die ten grondslag liggen aan de pathologische mechanismen van AD [46]. Aβ-niveaus in de hersenen worden bepaald door de dynamische balans tussen de aanmaak en klaring van Aβ; daarom is de verwijdering van Aβ ook belangrijk bij het bepalen van het niveau in de hersenen. Het fagocytosevermogen van de microglia vertoonde een belangrijke fysiologische betekenis bij de preventie van AD. De microglia waren voornamelijk verantwoordelijk voor de klaring van Aβ-doelwit en hadden de neiging om voornamelijk te aggregeren rond de afzettingszone van Aβ 42, waardoor de accumulatie van Aβ 42 door fagocytose verder werd voorkomen [47, 48]. De resultaten toonden aan dat de fagocytose-effecten van met curcumine beladen met CS-BSA NP's behandelde RAW 264.7-cellen (M1-fenotype) op Aβ 42 waren toegenomen en dat de accumulatie en afzetting van Aβ 42 waren verminderd, wat de ontwikkeling van AD kan verbeteren.

Het microglia (M1-fenotype) maakt potentieel neurotoxische oplosbare factoren en pro-inflammatoire cytokines zoals TNF-α en IL-6 vrij, wat leidt tot neuronale dood en de ontwikkeling van AD verergert [49]. Er is gevonden dat M1-macrofaagpolarisatie afhangt van de activering van de TLR4-MAPK / NF-KB-signaleringsroute en dat het blokkeren van de TLR4-MAPK / NF-KB-signaleringsroute de M1-macrofaagpolarisatie zou kunnen remmen en de polarisatie van macrofagen van het M1-type zou kunnen bevorderen naar het M2-type [50]. Onze resultaten toonden aan dat curcumine als bestanddeel van het Indiase kruid, kurkuma (Curcumin longa) - een soort gember - een krachtig ontstekingsremmend middel was dat ontstekingen kon verminderen en zelfs een rol zou kunnen spelen bij de behandeling van AD. CS-BSA NP's dienden als krachtige hulpmiddelen voor de efficiënte BBB-gerichte penetratie van curcumine. Vergeleken met vrije curcumine induceerden met curcumine beladen CS-BSA NP's fagocytose-effecten en werd een grotere hoeveelheid Aβ42 gefagocyteerd door RAW 264,7-cellen. Bovendien induceerden met curcumine beladen CS-BSA NP's de lagere eiwitexpressieniveaus van TNF-α, IL-6 en TLR4 dan vrije curcumine, en de fosforylering van ERK, JNK, p38 en NF-KB werd ook geremd. Het gaf aan dat met curcumine geladen CS-BSA NP's de door curcumine geïnduceerde macrofaagfagocytose kunnen versterken door de M1-macrofaagpolarisatie te remmen door de TLR4-MAPK/NF-KB-signaalroute te blokkeren, waardoor de ontstekingsremmende en neuroprotectieve effecten van curcumine worden bevorderd.

Conclusie

Onze gegevens suggereerden dat curcumine zou kunnen worden gebruikt als een therapeutisch middel bij de behandeling van AD. Curcumine-geladen CS-BSA NP's veroorzaakten de RAW 264,7 cel-geïnduceerde fagocytose van Aβ 42 door de verbeterde BBB-penetratie van curcumine en hogere intracellulaire geneesmiddelconcentratie. Bovendien induceerden met curcumine beladen CS-BSA NP's ontstekingsremmende en neuroprotectieve effecten door de M1-macrofaagpolarisatie te remmen en de TLR4-MAPK / NF-KB-signaleringsroute te blokkeren. Alles bij elkaar hebben met curcumine geladen CS-BSA NP's hun potentieel aangetoond bij het verbeteren van de behandeling van AD.

Afkortingen

AD:

Ziekte van Alzheimer

BBB:

Bloed-hersenbarrière

BSA:

Bovine serum albumine

CS:

Chitosan

LPS:

Lipopolysacharide

NP's:

Nanodeeltjes

TLR's:

Tolachtige receptoren