Groen gesynthetiseerde cerium-gedopte koolstofnanodeeltjes leveren superieure hydroxylradicaal-opslag voor antioxidatieve therapie

Samenvatting

Recente vooruitgang in de nanomedicine heeft ceriumoxide-nanodeeltjes benadrukt als krachtige antioxidanten. Hier presenteren we een eenvoudige, milieuvriendelijke methode die rundserumalbumine (BSA) gebruikt om cerium-gedopte koolstofachtige nanodeeltjes (Ce-gedopte CNPs) te biomineraliseren. De resulterende deeltjes zijn monodispers, met een gemiddelde diameter van 14,7 nm, en vertonen overvloedige hydrofiele oppervlaktegroepen die langdurige dispersie in aqueous media garanderen. In vitro cytotoxiciteitsstudies (CCK-8) bevestigen verwaarloosbare celtoxiciteit over een breed dosisbereik. Bij blootstelling aan waterstofperoxide-geïnduceerde reactieve zuurstofsoorten (ROS) vertonen Ce-gedopte CNPs uitzonderlijke hydroxylradicaal-opslag, wat vaatsootspiercellen en 7721-tumorcellen beschermt tegen oxidatieve schade op dosis-afhankelijke wijze. Deze bevindingen vestigen Ce-gedopte CNPs als veelbelovende, lage-toxiciteit ROS-opslaggers voor de behandeling van oxidatieve-stress-gerelateerde ziekten.

Achtergrond

Oxidatieve stress, gedefinieerd als een onbalans tussen de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS) en antioxidatieve verdediging, ligt aan de basis van veel chronische ziekten, waaronder atheroscletose, kanker en neurodegeneratie. Het hoogst reactieve hydroxylradicaal (•OH) is met name schadelijk, het initieert lipidperoxidatie, proteïnemodificatie en DNA-strandbreuken die leiden tot celdood en weefselschade. Therapeutische strategieën die ROS-niveaus verlagen, met name •OH, zijn daarom van groot klinisch belang.

Ceriumoxide-nanodeeltjes (CeO₂ NPs) zijn opgedoken als krachtige nano-enzymen dankzij de reversibele Ce³⁺/Ce⁴⁺ redoxcyclus. Hierdoor kunnen ze superoxidedismutase (SOD) en katalase (CAT) activiteiten nabootsen, waarbij ze respectievelijk •O₂⁻ en H₂O₂ opslokken. Toch vereisen conventionele CeO₂ NPs vaak oppervlaktecoatings (bijv. PVP) om aqueuze stabiliteit en biocompatibiliteit te bereiken, wat hun intrinsieke eigenschappen kan veranderen. Onze studie omzeilt deze beperking door cerium-ionen in te sluiten in een koolstofachtig framework afgeleid van BSA, wat leidt tot Ce-gedopte CNPs met intrinsieke hydrofiliciteit en robuuste antioxidatieve prestaties.

Experimentele sectie

Materialen en reagentia

Rundserumalbumine (BSA), fluoresceïne diacetaat (FDA) en propidiumiodide (PI) werden verkregen van Sigma (New York, NY, VS). Fetale boviene serum (FBS) en Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) kwamen van Invitrogen China Limited (Shanghai). Ceriumnitraat hexahydraat (Ce(NO₃)₃·6H₂O), methylvioolt (MV), ijzer(II)sulfaat heptahydraat (FeSO₄·7H₂O) en 30% H₂O₂ werden gekocht bij Aladdin Reagent Corporation (Shanghai) en Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Peking). Alle chemicaliën waren analytische graad en werden zonder verdere zuivering gebruikt; gedemineraliseerd water werd doorheen gebruikt.

Synthese van cerium-gedopte koolstofachtige nanodeeltjes

De Ce-gedopte CNPs werden bereid via een biomineralisatieroute aangepast van de BSA-getemplaatte synthese gerapporteerd door Wang et al. Kort gezegd: 1,25 g BSA werd opgelost in 50 ml gedemineraliseerd water onder continue roeren om een heldere oplossing te vormen. Een 300 mM Ce(NO₃)₃·6H₂O oplossing werd daarna druppelgewijs toegevoegd onder vigorese roering. Tegelijkertijd werd 2,0 M NaOH langzaam geïntroduceerd om de pH te verhogen tot 12. Het mengsel werd 8 uur gerold bij 55 °C, wat een bruine suspensie opleverde die afkoelde tot kamertemperatuur. Het product werd gefiltreerd door een 0,22-µm PES-membraan om grote aggregaten te verwijderen, gedialyseerd tegen water (14 kDa MWCO) gedurende 3 dagen, en bevroren gedroogd onder vacuüm. Het resulterende poeder werd opgeborgen voor verdere karakterisatie.

Karakterisatietechnieken

Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM, JEOL JEM-2100) leverde morfologische data bij 200 kV. Deeltjesgrootteverdelingen werden berekend met ImageJ (NIH). Fourier-transformatie infraroodspectroscopie (FT-IR, Nicolet Nexus 470) en röntgenfoto-elektronspectroscopie (XPS, PHI 5000) identificeerden oppervlaktefunctionele groepen en oxidatietoestanden. Röntgendiffractie (XRD, Rigaku D/MAX-2000) bevestigde kristallijne fasen. UV-Vis absorptiespectra (Shimadzu UV-2550) werden opgenomen voor oplossingsstudies.

UV-Vis fotometrische assay van radicaalopslag

Ce-gedopte CNPs (10 µM) werden gedispergeerd in 0,1 M Tris-HCl (pH 5,0) en gesonicateerd om de oplosbaarheid te verbeteren. Een reactiemengsel met 3,0 × 10⁻⁵ M MV, 0,15 mM FeSO₄·7H₂O, 1,0 M H₂O₂ en de Ce-gedopte CNP-suspensie (0,17 mM) werd bereid in een volume van 10 ml. Na 5 minuten bij kamertemperatuur werd de absorbantie bij 582 nm gemeten om de MV-herstel te kwantificeren, wat de hydroxylradicaal-opslag weerspiegelt.

Celviabiliteit (CCK-8) assay

VSMC en 7721 cellen (1,5 × 10⁴ cellen/put) wurden gezaaid in 96-putplaten en gekweekt tot ~80% confluentie. Na 24 uur werden de media vervangen door DMEM met 0–400 µg/ml Ce-gedopte CNPs, en de cellen werden 24 uur geïncubeerd. CCK-8 reagent (10 µl/put) werd toegevoegd en 4 uur geïncubeerd. De absorbantie bij 490 nm werd uitgelezen op een Synergy HT microplaatlezer; viabiliteit werd uitgedrukt als % van onbehandelde controle.

Waterstofperoxide-geïnduceerd oxidatief stressmodel

Om oxidatieve schade te modelleren, werden VSMC en 7721 cellen blootgesteld aan 30% H₂O₂ in concentraties variërend van 50 µmol ml⁻¹ tot 800 µmol ml⁻¹ gedurende 4 uur. Na behandeling werd de celviabiliteit beoordeeld via CCK-8 zoals hierboven beschreven, wat de bepaling van de LD₅₀ van H₂O₂ (≈560 µM) mogelijk maakte.

Apoptose en live-dead assays

Cellen voorbehandeld met Ce-gedopte CNPs (0–400 µg/ml) werden vervolgens geuitgedaagd met 560 µM H₂O₂ gedurende 4 uur. Live-dead kleuring (Calceïne-AM/PI) werd uitgevoerd op 7721 cellen gekweekt in 6-putplaten, en fluorescentiebeelden werden vastgelegd onder een confocalemicroskoop.

Stroomcytometrieanalyse van apoptose

Na H₂O₂-blootstelling werden 7721 cellen geoogst, gewassen en gekleurd met Annexine V-FITC en PI. Monsters werden geanalyseerd op een Beckman Coulter Epics XL MCL cytometer; percentages vroege (Annexine V⁺/PI⁻) en late (Annexine V⁺/PI⁺) apoptotische cellen werden berekend met FlowJo 7.6.2.

Statistische analyse

Data vertegenwoordigen gemiddelde ± SEM. Eenrichtingsvariatieanalyse (ANOVA) gevolgd door Tukey's post-hoc toets werd toegepast; p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Resultaten en discussie

Nanodeeltjessynthese en morfologie

De biomineralisatiestrategie leverde zeer monodisperse Ce-gedopte CNPs op, zoals getoond door TEM (Figuur 1a). De deeltjes vertoonden een polygonale, niet-geaggregeerde morfologie met een gemiddelde diameter van 14,7 ± 0,8 nm (Figuur 1b). De aqueous dispersie bleef enkele dagen helder, wat wijst op uitstekende colloïdale stabiliteit – een belangrijk voordeel voor biomedische toelevering.

Oppervlaktechemie en oxidatietoestand

XPS-analyse bevestigde de coëxistentie van Ce³⁺ (≈15,99%) en Ce⁴⁺, wat de redox-actieve aard van de deeltjes ondersteunt (Figuur 2b). Het C 1s-spectrum (Figuur 2c) toonde pieken bij 285,0, 287,8 en 288,9 eV, overeenkomend met C–C, C=O en C–O groepen, terwijl het O 1s-spectrum (Figuur 2d) pieken vertoonde bij 530,5 en 531,8 eV, indicatief voor Ce–O bindingen en oppervlaktehydroxyles. FT-IR-spectra (Figuur 3A) vertoonden een brede O–H rekving bij 3400 cm⁻¹ en nitraat-gerelateerde pieken bij 1510 en 1450 cm⁻¹, wat de aanwezigheid van hydrofiele functionele groepen en succesvolle incorporatie van cerium-ionen bevestigt.

XRD-patronen (Figuur 3B) onthulden karakteristieke pieken van een hybride koolstof-cerium rooster, met koolstof-gerelateerde pieken bij 24,4° en ceria-reflecties bij 30,3°, 35,23° en 43,2°, wat de succesvolle integratie van Ce in het koolstofframework bevestigt.

In vitro cytotoxiciteit

CCK-8 assays toonden aan dat Ce-gedopte CNPs de celviabiliteit niet aantasten bij concentraties tot 400 µg/ml (Figuur 4a). Zelfs bij de hoogste dosis bleef de viabiliteit boven de 90%, wat de uitstekende biocompatibiliteit van de deeltjes onderstreept.

Antioxidatieve efficiëntie

Waterstofperoxide bij 560 µM werd geïdentificeerd als de LD₅₀ voor zowel VSMC als 7721 cellen. Voorbehandeling met Ce-gedopte CNPs verbeterde de overleving significant op dosis-afhankelijke wijze, met 400 µg/ml die de viabiliteit herstelde tot ~88% (Figuur 4c). Live-dead kleuring (Figuur 5) toonde een duidelijke vermindering van rode (PI-positieve) cellen met toenemende Ce-gedopte CNPs, wat bescherming tegen oxidatieve apoptose bevestigt. Stroomcytometrie (Figuur 6) kwantificeerde apoptose: H₂O₂ alleen induceerde 46,4% late apoptose, wat daalde tot 24,2, 20,0, 15,1 en 11,2% met 50, 100, 200 en 400 µg/ml Ce-gedopte CNPs, respectievelijk.

Conclusies

We hebben een groene, één-stapsynthese ontwikkeld van cerium-gedopte koolstofachtige nanodeeltjes die hoogst dispergeerbaar, biocompatibel zijn en krachtige hydroxylradicaal-opslag vertonen. De deeltjes behouden intrinsieke Ce³⁺/Ce⁴⁺ redoxcycli, waardoor ze SOD- en CAT-activiteiten nabootsen en vaat- en tumorcellen beschermen tegen H₂O₂-geïnduceerde oxidatieve schade. Hun dosis-afhankelijke antioxidatieve efficiëntie en minimale cytotoxiciteit positioneren Ce-gedopte CNPs als aantrekkelijke kandidaten voor de preventie en behandeling van oxidatieve-stress-gerelateerde pathologieën.