Hoge-gevoeligheid grafene-oxide fluorescentie aptasensor voor snelle detectie van CCRF-CEM leukemiecellen

Samenvatting

Een handige, goedkope en zeer gevoelige fluorescente aptasensor voor detectie van leukemie is ontwikkeld op basis van grafene-oxide-aptamer complex (GO-apt). Grafene-oxide (GO) kan carboxylfluoresceïne-gelabelde Sgc8 aptamer (FAM-apt) absorberen via π-π stacking en de fluorescentie kwetsen door fluoresceneresonantie-energieoverdracht (FRET). In afwezigheid van Sgc8-doelcel CCRF-CEM is de fluorescentie bijna volledig gekwetst. Integen, wanneer CCRF-CEM-cellen worden toegevoegd, kan de gekwete fluorescentie snel en significant hersteld worden. Daarom, gebaseerd op de verandering van fluorescentiesignalen, kunnen we het aantal CCRF-CEM-cellen detecteren in een wijd bereik van 1 × 10² tot 1 × 10⁷ cellen/mL met een detectielimiet (LOD) van 10 cellen/mL. Deze strategie van grafene-oxide-gebaseerde fluorescente aptasensor kan veelbelovend zijn voor kankerdetectie.

Achtergrond

Leukemie is een agressieve en veelvoorkomende maligne hematologische ziekte, die een dreiging vormt voor het overleven en de gezondheid van mensen, met name voor kinderen en adolescenten [1, 2]. Het beïnvloedt niet alleen de normale hematopoïetische cellen van het lichaam maar ook het beenmerg, alsmede het immuunsysteem [3,4,5]. Daarom is vroege diagnose van leukemie voor de behandeling en verbetering van de levenskwaliteit van patiënten essentieel. Op dit moment is de algemeen gebruikte methode voor detectie van leukemie het nemen van perifeere bloedcellen en beenmerg, waarna veel soorten analyses [6] worden uitgevoerd, waaronder celmorfologie, cytochemie [7,8,9], immunofenotypering [10, 11], immunohistochemie [12, 13] en aptamer-gebaseerde flowcytometrie [14, 15]. Deze methodes kunnen leukemiecellen detecteren, maar hebben nog veel tekortkomingen zoals hoge kosten, lage gevoeligheid en complexiteit. Het is daarom dringend nodig een goedkope, hooggevoelige en eenvoudige methode te vinden voor detectie van leukemie.

Aptamers, die korte enkelstrengs DNA (ssDNA) of RNA zijn, werden gescreend door in vitro screening van systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking (SELEX) [16, 17]. Gebaseerd op de speciale tertiaire structuren hebben aptamers robuuste bindingsaffiniteit en hoge specificiteit met doelen, waaronder kleine organische moleculen, eiwitten en zelfs cellen [18,19,20]. Bovendien hebben aptamers de eigenschappen van eenvoudige synthese en modificatie, zodat ze breed gebruikt worden als kankerdetectiesonden [21]. Gefunctionaliseerde nanomaterialen gebaseerd op aptamers voor detectie van kanker zijn ook hotspots in recent jaren [22, 23], zoals kwantumdots en silicananodeeltjes [24].

Grafene-oxide (GO), als een nieuw tweedimensionaal planaire koolstofnanomateriaal, heeft veel aandacht gekregen vanwege unieke eigenschappen zoals goede wateroplosbaarheid [25], grote specifieke oppervlakte en uitstekende fluorescentiekwetsingsvermogen [26, 27]. Gebaseerd op deze eigenschappen wordt GO beschouwd als een uitstekende energie-ontvanger in fluoresceneresonantie-energieoverdracht (FRET), wat GO een brede toepassingsperspectief geeft in fluorescente aptasensoren [28]. Bovendien kan GO binden aan aptamers via π-π stacking interacties, maar niet met dubbelstrengs DNA of aptamer-doel-complexen [19, 29, 30]. Daarom kan de grafene-gebaseerde aptamer-sensor de stabiliteit van de aptamer verbeteren ten opzichte van de vrije aptamer-sonde [31].

Op dit moment hebben veel onderzoeken gerapporteerd dat de strategie van grafene-oxide-gebaseerde fluorescente aptasensor voor detectie van doelen haalbaar is [21, 32]. Niettemin zijn er tot nu toe weinig studies uitgevoerd met een GO-gebaseerde aptasensor voor leukemiecellen. Hier hebben we een nieuwe strategie ontworpen voor 'aan'-signaaldetectie van leukemiecellen gebaseerd op GO en carboxylfluoresceïne-gelabelde Sgc8 aptamer (FAM-apt). GO en aptamer werden gebruikt als fluoresentie-kwetsers en doelaagent, respectievelijk. In afwezigheid van leukemiecellen kan GO interageren met FAM-apt en bijna alle fluorescentie kwetsen, en het detectiesignaal staat uit. Echter, wanneer de doelcellen aanwezig zijn, binden de aptamers actief aan cellen en vallen van GO af, wat resulteert in fluorescentieherstel in het detectiesysteem, en het detectiesignaal staat aan. Daarom kan de doelcelconcentratie overeenkomstig gemeten worden volgens de verandering in fluorescentie-intensiteit.

Methoden

Reagentia

De FFAM-apt met een sequentie van 5'-FAM-AT CTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-3' werd gesynthetiseerd door Sangon Biotech Co., Ltd. (Shanghai, China). In dit werk werd zelf-regulerende Tris-HCl-buffer gebruikt, inclusief 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM MgCl₂ en 100 mM NaCl. De aptamers gebruikt in dit experiment werden opgelost door Tris-HCl-buffer. Grafene-oxide poeder werd gekocht van Xianfeng Nano Materials Tech Co., Ltd. (Nanjing, China). Alle oplossingen werden bereid met ultrapur water van 18 MΩ gezuiverd uit een Milli-Q zuiveringssysteem (Millipore, Bedford, MA, USA).

Cellen

CCRF-CEM (humane acute lymphoblastische leukemiecellijnen), Ramos (humane Burkitt-lymfoom cellijnen), 293T (humane embryonale niercellijnen) en H22 (muizen hepatocellulaire carcinoom cellijnen) cellijnen werden gekocht van de Celbank van de Chinese Academie van Wetenschappen (Shanghai, China). Alle cellijnen werden gekweekt bij 5% kooldioxide en 37 °C, en het 1640-medium bevat 10% foetale kalfserum (FBS; HyClone) en 100 U/mL penicilline-streptomycine (Gibco, Grand Island, NY, USA).

Apparatuur

Alle fluorescentiespectra en fluorescentie-intensiteit werden gemeten en geregistreerd door een F-7000 fluorescentiespectrofotometer (Hitachi Company, Tokyo, Japan). Een 700-µL kwarts cuvette werd gebruikt om de monsteroplossing te houden. Vanwege de karakteristieke piekgolflengtes van carboxylfluoresceïne (FAM), werd de luminescentie-intensiteit gemonitord door het monster te exciteren bij 490 nm en de emissie te meten bij 518 nm.

Alle atoomkrachtmicroscopie (AFM) beelden werden genomen door een SPI3800N microscoop (Seiko Instruments Industry Co., Tokyo, Japan).

Zeta-potentiaal van de GO, FAM-apt en grafene-oxide-aptamer complex (GO-apt) werd bepaald door een nanodeeltjesgrootte, zeta-potentiaal en absolute molecuulgewicht analyzer (Zetasizer Nano ZS, Malvern, UK).

UV-zichtbare absorptiespectra van GO, FAM-apt en GO-apt werden geregistreerd op NanoDrop 2000 (Thermo, USA).

Bereiding van GO-apt Fluorescente Aptasensor

Het grafene-oxide poeder werd opgelost en verdeeld in Milli-Q gezuiverd water en vervolgens gedispergeerd door ultrasoon om een homogene zwarte oplossing met een concentratie van 1 mg/mL te verkrijgen. Het verdunnen van de stockoplossing met 20 mM Tris-HCl-buffer, kregen we de concentratie van 20 nM FAM-apt. En daarna werden 1 µL FAM-apt (10 µM) en 10 µL GO-oplossing (1 mg/mL) zoals bereid gemengd en vervolgens verdund met Tris-HCl-buffer tot 500 µL.

Celbeeldvorming

CCRF-CEM en Ramos-cellen werden 12 uur gekweekt in zes-putplaten (5 × 10⁵ cellen per put). Cellen werden tweemaal gewassen met koude fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) en geïncubeerd met GO-apt-oplossing bij 4 °C in het donker gedurende 30 min. Vervolgens werden cellen driemaal gewassen en 20 min gefixeerd met 4% polyoxymetheen. Cellen werden opnieuw gewassen met PBS en gekleurd met 4′,6-diamidino-2-fenylindole dihydrochloride (DAPI; Life Co., USA) gedurende 5 min in het donker. Ten slotte werden cellen driemaal gewassen met PBS en onderzocht door fluorescentiemicroscopie (Nikon DS-Ri1; Japan).

Detectie van CCRF-CEM Cellen

CCRF-CEM-cellen werden verzameld door centrifugatie en opgeschorst in 1 mL PBS. De verschillende concentraties CCRF-CEM-cellen (0 tot 1,0 × 10⁷/mL) werden geïncubeerd met een GO-apt fluorescente aptasensor bij 4 °C in het donker gedurende 30 min. Na incubatie werden de CCRF-CEM-cellen gedetecteerd door fluorescentiespectroscopie in het golflengtebereik van 560–500 nm. De detectielimiet (LOD) wordt geschat op basis van de 3σ / S berekening, waar σ de standaarddeviatie is voor de GO-apt-oplossing (n = 10) en S de helling is van de lineaire vergelijking [33].

Specificiteitstoets

Om de specificiteit van GO-gebaseerde fluorescente aptasensor te onderzoeken, testten we het systeem met verschillende cellen, waaronder Ramos-cellen, H22-cellen en 293T-cellen. Elk van de 100-µL reactiesystemen bevatte 1 × 10⁶ cellen.

Statistische Analyses

Elk experiment werd driemaal herhaald. De data werd verwerkt door de software SigmaPlot 12.5, en statistische analyses werden uitgevoerd met GraphPad Prism 6.02 (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). De significantiedrempel in alle analyses was P < 0,0001.

Resultaten en Discussie

Principe van GO-apt Fluorescente Aptasensor voor Detectie van CCRF-CEM

In deze studie werden GO en FAM-apt gebruikt om een fluorescente aptasensor te ontwerpen voor detectie van CCRF-CEM-cellen. Het principe van de fluorescensensor voor detectie van CCRF-CEM-cellen wordt getoond in Fig. 1. In afwezigheid van CCRF-CEM-cellen worden de FAM-gemodificeerde aptamers geadsorbeerd op het GO-oppervlak door π-π stacking. Omdat GO en de fluorofore te dicht bij elkaar zijn voor energieoverdracht, kwetst GO als kwetser de fluorescentie van FAM. In aanwezigheid van CCRF-CEM-cellen laat de zwakke bindingskracht van de GO-aptamer de aptamer van het GO-oppervlak vallen en binden aan de cellen, wat fluorescentieherstel veroorzaakt. Daarom kan het aantal CCRF-CEM-cellen overeenkomstig gedetecteerd worden volgens de herstel van FAM-fluorescentie-intensiteit.

Schematische illustratie van GO-apt fluorescente aptasensor voor detectie van CCRF-CEM-cellen

Fluorescentiekwetsing en Herstel

Dit continue proces van fluorescentiekwetsing door GO en terugkeer van fluorescentie in aanwezigheid van CCRF-CEM-cellen kan waargenomen worden door een fluorescentiespectrofotometer. Het hele senseringsproces gebaseerd op GO-fluorescente aptamers wordt getoond in Fig. 2a. Het fluorescentiespectrum van FAM-apt in 25 nM Tris-HCl-buffer presenteert sterke fluorescentie-intensiteit dankzij de aanwezigheid van de FAM (Fig. 2a, kromme a). Echter, na toevoeging van GO werd de fluorescentie-intensiteit opmerkelijk verlaagd (Fig. 2a, kromme b), wat aangeeft dat GO in staat was om fluorescentie efficiënt te kwetsen wanneer GO en de aptamers dicht bij elkaar waren en samen geadsorbeerd. Verrassend genoeg, toen 5 × 10⁶ CCRF-CEM-cellen werden toegevoegd, kon de gekwete fluorescentie in tijd herstellen (Fig. 2a, kromme c). Niettemin, de fluorescentie-intensiteit van FAM-apt zonder GO-conjugatie heeft geen duidelijke verandering wanneer CCRF-CEM-cellen worden toegevoegd (Fig. 2a, kromme d). CCRF-CEM is een niet-fluorescerende cel (Fig. 2a, kromme e); daarom is fluorescentieherstel voornamelijk te wijten aan de dissociatie van de aptamer van het grafene-oppervlak en het blootleggen van de fluorescente groep. Deze experimenten van fluorescentiekwetsing en herstel illustreerden duidelijk dat CCRF-CEM-aptamer complex (CEM-apt) FAM-apt kan bewaren tegen kwetsing door GO, en CEM heeft sterkere bindingsaffiniteit voor zijn aptamer dan GO. Dankzij de structuurverschil tussen enkelstrengs aptamer en CEM-aptamer-complex, kunnen aptamers op het GO-oppervlak interageren met CEM en dan transformeren naar het CEM-aptamer-complex. Dit fenomeen geeft ook duidelijk aan dat de binding van het CEM-aptamer-complex aan de aptamer zwakker is dan die van GO, wat de aptamer toelaat van het GO-oppervlak af te vallen. Omdat de FAM-apt ver van het GO-oppervlak ligt en de energieoverdrachts-efficiëntie vermindert, wordt de fluorescentie hersteld. Statistische analyse van fluorescentie-emissiespectra van FAM-gelabelde Sgc8 aptamer en CCRF-CEM werd uitgevoerd bij verschillende condities (Fig. 2b).

Haalbaarheid van Go-apt detectie van CEM-cellen. a Fluorescentie-emissiespectra van FAM-apt en CCRF-CEM-cellen bij verschillende condities: (a) FAM-apt, (b) FAM-apt + GO, (c) FAM-apt + GO + CCFF-CEM, (d) FAM-apt + CCFF-CEM, en (e) CCRF-CEM; FAM-apt (20 nM); GO (25 µg/mL); CCRF-CEM (1 × 10⁶ cellen). Excitatie 490 nm. b Statistische analyse van fluorescentie-emissiespectra van FAM-apt en CCRF-CEM bij verschillende condities. NS niet significant. ****P < 0,0001

Karakterisaties van GO-apt Fluorescente Aptasensor

Om het ontwerp te verifiëren, werden uniforme en gedecentraliseerde GO verkregen. Uit Fig. 3a weten we dat een GO-vel met een dikte van 1,17 nm een typische tweedimensionale uiterlijk bezit door AFM. Echter, GO-apt met een dikte van 1,94 nm toonde aan dat FAM-apt succesvol is geadsorbeerd op het GO-oppervlak. Het zeta-potentiaal van FAM-apt en GO was -11,35 en -23,90 mV, respectievelijk, maar toen GO non-covalent interageert met FAM-apt, nam de absolute waarde van zeta-potentiaal toe (Fig. 3b). Deze resultaten gaven aan dat aptasensors succesvol zijn geconstrueerd. Uit Fig. 3c weten we dat GO een sterke absorptie vertoonde bij 234 nm wat toegeschreven wordt aan de π-π* overgangen van aromatische C=C-bindingen. FAM-apt wordt gekenmerkt door absorptiebanden van de DNA-sequentie (260 nm) en FAM (503 nm), terwijl de toevoeging van GO in de oplossing van FAM-apt een rode verschuiving veroorzaakt en de absorptie van FAM bij 503 nm toeneemt. De mogelijke reden is dat FAM-apt geadsorbeerd is op het GO-oppervlak, wat elektronische interacties aangeeft tussen de twee π-systemen van GO en de kleurstoffen in de grondtoestand. Daarom gaven de resultaten aan dat GO-apt succesvol is geconstrueerd.

Karakterisatie van GO-apt. a AFM-beelden van GO en CEM-apt. b Oppervlakte zeta-potentiaal van FAM-apt, GO en CEM-apt. Foutbalken geven ± SD (n = 3). c UV-zichtbare absorptiespectra van (a) GO, (b) FAM-apt, en (c) GO-apt

Fluorescentiemicroscopie van Cellen

Om de specificiteit van gevallen FAM-apt binding op cellulaire niveau direct te visualiseren, incuberen we CCRF-CEM en Ramos-cellen met Go-apt en analyseerden ze met fluorescentiemicroscopie. Consistent met de fluorescentiespectrale experimenten, kan FAM-apt van Go-apt vallen en dan binden aan CCRF-CEM-cellen voor fluorescente kleuring, maar niet aan Ramos-cellen (Fig. 4).

Fluorescentiemicrografieken van CCRF-CEM en Ramos-cellen na menging met GO-apt. Kernen werden gekleurd met DAPI. Schaalbalken geven 25 µm aan

Optimalisatie van Experimentele Condities voor Detectie van CCRF-CEM

Om de uitstekende prestaties van de fluorescente aptasensor te verkrijgen, werden de tijd van fluorescentiekwetsing en herstel geoptimaliseerd. De kinetische gedragingen van FAM-apt en GO, alsook de FAM-apt in homogene GO-oplossing met CCRF-CEM-cellen, werden onderzocht door de fluorescentie-intensiteit te monitoren als functie van kwetsings- en hersteltijd (Fig. 5a, b). Zoals getoond in Fig. 5a, kan de fluorescentiekwetsing van FAM-apt als functie van incubatietijd in aanwezigheid van GO waargenomen worden. De FAM-apt adsorbeert snel aan het oppervlak van de GO en ondergaat daarna energieoverdracht, en tegelijkertijd wordt de fluorescentie-intensiteit significant verlaagd en neigt langzaam na 2 min. In tegenstelling, wordt CEM-apt gevormd en de vrijgave van het GO-oppervlak is langzamer. De fluorescentie-intensiteit bereikte een plateau toen de incubatietijd hoger was dan 30 min (Fig. 5b). Deze tijdsafhankelijke experimenten tonen aan dat GO, als uitstekende kwetser, FAM-apt fluorescentie snel kwetst en geleidelijk fluorescentie herwint in aanwezigheid van CEM.

Optimalisatie van experimentele condities. a Fluorescentiekwetsing van FAM-apt (20 nM) in Tris-HCl-buffer door GO als functie van tijd. b Fluorescentieherstel van FAM-apt in GO-oplossing door CCRF-CEM (1 × 10⁶) als functie van tijd. c Effect van GO-concentratie op de fluorescentie-intensiteit van FAM-apt in afwezigheid (kromme a) en in aanwezigheid (kromme b) van 1 × 10⁶ CCRF-CEM-cellen. d De fluorescentie-intensiteit verhouding (F/F₀) van FAM-apt door 1 × 10⁶ CCRF-CEM-cellen als functie van GO-concentratie. Excitatie 490 nm

Om de fluorescente aptasensor gevoeliger te maken voor detectie van CCRF-CEM, wordt het reactiesysteem gebruikt om de GO-concentratie te optimaliseren onmisbaar. Figuur 5c, die onze strategie duidelijk illustreert, toont het effect van verschillende concentraties GO op de fluorescentie-intensiteit van FAM-apt in afwezigheid (Fig. 5c, kromme a) en in aanwezigheid (Fig. 5c, kromme b) van CCRF-CEM. Zoals we gezien hebben uit Fig. 5c, na toevoeging van GO wordt het fluorescentiesignaal-achtergrond significant verlaagd. Figuur 5d toont het herstelde fluorescentie van de FAM-apt door 1 × 10⁶ CEM-cellen als functie van GO-concentratie. Uit Fig. 5d kunnen we vinden dat wanneer de GO-concentratie 20 µg/mL is, de verhouding van F/F₀ (waar F₀ en F de fluorescentie-intensiteiten van FAM bij 518 nm zijn in afwezigheid en aanwezigheid van CCRF-CEM, respectievelijk) de hoogste waarde krijgt, namelijk 13,0354. Daarom werd 20 µg/mL beschouwd als de optimale GO-concentratie.

CCRF-CEM Detectie met GO-apt Fluorescente Aptasensor

Om goede experimentele resultaten te verkrijgen, werden optimale experimentele condities gebruikt om CCRF-CEM te detecteren. Figuur 6a toont dat met het toenemende aantal CCRF-CEM van 0 tot 1 × 10⁷, de fluorescentie-intensiteit ook overeenkomstig toeneemt. Verder toont F/F₀ een duidelijke lineaire afhankelijkheid van het aantal CCRF-CEM in het bereik van 1 × 10²–1 × 10⁷ (Fig. 6b). De lineaire regressievergelijking is Y(F/F₀) = 3,2608 × log C − 5,1892 (waar C het aantal CCRF-CEM is) met de regressiecoëfficiënt R² = 0,9922. De detectielimiet wordt beschouwd als minder dan tien cellen. Daarom heeft GO-gebaseerde fluorescente aptamer-sensing een wijd detectiebereik zodat het kan worden gebruikt als een ideale biosensor om CCRF-CEM te detecteren. Vergeleken met andere methodes heeft deze methode hogere gevoeligheid (Tabel 1) [34,35,36,37,38,39].

Go-apt detectie van CEM-cellen. a Fluorescentie-emissiespectra van GO-apt fluorescente aptasensor in aanwezigheid van verschillende concentraties CCRF-CEM-cellen. b Lineaire relatie tussen de fluorescentie-intensiteit verhouding (F/F₀) en de concentratie van CCRF-CEM-cellen

Specificiteit van GO-apt Fluorescente Aptasensor

Om de specificiteit van GO-apt fluorescente adapters te onderzoeken, werden verschillende cellen gebruikt om het systeem te testen, zoals Ramos-cellen, H22-cellen en 293T-cellen. Elk van de 100-µL reactiesystemen bevatte 1 × 10⁶ cellen. Figuur 7 toont dat CCRF-CEM hogere fluorescentie-intensiteit krijgt dan de andere controlegroepen. De resultaten gaven ook duidelijk aan dat de ontworpen fluorescente aptasensor hoog specifiek is.

Specificiteit van de fluorescente aptasensor voor CEM. De fluorescentie-intensiteit verhouding (F/F₀) van GO-apt fluorescente aptasensor in aanwezigheid van CEM-cellen, Ramos-cellen, H22-cellen en 293T-cellen, respectievelijk (1 × 10⁶), waar F₀ en F de fluorescentie-intensiteit zonder en met detectiecellen bij 518 nm zijn. Excitatie 490 nm

Conclusies

We hebben een handige, goedkope en zeer gevoelige fluorescente aptasensor ontwikkeld voor detectie van CCRF-CEM-cellen. Deze strategie gebruikt slim de non-covalente binding via π-π stacking tussen grafene en enkelstrengs DNA en het superieure prestaties van grafene-kwetsing van fluorescentie. Vergeleken met de aptamer is de binding van het CEM-aptamer-complex aan GO zwak, zodat de door grafene gekwete fluorescentie geleidelijk hersteld kan worden. Onder geoptimaliseerde condities wordt de detectielimiet beschouwd als minder dan 100 cellen. Daarom, gebaseerd op zijn uitstekende prestaties, heeft de fluorescente aptasensor een breed perspectief in tumorcel-detectie.

Wijzigingsgeschiedenis

Afkortingen

AFM:

Atoomkrachtmicroscopie

CEM-apt:

CCRF-CEM-aptamer complex

FAM-apt:

FAM-gelabelde Sgc8 aptamer

FRET:

Fluoresceneresonantie-energieoverdracht

GO:

Grafene-oxide

GO-apt:

Grafene-oxide-aptamer complex

PBS:

Fosfaat-gebufferde zoutoplossing