GoldMag: PSS-MA coating verbetert stabiliteit & optische precisie voor proteïne detectie

Samenvatting

Gouden magnetische nanopartikelen (GoldMag) hebben grote aandacht getrokken vanwege hun unieke fysieke en chemische prestaties die die van individuele Fe₃O₄ en Au nanopartikelen combineren. Het coatingen van GoldMag met polymeren verhoogt niet alleen de stabiliteit van de composietdeeltjes in buffer, maar speelt ook een sleutelrol bij het vestigen van point-of-care optische tests voor klinisch relevante biomoleculen. In dit artikel werd poly(4-styreensulfonzuur-co-maleïnezuur) (PSS-MA), een negatief geladen polyelectrolyt met zowel sulfonaat- als carboxylaat-anionische groepen, gebruikt om het positief geladen GoldMag (30 nm) oppervlak te coaten. Het PSS-MA-gecoate GoldMag-complex heeft een stabiele plasmon-resonantie-adsorptiepiek bij 544 nm. Een paar anti-D-dimer antilichamen is gekoppeld aan dit GoldMag-composiet nanopartikeeloppervlak, en een doeleiwit, D-dimer, werd gedetecteerd in het bereik van 0,3–6 μg/mL. De verschuiving van de karakteristieke piek, veroorzaakt door de assemblage van GoldMag door de vorming van D-dimer-antilichaam sandwichbruggen, maakte de detectie mogelijk.

Achtergrond

Door gebruik te maken van een specifieke magnetisatie-eigenschap, namelijk superparamagnetisme, zijn magnetische nanopartikelen breed onderzocht voor biomedische toepassingen, zoals medicijn/gen-delivery, magnetische resonantie imaging, en biologische assays. Gouden magnetische nanopartikelen (GoldMag), samengesteld uit Fe₃O₄/Au, bezitten niet alleen de fysicochemische eigenschappen van ijzeroxide nanopartikelen, maar vertonen ook gouden nanopartikeleigenschappen zoals gemakkelijke oppervlakte-functionaliseringsmogelijkheden en unieke optische eigenschappen. Deze onderscheidende kenmerken hebben grote aandacht getrokken in het biologievakgebied, met name in biomolecuuldetectie gebaseerd op optische eigenschappen. Als voorbeeld gebruikten Wang et al. Fe₃O₄-Au staven als optische sondes voor multiplex pathogen-detectie. Echter, net als bij andere nanopartikelen, dwingt de hoge oppervlakte-energie GoldMag-deeltjes tot elkaar, zodat ze clusters vormen in bufferoplossing. Dit beperkt hun toepassing voor optische detectie in het biomedische gebied sterk. Het is daarom cruciaal om de aggregatie van GoldMag te voorkomen en een stabiele colloïdale oplossing te garanderen. Het aanpassen van GoldMag voor het detecteren van doelmoleculen door coating met polymeren heeft een hoge nutwaarde. Er is gerapporteerd dat de disperseerbaarheid van GoldMag verbeterd kan worden door oppervlaktemodificatie met diverse macromoleculaire organische verbindingen, zoals 11-mercaptoundecaanzuur (MUA), polystyreen-sulfonate (PSS), en polyethyleenimine (PEI). MUA werd op het oppervlak van GoldMag gebracht via de ligand-uitwisselingsstrategie. Het verhoogde de stabiliteit van GoldMag-colloïdale oplossingen door oppervlaktemodificatie met MUA. Deze MUA-GoldMag zijn gebruikt in proteïnedetectie gebaseerd op optische eigenschappen. Echter, de ketting van MUA was te kort om voldoende steric hinder te bieden voor voldoende disperseerbaarheid van de deeltjes. Bovendien beperkt de lage dichtheid van carboxylgroepen in MUA de hoeveelheid proteïne die geabsorbeerd kan worden op GoldMag. Deze nadelen beperken de toepassing van MUA-deeltjes in optische instrumenten en limieten de gevoeligheid vereist voor de detectie van biomarkers.

Poly(4-styreensulfonzuur-co-maleïnezuur) (PSS-MA) (PSS-MA 3: 1, Mw ~ 20.000), een blokcopolymeer, wordt gevormd door de covalente binding van PSS en polymaleïnezuur en bevat zowel sulfonaat- als carboxylgroepen. De electrostatische afstoting geboden door het grote aantal carboxylgroepen en sulfonaatgroepen, evenals de steric hinder afkomstig van de lange polymere ketten van PSS-MA maken dit polymeer zeer nuttig voor het handhaven van de stabiliteit van de nanopartikelen. In feite is PSS-MA gebruikt als stabilisator in de bereiding van nanopartikelen, zoals ijzeroxide nanomaterialen, palladium en Ag-Au bimetallische nanostrukturen. Johnston et al. rapporteerden dat copolymeer-gecoate ijzeroxide nanoclusters een hogere graad van electrosterische stabilisatie verzekeren dan enkel-macromolecuul polymeer-gecoate ijzeroxide nanoclusters. Bovendien stelt het grote aantal carboxylgroepen in de polymaleïnezuur-moetie van PSS-MA chemische modificatie met biomoleculen voor biomedische toepassingen mogelijk.

D-dimers zijn stabiele eindproducten van de degradatie van gekruiste fibrine, voortvloeiend uit versterkte fibrinevorming en fibrinolyse. Bepaling van D-dimer-niveau in bloed wordt breed gebruikt in de diagnose van trombo-embolische gebeurtenissen en myocardinfarcten. Hier gebruikten we D-dimer als model om het potentieel van het gebruik van PSS-MA-GoldMag voor optische detectie van specifieke proteïnen te evalueren. We gebruikten een paar anti-D-dimer antilichamen voor immobilisatie op PSS-MA-GoldMag om zonden te vormen voor de detectie van D-dimer door de dubbele-antilichamenzandwich-immunoassay.

Dus, in de huidige studie werd PSS-MA gebruikt voor oppervlaktemodificatie van GoldMag. Dit verbeterde niet alleen de stabiliteit van de magnetische nanopartikelen, maar medeert ook de conjugatie tussen nanopartikelen en de antilichamen voor Dimer-detectie.

Methoden

Materialen en Reagentia

GoldMag (5 mg/mL) werden geleverd door Xi'an GoldMag Nanobiotech Co., Ltd. (Xi'an, PRC). Boorzuur, boorax, Cetyltrimethylammoniumbromide (CTAB), Poly(4-styreensulfonzuur-co-maleïnezuur) (PSS-MA) (PSS-MA 3: 1, Mw ~ 20.000) werden gekocht van Sigma-Aldrich, VS. Een paar monoclonale D-dimer antilichamen (antilichaam 1: M-2.1.16; antilichaam 2: M-1.2.57) werden gekocht van Roche. D-dimer werd gekocht van Meridian Chemicals, VS.

Oppervlakte-gemodificeerd GoldMag met PSS-MA

De GoldMag werden gesynthetiseerd zoals eerder beschreven. 13,3 mL CTAB (50 mmol/L) werd toegevoegd aan 13,3 mL GoldMag (ongeveer 3 mg/mL). Het mengsel werd mechanisch geroerd (200 rpm) gecombineerd met ultrasonicatie (SB-5200DTD, China) gedurende 30 min, gevolgd door verder roeren zonder ultrasonicatie voor nog eens 30 min. Deeltjes werden grondig gewassen met gedemineraliseerd water. De CTAB-GoldMag werden hergedispergeerd in 10 mL gedemineraliseerd water en 16 mL 25% (w/w) PSS-MA-oplossing werd toegevoegd, gevolgd door roeren (180 rpm) gedurende 90 min. De gemodificeerde deeltjes werden tweemaal gewassen met gedemineraliseerd water en in gedemineraliseerd water gedispergeerd.

Karakterisering

De PSS-MA-GoldMag werden waargenomen met transmissie elektronenmicroscoop (TEM, Hitachi H-600, Hitachi Corporation, Japan). De grootteverdeling werd geanalyseerd door DLS (zeta-sizer, Malvern Instruments, VK). Fourier-transformatie infraroodspectroscopie (FTIR, Thermo Nicolet 5700, Thermo Nicolet Corporation, VS) werd gebruikt om de functionele groepen van PSS-MA-GoldMag te karakteriseren. Een Metter Toledo SDTA 851e thermogravimetrische analyzer (TGA) werd gebruikt om het aandeel van het polymere oppervlakteschelp onder de PSS-MA-GoldMag te analyseren. Het oppervlakte-plasmon-resonantie (SPR) spectrum van GoldMag werd opgenomen met een UV-2550 spectrophotometer (Shimadzu, Japan) in het golflengtebereik van 450–700 nm.

Bereiding van de Anti-D-dimer Antilichaam-PSS-MA-GoldMag Zonde

Eén milligram GoldMag werd opgeschud in 1 mL boorax/boraat-buffer (0,02 M, pH 7,4), bevattende 75 mg/mL 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC). Vervolgens werd 100 μg anti-D-dimer antilichaam toegevoegd aan de suspensie, gevolgd door ultrasonicatie gedurende 1 uur. Drie milliliter blokkeringsbuffer (0,02 M boorax/boraat-buffer, pH 7,4, bevattende 5% BSA) werden aan het mengsel toegevoegd en geïncuubeerd gedurende 1,5 uur. Na scheiding onder een extern magnetisch veld, werd het anti-D-dimer antilichaam-PSS-MA-GoldMag-composiet bewaard in boorax/boraat-buffer onder 4 °C. De conjugatie van anti-D-dimer antilichaam op het PSS-MA-GoldMag-oppervlak werd bevestigd door SPR-spectroscopie en dynamische lichtverstrooiing (DLS) meting.

De D-dimer-oplossing werd bereid door een D-dimer-voorraadsoplossing (40 mg/mL) te verdunden met kalverseerum. Drie concentraties D-dimer (0,6, 2, en 6 μg/mL) werden gebruikt om de reactietijd tussen D-dimer en het anti-D-dimer antilichaam-PSS-MA-GoldMag-complex te optimaliseren. Tien microliter anti-D-dimer antilichaam-PSS-MA-GoldMag (0,3 mg/mL) werden gemengd met 80 μL D-dimer-oplossing (0,6, 2, en 6 μg/mL), en het mengsel werd geïncuubeerd bij 25 °C gedurende 10, 20, 30, en 40 min. De golflengte van de SPR-piek van het PSS-MA-GoldMag-composiet werd afgelezen met een UV-2550 spectrophotometer.

D-dimer-oplossingen met concentraties van 6, 3, 1,5, 0,75, en 0,3 μg/mL werden bereid om de relatie tussen de D-dimer-concentratie en de verandering van het SPR-spectrum te analyseren. Tien microliter anti-D-dimer antilichaam-PSS-MA-GoldMag (0,3 mg/mL) werden gemengd met 80 μL D-dimer-oplossing (6, 3, 1,5, 0,75, en 0,3 μg/mL) en het mengsel werd geïncuubeerd bij 25 °C gedurende 30 min. De golflengte van de SPR-piek van PSS-MA-GoldMag werd afgelezen met een UV-2550 spectrophotometer.

Om te evalueren of triglyceriden, bilirubine, en hemoglobine kunnen interfereren met ons proteïnedetectiesysteem, werden D-dimer-oplossingen (0 en 3 μg/mL) bereid en 22 mg/mL triglyceriden, 0,2 mg/mL bilirubine, en 2 mg/mL hemoglobine monsters apart toegevoegd. Tien microliter anti-D-dimer antilichaam-PSS-MA-GoldMag werd aan de bovengenoemde mengsels toegevoegd, en de golflengte van de SPR-piek van het PSS-MA-GoldMag-composiet werd afgelezen met een UV-2550 spectrophotometer.

Resultaten en Discussie

Schema 1 illustreert de procedures ontwikkeld voor de oppervlaktemodificatie en functionalisering van deeltjes voor colorimetrische detectie van proteïnen. Om de adsorptie en incorporatie van PSS-MA op de PSS-MA-GoldMag-structuren te bestuderen, werden FTIR-spectroscopische analyses, SPR-spectroscopie, en TGA uitgevoerd. Figuur 1a toont het FTIR-spectrum voor zuiver PSS-MA, PSS-MA-GoldMag, en GoldMag, respectievelijk. De brede en sterke band bij 3000–3700 cm⁻¹ correspondeert met de strekking van de –CO–OH groepen en de hydroxylgroepen van –SO₂–OH in polymere ketens. Symmetrische trillingen van sulfonaatgroepen: (SO₃ ⁻) waren bij 1037 en 1126 cm⁻¹ en strekkingstrillingen van C = C van benzeen bij 1403 en 1637 cm⁻¹. Deze karakteristieke absorptiebanden van PSS-MA werden waargenomen in PSS-MA-GoldMag, wat aantoont dat de rauwe deeltjes met succes met PSS-MA gecoate waren. De verandering van oppervlaktechemische groepen van de GoldMag werd bevestigd door een duidelijke blauwverschuiving van 11 nm van 555 naar 544 nm in de SPR-band na modificatie (Fig. 1b). De positie en breedte van de SPR-piek was gerelateerd aan het oppervlak, de omgeving, en de disperseerbaarheid van de nanopartikelen. TGA-analyse gaf aan dat het gewichtsverhouding van organisch materiaal tot GoldMag bijna 1:4 was (Fig. 1c). Bij lage temperatuur kan gewichtsverlies toegeschreven worden aan dehydratatie; wanneer de temperatuur stijgt, kan gewichtsverlies toegeschreven worden aan oxidatieve decompositie van de organische moleculen op het oppervlak van de gemodificeerde deeltjes. Tijdens de modificatie waren CTAB-GoldMag positief geladen (+ 12,2 mV) en het deeltjesoppervlak werd negatief geladen (− 24,5 mV) na de PSS-MA-coating op het deeltjesoppervlak (Fig. 1d). Alle bovenstaande resultaten tonen aan dat PSS-MA met succes op het oppervlak van de nanopartikelen gehecht is.

De micrografieken (Fig. 2a, b) van de GoldMag en PSS-MA-GoldMag verkregen met TEM tonen aan dat deze deeltjes monodisperse zijn, na modificatie. De laag polymereer op het oppervlak van de deeltjes is duidelijk zichtbaar onder het hoog-resolutie elektronenmicroscopisch beeld, wat verder aangeeft dat de coating van polymereer op GoldMag succesvol was (Fig. 2b). Figuur 2c toont dat de gemiddelde diameter van PSS-MA-GoldMag 116 nm is. De PSS-MA-GoldMag-suspensie heeft een wijnrode kleur wat een goede stabiliteit van de nanopartikelen aangeeft (1 jaar in water).

De stabiliteit van de optische kenmerken van GoldMag en PSS-MA-GoldMag in bufferoplossingen met verschillende pH-waarden werden geanalyseerd door SPR-spectroscopie. Zoals getoond in Fig. 3a, verschuifde de SPR-karakteristieke piek naar de langere golflengte van 555 nm toen GoldMag in boorax/boraat-buffer met een pH van 6,0 tot 9,0 waren opgeschud. De samenstelling van de bufferoplossing beïnvloedt ook de stabiliteit van de GoldMag-suspensie. De positie van de SPR-karakteristieke piek verplaatste naar hogere golflengtes (558 nm) toen GoldMag in PB-buffer (pH 7,4), boorax/boraat-buffer (pH 7,4), en NaCl-oplossing (10 mM) waren opgeschud vergeleken met die in gedemineraliseerd water (550 nm) (Fig. 3c). Echter, de karakteristieke SPR-piek (545 ± 2 nm) veranderde niet significant toen PSS-MA-GoldMag in elektrolytoplossing of in bufferoplossing met verschillende pH-waarden waren gedispergeerd (Fig. 3b, d). Xia et al. en Storhoff et al. hebben ook gerapporteerd dat aggregatie van nanopartikelen het SPR-spectrum kan laten verschuiven naar langere golflengtes. De zetapotentiaal van GoldMag en PSS-MA-GoldMag werden ook gemeten (Fig. 3e, f). Het is gerapporteerd dat een lage zetapotentiaal (minder dan ± 30 mV) zal leiden tot deeltjesagglomeratie. Toen GoldMag in PB-buffer (pH 7,4), boorax/boraat-buffer (pH 7,4) en NaCl-oplossing (10 mM) waren opgeschud, was het zetapotentiaal van GoldMag − 16,7 ± 1,1 mV, − 14,3 ± 2,1 mV, en − 8,9 ± 1,5 mV, respectievelijk. Het zetapotentiaal van GoldMag was − 14,2 ± 1,7 mV, − 17 ± 1,1 mV, 13,9 ± 1,7 mV, en − 18,1 ± 1,6 mV toen deeltjes in boorax/boraat-buffer met pH van 6,0 tot 9,0 waren opgeschud. Echter, de hechting van PSS-MA aan GoldMag verlaagt het zetapotentiaal dramatisch in verschillende elektrolytoplossingen, alsook bij verschillende pH-waarden. In alle gevallen was het zetapotentiaal lager dan − 30 mV. Deze resultaten tonen aan dat oppervlaktemodificatie van GoldMag met PSS-MA de weerstand tegen veranderingen in samenstelling en pH-waarden van bufferoplossingen aanzienlijk verbetert en een hoog niveau van disperseerbaarheid garandeert.

Om de interactie tussen proteïne en PSS-MA-GoldMag te onderzoeken, werden anti-D-dimer antilichamen geconjugeerd met PSS-MA-GoldMag via de reactie tussen proteïne aminogroepen en de carboxylgroepen van het polymereer gemedieerd door EDC. Zoals getoond in Fig. 4a, werd een rode verschuiving van de SPR-piek waargenomen na de reactie van PSS-MA-GoldMag met anti-D-dimer antilichamen, wat de conjugatie van antilichamen op nanopartikelen aangeeft. De toename van de gemiddelde diameter van deeltjes van 116 naar 130 nm bevestigt de introductie van het anti-D-dimer antilichaam aan de PSS-MA-GoldMag (Fig. 4b). De invloed van antilichaamsmassa op de optische eigenschap van PSS-MA-GoldMag werd geëvalueerd door SPR-spectroscopie na het toevoegen van verschillende hoeveelheden anti-D-dimer antilichaam (van 20 tot 200 μg) aan de PSS-MA-GoldMag-suspensie. Zoals getoond in Fig. 4c, veranderde de SPR-piek niet en bleef op 548 ± 3,0 nm, onafhankelijk van de hoeveelheid toegevoegd antilichaam.

Om de activiteit van de antilichamen na conjugatie op de PSS-MA-GoldMag te evalueren, werden zonde A en zonde B bereid door een paar antilichamen (antilichaam 1 en antilichaam 2), en antilichaam 1 op PSS-MA-GoldMag te immobiliseren, respectievelijk. De interactie tussen de twee typen zonden en D-dimer werd geanalyseerd door SPR-spectroscopie. De beste reactietijd werd verkregen door de verandering van het maximum van de SPR-piek te observeren gedurende 40 min na het toevoegen van drie concentraties D-dimer (0,6, 2, en 6 μg/mL) aan zonde A. Zoals getoond in Fig. 5a, werd een significante verschuiving in het oppervlakte-plasmon-band waargenomen als resultaat van de aggregatie van PSS-MA-GoldMag door kruisverbindingen tussen antigeen-antilichaam-zandwichbruggen over de tijd. Bij lage concentratie (0,6 μg/mL) was er geen significante verandering in het SPR-spectrum van 20 tot 40 min, wat aangeeft dat 20 min voldoende is voor de reactie van 0,6 μg/mL of lagere concentraties D-dimer. Echter, bij middelbare en hoge concentraties D-dimer (2 en 6 μg/mL), bleef de golflengte 30 min toenemen. Dit geeft aan dat de beste reactietijd 30 min is. Zoals getoond in Fig. 5b, onthulde het SPR-spectrum van de composietdeeltjes een duidelijke rode verschuiving in oppervlakte-plasmon-resonantie van λ_max = 550 naar 570 nm en intensiteitsafname van de karakteristieke piek naarmate de D-dimer-concentratie toenam van 0,3 tot 6 μg/mL. Dit wordt veroorzaakt door de aggregatie van PSS-MA-GoldMag door de kruisverbinding van D-dimer met antilichaam 1 en antilichaam 2 op zonde A. De aggregatie van PSS-MA-GoldMag resulteerde in de verandering van de optische eigenschappen van het gouden deel van PSS-MA-GoldMag. Jiang et al. en Li et al. hebben ook gerapporteerd dat aggregatie van nanogoud het SPR-spectrum van nanopartikelen kan laten rood verschuiven en verbreken. Echter, geen rode verschuiving werd waargenomen in Fig. 5d omdat de interactie tussen D-dimer en antilichaam 1 niet in staat was om de assemblage van nanopartikelen te leiden. Verder werd een onderscheidende rode verschuiving (5 nm) waargenomen zelfs als de hoeveelheid D-dimer toegevoegd aan zonde A zo laag was als 0,3 μg/mL, wat aangeeft dat de detectielimiet onder de diagnostische afsnijwaarden (0,5 μg/mL) voor deze biomarker ligt. Een lineaire relatie tussen de SPR-spectrale piekpositie en de D-dimer-concentratie werd gevonden in het bereik van 0,3–6 μg/mL (r² = 0,9944) (Fig. 5c).

Zoals getoond in Fig. 6, werd geen significante verschuiving gevonden van de SPR-karakteristieke piek van PSS-MA-GoldMag in de aanwezigheid van triglyceriden, bilirubine, en hemoglobine, respectievelijk. Dit resultaat geeft aan dat ons proteïnedetectiesysteem geen interfererende reacties heeft met triglyceriden, bilirubine, en hemoglobine.

Deze resultaten tonen aan dat PSS-MA-GoldMag een veelbelovende magnetische nanopartikelen is voor proteïne-immobilisatie en een zandwichbrug kan vormen op het deeltjesoppervlak via antilichaam 1-doeleiwit-antilichaam 2. Dit maakt PSS-MA-GoldMag waardevol als materiaal voor gebruik in point-of-care optische detectie van biomarkers.

In deze studie werd PSS-MA voor het eerst gebruikt voor modificatie van GoldMag (Schema 1). De introductie van PSS-MA op het oppervlak van GoldMag verbeterde de stabiliteit in bufferoplossing aanzienlijk. Naast de steric hinder veroorzaakt door de lange polymere ketting van PSS-MA, veroorzaken de carboxylgroepen en de sulfo-groep in PSS-MA electrostatische afstoting tussen de nanopartikelen. Dit verbetert de stabiliteit van PSS-MA-GoldMag aanzienlijk. Het hoge aantal carboxylgroepen op het deeltjesoppervlak voldoet aan de vereiste voor conjugatie met biomolecuul.

Conclusies

In de huidige studie werd een eenvoudige en snelle methode voor het coaten van GoldMag met PSS-MA gerapporteerd. De resultaten tonen aan dat de colloïdale stabiliteit en disperseerbaarheid van GoldMag aanzienlijk verbeterd werden door de introductie van PSS-MA. De deeltjes vertonen goede stabiliteit in bufferoplossing met een breed pH-bereik. Bovendien biedt de aanwezigheid van carboxylgroepen de optie om proteïnen te conjugeren aan de nanopartikelen. Neem D-dimer en zijn antilichaam als model, dan wordt gevonden dat de optische kenmerken kunnen worden afgestemd door de kruisverbinding tussen antigeen en antilichaam-nanopartikelsamenstelling. De resultaten tonen aan dat de PSS-MA-gemodificeerde GoldMag kan dienen als een zeer veelbelovende kandidaat voor optische detectie gebaseerd op immunoassays.

Afkortingen

DLS:

Dynamische lichtverstrooiing

FTIR:

Fourier-transformatie infraroodspectroscopie

GoldMag:

Gouden magnetische nanopartikelen

MUA:

11-mercaptoundecaanzuur

PEI:

Polyethyleenimine

PSS:

Polystyreen-sulfonate

PSS-MA:

Poly(4-styreensulfonzuur-co-maleïnezuur)

SPR:

Oppervlakte-plasmon-resonantie

TEM:

Transmissie elektronenmicroscoop

TGA:

Thermogravimetrische analyzer