Ultrgevoelige electrochemische DNA-biosensor voor Vibrio cholerae-detectie met polystyreen-acrylzuur nanodeeltjes en goudnanodeeltjes

Samenvatting

We rapporteren een hooggevoelige electrochemische DNA-biosensor voor het detecteren van Vibrio cholerae DNA. De sensor gebruikt polystyreen-co-acrylzuur (PSA) latex nanospheren geladen met goudnanodeeltjes (AuNP's) als DNA-dragermatrix. Differentiele pulsvoltammetrie (DPV) met een anthrachinon-gebaseerd oligonucleotide-label meet het hybridisatiesignaal. De AuNP's versterken de faradaische stroom aanzienlijk, wat een reproduceerbare, lineaire respons oplevert van 1,0×10⁻²¹ tot 1,0×10⁻⁸ M (RSD = 4,5%, n = 5) en een detectielimiet (LOD) van 1,0×10⁻²¹ M (R² = 0,99). Herstel in gespikte monsters varieerde van 91% tot 109% (n = 3). De sensor behoudt 95% van de oorspronkelijke respons na 58 dagen en kan zes keer hergebruikt worden met een RSD van 5% (n = 5).

Achtergrond

Vibrio cholerae blijft een wereldwijde gezondheidsdreiging, met name in laag-inkomenssettings. Traditionele cultuur-gebaseerde methoden zijn langzaam en arbeidsintensief, terwijl PCR dure apparatuur en bekwaam personeel vereist. Snelle, goedkope en hooggevoelige diagnostiek is essentieel voor tijdige uitbraakbeheersing. Electrochemische DNA-biosensors bieden hoge gevoeligheid, specificiteit en potentieel voor miniaturisering, wat ze ideaal maakt voor point-of-care testen.

Methoden

Chemische reagentia

Polystyreen, acrylzuur, HAuCl₄·3H₂O, natriumcitraat en overige reagentia werden bezorgd van Fluka, Sigma-Aldrich en Riedel-De Haën. Target, mismatch en reporter-oligonucleotiden werden gesynthetiseerd door Bio Service Unit (NSTDA) en Bioneer.

Apparaat

DPV-metingen werden uitgevoerd op een screen-geprinte koolstofelektrode (SPE) met een Ag/AgCl referentie en platina tegenelektrode, gebruikmakend van een Autolab PGSTAT12 potentiostaat. Electrochemische parameters: 0,02 V stap, 0,5 V s⁻¹ scan, 0,05 M fosfaatbuffer, pH 7.

Synthese van AuNP's en PSA latex deeltjes

AuNP's werden bereid door citraat-reductie (Turkevich-methode). PSA latex-sferen werden gesynthetiseerd door zeep-vrije emulsie-copolymerisatie van styreen en acrylzuur, wat sub-micron deeltjes (~186 nm) opleverde met overvloedige carboxylgroepen voor DNA-hechting.

Elektrodemodificatie en DNA-immobilisatie

PSA-deeltjes werden drop-gecast op de SPE, gevolgd door AuNP-depositie. EDC/NHS-koppeling in pH 5-buffer activeerde carboxylgroepen, waarna een 5 µM capture-proef geïmmobiliseerd werd. Hybridisatie met 1 µM target DNA en een 5 mM anthrachinon-label (AQMS) verliep in twee stadia: capture-target en reporter-binding, elk 1 uur.

Optimalisatie

Proef-lading (1–6 µM) en AQMS-concentratie (0,1–5 mM) werden geoptimaliseerd; 4 µM proef en 1 mM AQMS gaven maximaal respons. pH 7, 0,05 M fosfaatbuffer en 2,0 M NaCl leverden optimale ionische condities. Hybridisatietijd van 60 min en proef-immobilisatietijd van 8 uur werden geselecteerd.

Prestatiebeoordeling

De sensor demonstreerde een lineair bereik van 1,0×10⁻²¹ tot 1,0×10⁻⁸ M met een LOD van 1,0×10⁻²¹ M. Hersteltesten in gespikte monsters (1,0×10⁻⁴ tot 1,0×10⁻⁶ µg µL⁻¹) gaven 91,4%–108,9% (n = 3). Houdbaarheidsstudies toonden 95% activiteit na 58 dagen; de sensor kon geregenereerd worden met 0,1 M NaOH en tot zes keer hergebruikt worden met 5% RSD.

Resultaten en discussie

SEM bevestigde uniforme PSA-sferen (~186 nm). DPV-analyse toonde dat AuNP-lading de piekpotentiaalscheiding (ΔEₚ) verminderde, wat verbeterde elektronenoverdracht aangeeft. Hybridisatie-experimenten onthulden een duidelijke toename in DPV-piekstroom alleen wanneer zowel target als reporter-proeven aanwezig waren, wat sandwich-type specificiteit bevestigt. Optimale proef-lading en AQMS-concentratie werden geïdentificeerd; hogere proef-dichtheden leidden tot plateauende respons, terwijl excessief AQMS achtergrondruis veroorzaakte. pH 7, Na⁺-ionen en hoge ionische sterkte (2,0 M NaCl) maximaliseerden hybridisatie-efficiëntie.

De kalibratiecurve vertoonde uitstekende lineariteit (R² = 0,99). De sensor's sub-zeptomolaire LOD overtreft eerdere gerapporteerde PSA-gebaseerde of avidine-biotine systemen, terwijl een snelle assay-tijd (~60 min) behouden blijft. Stabiliteitstesten toonden minimaal signaalverlies over 58 dagen, en regeneratieprotocollen herstelden volledige activiteit voor tot zes cycli.

Conclusies

We hebben een robuuste, amplificatie-vrije electrochemische DNA-biosensor ontwikkeld die V. cholerae DNA detecteert bij sub-zeptomolaire concentraties met hoge specificiteit en reproduceerbaarheid. De eenvoudige fabricage, snelle assay-tijd en lange houdbaarheid maken het geschikt voor veldimplementatie in uitbraaksettings.