Curcumine-geladen Chitosan-Bovine Serum Albumine Nanopartikelen Verbeteren Amyloïde-β42 Clearance en Moduleren Macrofage-polarisatie bij Alzheimer

Samenvatting

Alzheimerziekte (AZ) blijft de leidende neurodegeneratieve aandoening bij ouderen, doch effectieve therapieën worden beperkt door de bloed-hersenbarrière (BHB), slechte amyloïde-β (Aβ) clearance en chronische neuro-inflammatie. We ontwierpen chitosan (CS)–bovine serum albumine (BSA) nanopartikelen (NPs) om curcumine – een krachtig anti-inflammatoir en anti-amyloidogeen polyfenol – direct naar de hersenen te leveren. Curcumine-geladen CS-BSA NPs bereikten een 95,4% encapsulatie-efficiëntie, 143,5 nm gemiddelde diameter en een negatieve oppervlaktelading van –10,8 mV, wat stabiliteit en gunstige BHB-doorlaatbaarheid garandeert. In vitro BHB-modellen toonden 60,2% penetratie van NPs na 3 uur, aanzienlijk hoger dan vrije curcumine (29,8%). Celulair opname-onderzoek onthulde verhoogde intracellulaire curcumine-niveaus in RAW 264.7 macrofagen, wat op zijn beurt Aβ42-fagocytose verhoogde. Mechanistisch onderdrukten NPs de TLR4-MAPK/NF-κB-as, down-reguleerden pro-inflammatoire cytokines (TNF-α, IL-6) en verschoven macrofagen van een neurotoxische M1 naar een beschermende M2-fenotype. Deze bevindingen tonen aan dat curcumine-geladen CS-BSA NPs Aβ42-clearance potentialeren terwijl ze neuro-inflammatie moduleren, wat een veelbelovend nanomedicine-platform voor AZ-therapie biedt.

Inleiding

AZ wordt gekenmerkt door progressieve cognitieve achteruitgang en de kenmerkende depositie van extracellulaire Aβ42-fibrillen. Terwijl monomere Aβ42 fysiologisch onschadelijk is, zijn oligomere aggregaten hoogst neurotoxisch en drijven ziekteprogressie. Het aanpakken van Aβ42-aggregering en het bevorderen van de clearance zijn daarom centraal voor therapeutische strategieën. Microgliale cellen, de inheemse macrofagen van de hersenen, herkennen Aβ via toll-achtige receptoren (TLRs) en fagocyteren het peptide. Echter, chronische activering polariseert microglia naar een pro-inflammatoir M1-fenotype, wat neuronale schade verergeren. Het bevorderen van een verschuiving naar het anti-inflammatoire M2-fenotype heeft zich voorgedaan als een haalbare ziekte-modificerende aanpak.

Curcumine, afkomstig van kurkuma (Curcuma longa), vertoont anti-amyloidogene, anti-oxidatieve en metaal-chelerende eigenschappen. Het kan macrofaag-polarisatie moduleren door de TLR4-MAPK/NF-κB-signaleringscascade te remmen. Helaas beperken curcumines slechte oplosbaarheid, snelle metabolisering en beperkte BHB-doorlaatbaarheid de klinische bruikbaarheid.

Nanopartikel-dragers kunnen deze barrières overwinnen. CS is een kationisch, biocompatibel polysaccharied capabel van stabiele complexes te vormen met anionische eiwitten zoals BSA. BSA is rijk in plasma, niet-immunogeen en leent sustained-release-eigenschappen aan nanopartikelen. Door CS en BSA te combineren, fabriceren we curcumine-geladen NPs geoptimaliseerd voor BHB-doorkruising en gerichte levering aan microglia.

Materialen

CS (deacetylatie 80%, ~400 kDa) werd bezorgd door Haixin Biological Product Co., Ltd. BSA (Sigma-Aldrich), curcumine (Dalian Meilun Biotechnology) en FITC-gelabeld Aβ42 (Chinese Peptide Co.) werden commercieel aangeschaft. RAW 264.7 (muis monocytair-macrofage) en hCMEC/D3 (humane hersen microvasculaire endotheliale) cellijnen werden gekweekt in DMEM aangevuld met 10% fetaal kalverseerum en antibiotica. LPS (1 µg/ml) werd gebruikt om RAW 264.7 cellen te polariseren naar het M1-fenotype, wat microglia-activering in AZ nabootst.

Voorbereiding van Curcumine-geladen CS-BSA NPs

CS werd opgelost in 0,1% azijnzuur (0,5 mg/ml). Curcumine (0,05 mg/ml in 100 µl DMSO) werd gemengd in de CS-oplossing onder magnetische roering bij kamertemperatuur. Een BSA-oplossing (1,0 mg/ml) werd vervolgens druppelgewijs toegevoegd, wat een opalescente suspensie produceerde die condenseerde tot vaste nanopartikelen via elektrostatische interactie. Deeltjesgrootte, zeta-potentiaal en morfologie werden gekarakteriseerd door dynamische lichtverstrooiing en TEM. In vitro vrijgave werd geëvalueerd in fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 7,4) bij 37 °C, en encapsulatie-efficiëntie (EE) werd berekend als EE % = (W_totaal – W_vrij)/W_totaal × 100 % waarbij W_totaal de initiële curcumine-hoeveelheid is en W_vrij het supernataant.

Celdood Evaluatie via MTT

Lege CS-BSA NPs (0–2,0 mg/ml) werden geïncueerd met RAW 264.7 (M1) en hCMEC/D3 cellen gedurende 24 uur om cytotoxiciteit te beoordelen via MTT-assay.

Penetratiestudies met behulp van een In Vitro BHB-model

Een monolag van hCMEC/D3 cellen (TEER > 300 Ω) werd gekweekt op Transwell-inlagen. Vrije curcumine of curcumine-geladen CS-BSA NPs (equivalent curcumine 100 µg/ml) werden aan de bovenkamer toegevoegd. Na 3 uur incubatie bij 37 °C werd de fluorescentie-intensiteit van curcumine (excitatie 425 nm, emissie 530 nm) in de onderkamer gemeten. Relatieve fluorescentie-ratio (RFR %) kwantificeerde de penetratie-efficiëntie. Endocytose-remmers (chlorpromazine, genisteine, cytochalasine D, natriumazide) werden toegepast om transportmechanismen te verduidelijken.

De Cellulaire Opname van Curcumine-geladen CS-BSA NPs

Confocale laserscanning-microscopie (CLSM) beoordeelde de intracellulaire distributie van curcumine in RAW 264.7 (M1) cellen na blootstelling aan vrije curcumine of curcumine-geladen NPs via het Transwell-systeem. Groene fluorescentie van curcumine werd gemonitord op 6, 12 en 24 uur intervallen.

Detectie van de Fagocytose van Aβ42 Geïnduceerd door Vrije Curcumine en Curcumine-geladen CS-BSA NPs

RAW 264.7 (M1) cellen voorbehandeld met vrije curcumine of curcumine-geladen NPs werden geïncueerd met FITC-gelabeld Aβ42 gedurende 3 uur. Fagocytose werd gekwantificeerd door CLSM-fluorescentie en stroomcytometrie.

Western Blot Assay

Expressieniveaus van TNF-α, IL-6, TLR4 en fosforylatietoestanden van ERK, JNK, p38, IκBα en NF-κB werden onderzocht via Western blot om de impact van curcumine-geladen NPs op de TLR4-MAPK/NF-κB-as te verduidelijken.

Resultaten

Karakterisatie van Curcumine-geladen CS-BSA NPs

Dynamische lichtverstrooiing onthulde een gemiddelde diameter van 143,5 nm, zeta-potentiaal van –10,8 mV en polydispersiteitsindex van 0,021. TEM-beelden bevestigden sferische, monodisperse deeltjes (Figuur 1). Encapsulatie-efficiëntie bereikte 95,4%. Vrijgaveprofielen toonden een initiële burst van 11,3% binnen 3 uur, gevolgd door sustained release over 48 uur, wat effectieve bescherming van curcumine tijdens circulatie aangeeft.

Penetratie door een In Vitro BHB-model

Vrije curcumine penetratie was 12,3% (1 uur), 20,3% (2 uur) en 29,8% (3 uur). Curcumine-geladen NPs bereikten 37,7%, 45,6% en 60,2% penetratie op dezelfde tijdstippen, respectievelijk (Figuur 2). Endocytose-inhibitie-experimenten toonden aan dat NPs berusten op energie-afhankelijke, caveolae- en macropinocytose-gemedieerde paden, terwijl vrije curcumine voornamelijk via passieve diffusie binnenkwam.

Cytotoxiciteitsbeoordeling

MTT-assays bevestigden dat lege CS-BSA NPs non-cytotoxisch waren voor RAW 264.7 (M1) en hCMEC/D3 cellen bij concentraties tot 2,0 mg/ml (Figuur 3).

Cellulaire Opname

CLSM-beeldvorming toonde een tijds-afhankelijke accumulatie van curcumine binnen RAW 264.7 (M1) cellen. Curcumine-geladen NPs produceerden aanzienlijk hogere intracellulaire fluorescentie dan vrije curcumine, wat verbeterde levering aangeeft (Figuur 4).

Verbeterde Aβ42 Fagocytose

Co-lokalisatie van curcumine (rood) en FITC-Aβ42 (groen) toonde aan dat curcumine-geladen NPs de intracellulaire aanwezigheid van Aβ42 in RAW 264.7 (M1) cellen verhoogden, zoals bewijs door een hogere dichtheid van groene fluorescentie (Figuur 5). Dit suggereert dat verhoogde intracellulaire curcumine de macrofage-fagocytose-capaciteit versterkt.

Western Blot Analyse

Vergeleken met onbehandelde controles, vertoonden LPS-gepolariseerde RAW 264.7 (M1) cellen verhoogde TNF-α, IL-6 en TLR4-expressie, en verhoogde fosforylatie van ERK, JNK, p38 en NF-κB. Curcumine-geladen NPs verminderden deze pro-inflammatoire markers en signaleringsgebeurtenissen aanzienlijk, wat hun capaciteit om M1-polarisatie te remmen benadrukt (Figuur 6).

Discussie

Onze resultaten bevestigen dat CS-BSA nanopartikelen de curcumine-levering over de BHB aanzienlijk verbeteren, voornamelijk via caveolae- en macropinocytose-gemedieerde paden. De verbeterde hersendoorpenetratie vertaalt zich in hogere intracellulaire curcumine-concentraties, wat op zijn beurt microgliale Aβ42-fagocytose versterkt en de pathologische last van amyloïde plaques vermindert.

Het anti-inflammatoire effect van curcumine-geladen NPs is duidelijk door onderdrukking van de TLR4-MAPK/NF-κB-cascade en down-regulatie van TNF-α, IL-6 en TLR4. De cytokinemodulatie herpolariseert macrofagen van een neurotoxisch M1-fenotype naar een anti-inflammatoir M2-fenotype, een therapeutische strategie die steeds meer erkend wordt voor ziekte-modificatie in AZ.

Gecombineerd positioneren deze bevindingen curcumine-geladen CS-BSA NPs als een veelzijdig nanomedicine-platform dat simultaan medicijnlevering, amyloïde-clearance en neuro-inflammatie aanpakt – cruciale obstakels in AZ-behandeling.

Conclusie

Curcumine-geladen CS-BSA nanopartikelen penetreren effectief de BHB, verhogen intracellulaire curcumine-accumulatie en bevorderen Aβ42-fagocytose door microglia. Ze verlichten ook neuro-inflammatie door de TLR4-MAPK/NF-κB-weg te remmen en M2-macrofage-polarisatie te bevorderen. Deze kenmerken onderstrepen collectief de therapeutische belofte van dit nanoplatform voor Alzheimerziekte.

Afkortingen

AZ

Alzheimerziekte

BHB

Bloed-hersenbarrière

BSA

Bovine serum albumine

CS

Chitosan

LPS

Lipopolysaccharide

NPs

Nanopartikelen

TLRs

Toll-achtige receptoren