Fosfine-vrije synthese van reabsorptie-onderdrukte ZnSe/CdS/ZnS kern-schelp kwantumdots en hun toepassing in gevoelige CRP-detectie

Samenvatting

We beschrijven een fosfine-vrije, single-pot protocol voor het maken van ZnSe/CdS/ZnS kern-schelp kwantumdots (QDs) die type-II en type-I band-uitlijning combineren om reabsorptie te onderdrukken. De resulterende rood-emitterende QDs bereiken een indrukwekkende 82% fotoluminescentie kwantumrendement (QY) en uitzonderlijke optische stabiliteit. Vergeleken met conventionele type-I QDs, vertonen de composiet-QDs een aanzienlijk grotere Stokes-verschuiving en verminderde reabsorptie, wat vertaalt in hogere fluorescentie-uitvoer. Door deze eigenschappen te benutten, zetten we de QDs in als fluorescente labels in een fluoresentie-gekoppelde immuno-adsorptie-assay (FLISA) voor C-reactief proteïne (CRP). De assay bereikte een detectielimiet (LOD) van 0,85 ng mL⁻¹ — 15% gevoeliger dan een CdSe/ZnS-gebaseerde FLISA (1,00 ng mL⁻¹). Deze bevindingen tonen aan dat ZnSe/CdS/ZnS type-II/type-I QDs sterke kandidaten zijn voor biomedische diagnostiek en fotonische toepassingen.

Achtergrond

Halfgeleider kern/schil QDs bezitten superieure optische eigenschappen — brede emissie-bereiken, hoge kwantumrendementen (QYs), en robuuste chemische stabiliteit — wat ze ideale fluorescente labels maakt voor diagnostiek, imaging, en opto-elektronica [1-7]. Hun elektronische structuur valt in drie categorieën gebaseerd op band-uitlijning: type-I, reverse type-I, en type-II. Type-I QDs sluiten zowel elektronen als gaten binnen de kern in, wat radiatieve recombinatie versterkt en de actieve kern isoleert van oppervlaktedefecten [6-9]. Echter, de kleine Stokes-verschuiving (≈10 nm) gemeenschappelijk aan type-I QDs veroorzaakt significante reabsorptie, wat emissie-intensiteit vermindert en kwantitatieve assays beperkt [10,11]. Type-II QDs scheiden elektronen en gaten over kern en schil, wat een rood-verschuivende emissie en een afgeplatte eerste-exciton absorptie-piek produceert. Dit verlaagt spectraal overlap, onderdrukt reabsorptie, en verbetert kwantitatieve detectie [12-13]. ZnSe/CdS type-II QDs spannen van blauwachtig-violet tot rood emissie met onderdrukte reabsorptie [13], maar hun Cd-rijke schillen kunnen lijden onder oppervlakte-val-geïnduceerde quenching en biotoxiciteit. Coating met een ZnS-outerschil passiveert het oppervlak, verbetert QY, en beperkt Cd-leaching [14-15]. Eerdere synthesen van ZnSe/CdS/ZnS QDs vereisten toxische fosfinen en multi-staps zuivering, zonder gerapporteerde biologische toepassingen.

Hier introduceren we een fosfine-vrije, one-pot route om hoogwaardige rood-emitterende ZnSe/CdS/ZnS QDs te produceren die reabsorptie onderdrukken. De methode gebruikt een lage-toxiciteit Se-precursor (ODE-Se) en zink-oleaat om ZnSe-kernen te vormen, gevolgd door in-situ groei van CdS en ZnS-schellen zonder intermediaire zuivering — wat schaalbare productie vergemakkelijkt. De QDs bereiken 82% QY met verminderde Cd-inhoud, en hun grote Stokes-verschuiving plus afgeplatte absorptieprofiel leveren lage reabsorptie. Ten slotte demonstreren we hun eerste gebruik als fluorescente probes in een FLISA voor CRP, met een LOD van 0,85 ng mL⁻¹ — een CdSe/ZnS referentie-assay overtreffend.

Methoden

Chemicaliën

Alle reagentia werden gebruikt zoals ontvangen: CdO (99,99%), ZnO (99,9%), Se (99,9%), 1-octadecen (ODE, 90%), 1-octanethiol (OT, 98%), oleïnezuur (OA, 90%), PMAO, MES, en standaard laboratoriumsoplosmiddelen (paraffine-olie, aceton, hexanen, methanol). Buffercomponenten (NaOH, HCl, Na₂CO₃, NaHCO₃, KH₂PO₄, Na₂HPO₄, H₃BO₃, Na₂B₄O₇·10H₂O, Tween-20) werden bezorgd van Shanghai Sangon Co., Ltd. BSA en kalverseum waren van Sigma. EDC, sulfo-NHS, en microplaten waren van Thermo Fisher Scientific. Muis anti-CRP monoclonaal antilichaam en CRP-antigeen werden verkregen van Abcam. Alle chemicaliën werden zonder verdere zuivering gebruikt.

Se-precursor (0,1 M)

Se (6 mmol) werd opgelost in 60 mL ODE en verhit tot 220 °C gedurende 180 min onder stikstof, wat een helder gele oplossing opleverde.

Zn en Cd precursors

ZnO (30 mmol) werd gecombineerd met 30 mL OA en 45 mL ODE, daarna verhit tot 310 °C onder stikstof om een heldere oplossing te vormen; het mengsel afgekoeld tot 140 °C voor injectie. De Cd-precursor werd identiek bereid, maar bij 240 °C en een 0,2 M concentratie.

Synthese van ZnSe/CdS/ZnS Type-II/Type-I QDs

Een typische run begon met verwarmen van 4 mL Se-precursor en 15 mL ODE tot 310 °C. Bij deze temperatuur werd 2 mL Zn-precursor snel geïnjecteerd. Aliquoten werden op intervallen genomen om PL-verschuivingen gelinkt aan deeltjesgroei te monitoren. Zodra de kern de gewenste grootte bereikte, werd de temperatuur verlaagd tot 230 °C voor CdS-schelpgroei. Cd-precursor en OT (OT: kation = 1:1,2) werden vervolgens druppelgewijs toegevoegd bij 3 mL h⁻¹ terwijl de temperatuur verhoogd werd tot 310 °C. De ZnS-schelp werd op dezelfde manier gegroeid. QDs werden gezuiverd door aceton-precipitatie en hergedispergeerd in chlorofoorm.

CdSe/ZnS Type-I QDs

Deze QDs werden gesynthetiseerd volgens gevestigde protocollen [7] en vervolgens gebruikt voor fasetransfer en FLISA-bereiding identiek aan de ZnSe/CdS/ZnS procedure.

Fasetransfer naar water

Polymaleïne-anhydride-octadecen (PMAO) amfifiele oligomeer werd gebruikt om de hydrofobe QDs water-oplosbaar te maken. QDs en PMAO werden opgelost in chlorofoorm (QD/PMAO = 1:7) met sonicatie, daarna werd chlorofoorm verdampt bij 45 °C. Een gelijk volume van 0,1 M NaHCO₃ (pH 8,5) werd toegevoegd om het complex op te lossen. De resulterende QDs-PMAO behield volledige fluorescentie en vertoonde uitstekende aqueuze stabiliteit over een breed pH-bereik.

QDs-Antilichaam conjugatie

QDs-PMAO werden geactiveerd met EDC/sulfo-NHS om carboxylgroepen te koppelen aan monoclonaal CRP-antilichamen. Na incubatie in PBS en BSA-blokkering, werden de conjugaten gewassen door centrifugatie en opgeslagen in 50 µL BS-buffer (5 mM, pH 8,0).

Antilichaam-gecoate microplaat bereiding

Microplaatputjes werden gecoat met 1,8 mg mL⁻¹ CRP monoclonaal antilichaam in 50 mM carbonaat-bicarbonaat buffer (pH 9,6), geïncubeerd bij 4 °C gedurende 24 u, driemaal gewassen met 0,05% Tween-20 in 10 mM PBS, en geblokkeerd met 0,5% BSA in PBS (pH 7,4) overnacht. Platen werden gedroogd en opgeslagen bij 4 °C.

CRP-kwantificatie via FLISA

In elk putje werd 100 µL standaard CRP of monster (gedilueerd in buffer) toegevoegd aan de antilichaam-gecoate plaat, geïncubeerd bij 37 °C gedurende 30 min, en vijfmaal gewassen. Vervolgens werd 100 µL QDs-mAb probe (gedilueerd in 10% kalverseum/PBS) toegevoegd, geïncubeerd, en gewassen zoals eerder.

Karakterisatie

UV-vis absorptie en PL-spectra werden opgenomen met een Ocean Optics PC2000-ISA spectrophotometer. QY's werden gemeten ten opzichte van Rhodamine 101 (QY = 100%) in ethanol. TEM-beeldvorming gebruikte een JEOL JEM-2010 bij 200 kV. Faseanalyse gebruikte een D8-ADVANCE XRD met Cu-Kα straling (λ = 1,54 Å). Hydrodynamische diameters werden bepaald door dynamische lichtverstrooiing (Nano-ZS 90, Malvern).

Resultaten en Discussie

De evolutie van UV-vis en PL-spectra tijdens schelpgroei is geïllustreerd in Figuur 1. De kaale ZnSe-kern toont een 420 nm absorptie en 428 nm emissie (FWHM = 17 nm). Het toevoegen van een enkele CdS-monolaag vergroot de Stokes-verschuiving tot 54 nm, met absorptie bij 497 nm en emissie bij 551 nm (FWHM = 38 nm). Opvolgende CdS-schelpgroei verschuift de PL verder naar rood tot 629 nm en verbreedt de FWHM tot 52 nm, wat verhoogde exciton-fonon koppeling weerspiegelt. De afgeplatte eerste-exciton absorptiepiek en sterke korte-golflengte absorptie (<500 nm) verminderen samen spectraal overlap, effectief reabsorptie onderdrukkend. De ZnS-schelp verschuift de emissie daarna links en vernauwt de FWHM tot 43 nm, terwijl de QY stijgt van 20% tot 82% over de CdS/ZnS-groeisequentie.

Figuur 2 bevestigt de structurele evolutie: XRD-pieken verscherpen en verschuiven naar wurtziet CdS en ZnS posities, wat succesvolle multi-schelpgroei en een zinc-blende naar wurtziet overgang aangeeft. TEM-afbeeldingen (Fig. 2a-f) onthulven monodisperse spherische QDs die uitdijen van 3,90 nm (kern) tot 11,92 nm (volledige kern/schil). HRTEM roosterafstanden (0,32 nm voor ZnSe, 0,35 nm voor CdS, 0,31 nm voor ZnS) komen overeen met XRD-data, wat compositionele rechtmatigheid bevestigt.

EDS-analyse (Tabel S1) toont aan dat Cd/(Zn+Cd) verhoudingen stijgen tijdens CdS-schelpgroei door kationuitwisseling bij >200 °C, doch de algehele Cd-inhoud blijft laag (~13%) vergeleken met typische type-I CdSe/CdS/ZnS QDs (~40%). Deze verminderde Cd-lading vermindert biotoxiciteit.

Fasetransfer naar aqueuze media via PMAO (Fig. S1) behoudt PL-intensiteit en morfologie, bevestigd door UV-vis, PL, TEM, en FTIR-spectra. De FTIR-spectra tonen succesvolle anhydride-ringopening en COOH-vorming op het QD-oppervlak.

Stabiliteitstesten (Fig. 3) tonen aan dat de hydrofobe QDs 85% van PL behouden na herhaalde zuivering, en de PMAO-gecapculeerde QDs behouden >85% PL na 400 u in PBS, over pH 1–13, en tot 90 °C (resterend 76% PL). Deze resultaten bevestigen geschiktheid voor biologische assays.

Conjugatie met CRP-antilichamen (Fig. 4a) verlaagt PL-intensiteit met ~40% door scheiding-verliezen maar behoudt spectrale vorm. DLS toont een toename van hydrodynamische diameter van 46 nm (QDs-PMAO) tot 120 nm (QDs-mAb), wat succesvolle conjugatie zonder aggregatie bevestigt.

Het gebruik van de QDs-mAb in FLISA (Fig. 5a) levert een duidelijke, kwadratische dosis-respons (R² = 0,9991) over 0–400 ng mL⁻¹. De LOD van 0,85 ng mL⁻¹ overtreft de CdSe/ZnS referentie met 15%. Herstel-experimenten (Tabel 1) tonen 83,6–105,9% nauwkeurigheid over lage, medium, en hoge CRP-concentraties, wat de assay-betrouwbaarheid onderstreept.

Conclusies

We hebben een fosfine-vrije, schaalbare synthese ontwikkeld van reabsorptie-onderdrukte ZnSe/CdS/ZnS kern/schil QDs die type-II en type-I bandstructuren combineren. De QDs leveren hoge QY (82%), grote Stokes-verschuiving, en uitstekende stabiliteit, wat een hooggevoelige FLISA voor CRP-detectie mogelijk maakt (LOD = 0,85 ng mL⁻¹). Deze eigenschappen positioneren ZnSe/CdS/ZnS QDs als veelbelovende tools voor biomedische diagnostiek en opto-elektronische apparaten.

Afkortingen

BSA

Bovine serum albumine

CRP

C-reactief proteïne

DLS

Dynamische lichtverstrooiing

EDC

1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)propyl)carbodiimide

EDS

Energie-dispersieve Röntgen-spectroscopie

ELISA

Enzyme-gekoppelde immuno-adsorptie-assay

FLISA

Fluorescentie-gekoppelde immuno-adsorptie-assay

FWHM

Volle breedte op halve maximum

LOD

Detectielimiet

MES

2-(N-morpholino)ethaanzuulfzuur

OT

1-octanethiol

PMAO

Poly(maleïne-anhydride-alt-1-octadecen)

QDs

Kwantumdots

QYs

Kwantumrendementen

sulfo-NHS

N-hydroxysulfosuccinimide