Ultra-gevoelige Colorimetrische TB-detectie met ESAT-6 Antigeen-Antilichaam Complexen en Goudnanopartikelen

Samenvatting

Tuberculose (TB) blijft een leidende doodsoorzaak wereldwijd, gedreven door de virulente factor ESAT-6, een vroeg secretorisch antigenisch doelwit van Mycobacterium tuberculosis. Snelle, lage-concentratie detectie van ESAT-6 is essentieel voor vroege interventie en ziektebeheersing. We presenteren een eéntraps, antilichaam-gebaseerde colorimetrische assay die 15 nm goudnanopartikelen (GNPs) en een zout-geïnduceerd aggregatiemechanisme gebruikt om een detectielimiet van 1,25 pM te bereiken. De methode benut de rode spectrale verschuiving van gedispergeerde GNPs wanneer het ESAT-6/antilichaam-complex aanwezig is, terwijl stabiliteit behouden blijft in de aanwezigheid van non-specifieke eiwitten zoals 10-kDa cultuurfiltratie-eiwit (CFP-10). De optimale antilichaamconcentratie werd bepaald op 60 nM; overschrijding van deze drempel veroorzaakte een 680-voudig gevoeligheidsverlies door sterische overbevolking. Deze assay toont hoge specificiteit, minimale bioverontreiniging en biedt een snelle, visuele uitlezing geschikt voor point-of-care diagnostiek van TB.

Achtergrond

TB wordt veroorzaakt door Mycobacterium tuberculosis en vormt een ernstige bedreiging voor de wereldwijde gezondheid. Vroege, latente infectie kan voortschrijden tot actieve ziekte zodra de gastheereimmuniteit afneemt, wat de noodzaak benadrukt voor gevoelige, snelle diagnostiek in het latente stadium. Conventionele testen – huidtuberculine, interferón-γ vrijstellingassays, thoraxfoto, sputumcytologie en kweek – zijn arbeidsintensief, duur en vaak vertraagd met maanden. Dus is een eenvoudige, betaalbare en snelle detectiestrategie dringend vereist.

Goudnanopartikel (GNP)-gebaseerde colorimetrische sensoren zijn uitgegroeid tot krachtige hulpmiddelen voor ziekte-diagnostiek vanwege hun sterke oppervlakteplasmonresonantie en afstelbare optische eigenschappen. Monodisperse 15 nm GNPs vertonen een kenmerkende rode kleur die naar blauw verschuift bij aggregatie getriggerd door tweeaardige ionen, zoals NaCl. Deze kleurverandering, gedreven door een rode spectrale verschuiving, vormt de basis van veel snelle detectie-assays voor virussen, bacteriën en kleine moleculen. Echter, de prestaties van DNA of aptamer-gebaseerde GNP-assays kunnen beperkt zijn door elektrostatische interacties en probe-doelwit-onverenigbaarheden, met name bij langere nucleïnezuursequenties.

Om deze uitdagingen te overwinnen, ontwikkelden we een eéntraps antilichaam-gebaseerde colorimetrische assay die het 6 kDa ESAT-6-eiwit als doelwit stelt. Door ESAT-6 vooraf te complexeren met zijn specifieke polyclonale antilichaam voor blootstelling aan GNPs, voorkomen we non-specifieke binding en maken we een hooggevoelig, visueel detectieplatform mogelijk. Figuur 1 illustreert de assay-werkstroom en de specificiteitscontroles met CFP-10.

Methoden

Reagentia en Biomoleculen

ESAT-6 en 10-kDa CFP-10 werden gekocht bij Sino Biological Inc. (Beijing, China). Anti-ESAT-6 polyclonale antilichaam werd verkregen van Santa Cruz Biotechnology (VS). 15 nm citraat-gekapte GNPs werden bezorgd door Sigma Aldrich (VS). Alle reagentia werden zonder verdere zuivering gebruikt.

Optimalisatie van Tweeaardige Ionen voor GNP-aggregatie

Om de optimale NaCl-concentratie voor het induceren van GNP-aggregatie te identificeren, werd een bereik van NaCl (50–800 mM) toegevoegd aan een vast volume GNPs (1 O.D.). Na 15 min werd de kleurverandering vastgelegd en het absorptiespectrum (400–800 nm) gemeten met een nanofotometer.

Beoordeling van ESAT-6 Bioverontreiniging op GNP-oppervlak

Om non-specifieke adsorptie van ESAT-6 op GNPs te evalueren, werden variërende concentraties (1,5–100 nM) geïncueerd met GNPs gevolgd toevoeging van optimale NaCl. Colorimetrische en spectrale veranderingen werden waargenomen. CFP-10 werd gebruikt om specificiteit te bevestigen.

Optimalisatie van Anti-ESAT-6 Antilichaamconcentratie op GNP-oppervlak

Anti-ESAT-6 antilichaamconcentraties (30–500 nM) werden gemengd met GNPs, 30 min geïncueerd en uitgedaagd met toenemende NaCl om het antilichaamniveau te identificeren dat maximale dispersiestabiliteit garandeert.

Detectie van ESAT-6 via Antilichaam-gebaseerde Colorimetrische Rode Spectrale Verschuiving

1 µL van 1 µM ESAT-6 (eind 500 nM) werd gemengd met 1 µL van de geoptimaliseerde antilichaamconcentratie. Na 30 min werden 20 µL GNPs toegevoegd en nogmaals 30 min geïncueerd. NaCl werd vervolgens toegevoegd tot een eindconcentratie van 800 mM, en het absorptiespectrum (400–800 nm) werd opgenomen. Een seriële verdunning van ESAT-6 (0–500 nM) werd gebruikt om de detectielimite te bepalen, spannend van picomolaire tot nanomolaire ranges.

Resultaten en Discussie

De assay benut de rode spectrale verschuiving die optreedt wanneer GNPs aggregeren in de aanwezigheid van het ESAT-6/antilichaam-complex. In afwezigheid van ESAT-6 bedekt het antilichaam het GNP-oppervlak, behoudend de rode kleur zelfs na NaCl-toevoeging, terwijl de aanwezigheid van ESAT-6 aggregatie en een blauwe verschuiving triggert.

NaCl Optimalisatie

GNPs bleven rood bij NaCl-concentraties onder 100 mM, maar begonnen te aggregeren bij 100 mM, producerend een rode spectrale verschuiving gecentreerd rond ~600 nm. Voor maximale gevoeligheid werd 800 mM NaCl geselecteerd om complete aggregatie in afwezigheid van antilichaambedekking te garanderen.

Antilichaamconcentratie Optimalisatie

Bij 30 nM antilichaam aggregateerden GNPs nog steeds zelfs met 800 mM NaCl, wat onvoldoende oppervlaktebedekking aangeeft. Vanaf 60 nM behielden de GNPs een rode kleur onder dezelfde zoutuitdaging, wat effectieve dispersie aantoont. Concentraties boven 60 nM booden geen additioneel voordeel en riskeerden antilichaam-overbevolking.

ESAT-6 Detectie en Bioverontreiniging Validatie

ESAT-6 (tot 100 nM) bond niet aan GNPs, wat false positief/negatief voorkwam. Wanneer pre-gecomplexeerd met 60 nM antilichaam, toonde de assay een duidelijke kleurshift van rood naar blauw bij maar 0,5 nM ESAT-6, met volledige verzadiging waargenomen tussen 15–500 nM. Spectra bevestigden een rode verschuiving richting 600 nm bij concentraties boven 1,25 pM.

Detectielimiet

Door ESAT-6 te titreren van 1,25 pM tot 5 nM, behield de assay een duidelijke blauwe kleurverandering en een spectrale verschuiving naar ~600 nm. De detectielimiet (LOD) werd vastgesteld op 1,25 pM, wat veel bestaande colorimetrische TB-diagnostieken overtreft.

Specificiteitsbevestiging

Met 75 nM antilichaam steeg de LOD naar de nanomolaire range, wat de cruciale rol van antilichaamconcentratie bevestigt. CFP-10, ondanks het een TB-antigeen is, triggreerde geen aggregatie, wat de assay-specificiteit valideert.

Conclusies

Deze studie demonstreert een snelle, eéntraps, goudnanopartikel-gebaseerde colorimetrische assay die een detectielimiet van 1,25 pM bereikt voor het TB-antigeen ESAT-6. De hoge specificiteit van de methode, bevestigd door CFP-10-controles, en de betrouwbaarheid op pre-gecomplexeerde antilichaam/antigeen verminderen bioverontreiniging en verhogen gevoeligheid. De eenvoud van de assay, visuele uitlezing en minimale apparatuurvereisten maken het een sterke kandidaat voor point-of-care TB-screening, met name in resource-beperkte omstandigheden. Toekomstig werk zal de uitbreiding van dit platform naar andere kleine-eiwit-biomarkers en integratie in draagbare diagnostische apparaten verkennen.

Afkortingen

CFP-10:

10 kDa cultuurfiltratie-eiwit

DNA:

Desoxyribonucleïnezuur

ESAT-6:

6 kDa vroeg secretorisch antigenisch doelwit

GNP:

Goudnanopartikel

NaCl:

Natriumchloride

O.D.:

Eén optische dichtheid (eenheid van GNP-concentratie)

RNA:

Ribonucleïnezuur

TB:

Tuberculose

UV:

Ultraviolet