Verbeterde osteoïnductiviteit met rhBMP-2-geladen zijdefibroïne skeletten voor botweefseltechniek

Samenvatting

Er is een groeiende vraag naar formuleringen van zijdefibroïne (SF) skeletten voor biomedische toepassingen. SF werd gekruist via glutaraldehyde met osteoïnductief rekombinant humaan botmorfogenetisch proteïne-2 (rhBMP2) in verschillende verhoudingen: (i) 3% SF zonder rhBMP2 (SF), (ii) 3% SF met gelijke hoeveelheid rhBMP2 (SF+BMP2), en (iii) 12% SF met 3% rhBMP2 (4SF+BMP2). Deze oplossingen werden gebruikt voor elektrospinning-gebaseerde fabricage van nanoskeletten om het verhoogde osteoïnductieve potentieel van SF-skeletten met rhBMP2 te evalueren. Spannings-vervormingsrelaties toonden aan dat er geen verlies is in mechanische sterkte van de vezels door toevoeging van rhBMP2, en de mechanische sterkte van het skelet verbeterde met toenemende concentratie van SF. De associatie met rhBMP2 verhoogde de waterretentiecapaciteit van het skelet, zoals gebleken uit zwelstudies. De levensvatbaarheid van hMSC's was hoger in geconjugeerde skeletten, en de skeletten vertoonden geen cytotoxiciteit tegenover gastcellen. Cellen vertoonden hogere alkaline fosfatase-activiteit in geconjugeerde skeletten onder zowel in vitro als in vivo omstandigheden, wat de verhoogde osteoïnductiviteit van de nieuwe construct bevestigt. De skeletten bleken ook effectief voor in vivo botformatie.

Achtergrond

De regeneratieve capaciteit van bot stelt herstel van kleine botbreuken vanzelf mogelijk. Bot wordt gevormd, gevolgd door consolidatie, en ten slotte herstel van de oorspronkelijke vorm. Deze capaciteit is echter beperkt, wat een vereiste creëert voor autogreffes of allogreffes voor behandeling. Allograftering omvat het verkrijgen van bot van een afzonderlijke donor, wat immuunreacties kan veroorzaken. Autograftering, waarbij bot uit het eigen lichaam van de patiënt wordt genomen, creëert geen immunologische problemen, maar is beperkt door de onvoldoende hoeveelheid beschikbaar bot.

Weefseltechniek wordt gezien als een potentiële technologie om de immunologische beperkingen van allograftering en autograftering te overwinnen. Met weefseltechniek worden gespecialiseerde cellen zoals humane mesenchymale stamcellen of osteosarcocellen (MG63) gekweekt onder een geschikte omgeving op een vooraf gefabriceerd skelet, en dit systeem van cellen en skelet wordt vervolgens als greffe gebruikt.

Het skelet biedt ankerpunten en een biochenische niche aan cellen voor overleving en proliferatie. Verschillende eigenschappen zoals mechanische sterkte, osteoïnductie, bioresorptie, gegradueerde porositeit en biocompatibiliteit moeten worden overwogen bij het selecteren van materialen voor skeletfabricage. Osteoïnductie (inductie van botformatie) is een van de vereiste eigenschappen van materialen voor de fabricage van botweefseltechnische (BWT) skeletten. Skeletten met osteogene factoren zijn krachtig voor het nabootsen van het botweefselregeneratieproces dat angiogenese en osteogenese koppelt, wat progenitorcellen kan rekruteren en differentiëren. Botmorfogenetische proteïnen (BMP's) zijn een klasse groeifactoren die botformatie induceren en worden voorgesteld voor BWT-toepassingen samen met gedemineraliseerd botmatrix (DBM) en calciumfosfaat.

Verschillende onderzoeksgroepen hebben het gebruik van metalen, keramieken, synthetische polymeren en composieten, en zijdefibroïne gerapporteerd als potentiële materialen voor skeletfabricage in BWT. Zijdefibroïne (SF) is gerapporteerd als een geschikt materiaal voor skeletfabricage voor weefseltechnische toepassingen vanwege de opmerkelijke mechanische en biocompatibele eigenschappen. Tot nu toe is geen rapport gepubliceerd dat de associatieve voordelen van BMP's met SF elektrogesponnen nanoskeletten evalueert.

Hier rapporteren we de fabricage van nieuwe rekombinante humane botmorfogenetisch proteïne-2 (rhBMP2)-geconjugeerde SF elektrogesponnen nanovezel-skeletten. De skeletten werden vergeleken met die van zuivere SF-skeletten om het effect van rhBMP2-conjugatie op osteoïnductie te verduidelijken. Cellenlevensvatbaarheid en celproliferatie-eigenschappen werden ook gemeten om de kracht van het skelet voor nieuwe en betere botweefseltechnische toepassingen vast te stellen.

Methoden

Bereiding van waterige oplossingen van SF/BMP2

Allereerst werd SF geïsoleerd uit de coconnen van de zijderups, Bombyx mori, als waterige oplossing. Het gevestigde protocol werd gevolgd met lichte aanpassingen. Coconnen werden 20 minuten gekookt in 100 mL 0,02 M Na₂CO₃ en daarna grondig gespoeld met gedestilleerd water om overmatige wateroplosbare sericine en was te verwijderen. Geëxtraheerde fibroïne werd vervolgens opgelost in 9 M lithiumbromide-oplossing bij 60 °C gedurende 4 uur en vervolgens gedialyseerd tegen water gedurende 4 dagen. De eindconcentratie werd bepaald door het droge materiaal te wegen na droging en bleek 7% w/v te zijn. Deze oplossing werd vervolgens geconcentreerd tot verschillende niveaus door dialyse tegen 1 L 25% polyethyleenglycol (PEG, 10.000 g mol⁻¹) oplossing bij kamertemperatuur. Verdunte SF waterige oplossingen werden bereid door verdunning met gedestilleerd water, en alle oplossingen werden opgeslagen bij 10 °C tot verdere verwerking. Lyofiliseerd poeder van rekombinant humaan botmorfogenetisch proteïne-2 (rhBMP2) werd opgelost in PBS (pH 3,8). De proteïneoplossing werd gesteriliseerd met 0,22 µm spuitfilters en als waterige oplossing toegevoegd aan elke fibroïneoplossing met continue roeren. Glutaraldehyde-gemedieerde kruising werd toegepast om BMP te associëren met fibroïne. Kort gezegd, voor een reactiemengsel van 10 mL werden 5 mL elk van 6% zijdefibroïne en 1% rhBMP2 gekruist met 200 µL glutaraldehyde en 40 µL 12 N HCl als groepactiverend middel. Met deze procedure werden drie oplossingen bereid: (i) 3% zijdefibroïne zonder rhBMP2 (SF), (ii) 3% zijdefibroïne met 0,5% rhBMP2 (SF+rhBMP2), en (iii) 12% zijdefibroïne met 0,125% rhBMP2 als in (ii) (4SF+rhBMP2). Deze oplossingen werden gebruikt in elektrospinning-procedures voor skeletfabricage.

Skeletfabricage door elektrospinning

Voor skeletfabricage werd elke oplossing geladen in een 5-mL glas spuit met een roestvrijstalen naald (25G, ID 0,26 mm, Sigma Aldrich) die verbonden is met een 5,5-kV DC-voeding. Voor de bereiding van vezels werd de uitlaatsnelheid gehandhaafd op 0,4 mL h⁻¹ met een spuitpomp, en elektrogesponnen vezels werden verzameld op aluminiumfolie op een afstand van 15 cm van de capillaire punt. De monsters werden 4 uur per keer verzameld.

Scanning elektronenmicroscopie

Voor morfologisch onderzoek van de bereide skeletten werd SEM uitgevoerd met Zeiss EVO40SEM. Monsters werden met goud gesputtercoated voordat scanbeelden werden verwerkt. Bepaling van vezeldiameter gebeurde door het gemiddelde van de diameters van 10 willekeurige vezels in het beeldframe te nemen.

Mechanische eigenschappen van het skelet

Compressie-experimenten werden uitgevoerd om de mechanische eigenschappen van de ontwikkelde skeletten te beoordelen met een Instron eencoloms tafelmodel elektromechanische tester (model 3345, Instron, Canton, MA). Vezels met 0,2 mm diameter, verkregen door elektrospinning gedurende langere tijd, werden gebruikt om de trekkracht en rek bij breuk te bepalen uit de spanning-vervormingscurves bij 25 °C en 50% vochtigheid.

Zwelstudie

Voor meting van de zwelverhouding werd elke formulering opgelost in PBS (pH 7,4) bij 37 °C. Monsters werden op vooraf bepaalde tijdstippen genomen, en het droge gewicht werd gemeten met een elektronische balans. De test werd voortgezet tot evenwichtsg gewicht bereikt was. De zwelverhouding werd uitgedrukt als: Zwelverhouding (%) = (Wₛ - Wₒ) / Wₒ, waarbij Wₒ = initiële drooggewicht van de nanovezelmatrices en Wₛ = gewicht van de gezwollen nanovezelmatrices op elk tijdstip.

Celkweek

Humane mesenchymale stamcellen (hMSC's) werden gebruikt in de huidige studie om het osteoïnductieve potentieel van de gefabriceerde nanoskeletten te evalueren. hMSC's werden gekweekt en onderhouden in DMEM met 10% fetale kalvessera en 1% penicilline, bij 37 °C in 5% CO₂ vochtige atmosfeer tot 90% confluentie bereikt was. Cellen werden vervolgens getrypsiniseerd, gecentrifugeerd, en opnieuw opgeschud in medium voor kwantificering.

Skeletten werden gesteriliseerd door te wassen met ethanol en bestraling met UV-licht gedurende 30 min en daarna gewassen met PBS (pH 7,4). Een behandeling met DMEM werd aan de skeletten gegeven voor celzaaiing. 20 µL celsuspensie werd druppelgewijs toegevoegd aan elk skelet en plastic film als controle. Skeletten werden in rust gehouden in vochtige atmosfeer (37 °C, 5% CO₂) gedurende 30 min. Vervolgens werden skeletten geïncubeerd in DMEM gedurende 21 dagen met regelmatige verversing van het medium om de twee dagen.

Celadhesie-assay

Om de adhesiecapaciteit van cellen met het skelet te beoordelen, werden de aantallen niet-geadheerde cellen geteld na 1, 3 en 6 uur na initiële zaaiing volgens de methode in de literatuur met lichte aanpassingen. Het celmedium werd verzameld en celtelling werd uitgevoerd met een hemocytometer. Het verschil tussen de initiële zaaitelling en het aantal niet-geadheerde cellen werd beschouwd als het aantal geadheerde cellen. Resultaten werden uitgedrukt in termen van percentage adhesie volgens de vergelijking: % Adhesie = (Initiële zaaiing - aantal niet-geadheerde cellen) / Initiële zaaiing × 100.

Cytotoxiciteitsassay

Om het toxische effect van nanovezelmatrices te meten, werd een MTT-assay uitgevoerd. Na de respectieve tijdsframen werden constructen geïncubeerd in MTT-oplossing (1 mg mL⁻¹ voorraadooplossing gedilueerd in PBS (pH 7,4) in een verhouding van 1:10) en geïncubeerd gedurende 4 uur. Levensvatbare cellen converteren MTT gedurende deze incubatieperiode in formazanzout. Het formazanzout werd opgelost door toevoeging van DMSO en 20 minuten apart gehouden. De absorbantie afkomstig van het formazanzout werd kwantitatief gemeten door veranderingen in absorbantie op 570 nm op te nemen met een microplaatlezer.

Celproliferatie-assay

Een Alamar blue (AB) kleurstofreductie-assay werd uitgevoerd om de proliferatie van cellen binnen het skelet te bepalen. Skeletten werden geïncubeerd in gekleurde DMEM gedurende 4 uur, en de reductie in kleurstof werd spectrofotometrisch gemeten. Percentage AB-reductie werd berekend volgens de gegeven formule.

ALP-assay

Alkaline fosfatase (ALP) productie door gekweekte hMSC's binnen het skelet werd gemeten volgens het fabricantprotocol in de kit. Kort gezegd, steriel PBS (pH 7,4) werd gebruikt voor wassen en incubatie van skeletten, gevolgd door homogenisatie met 1 mL Tris-buffer (1 M, pH 8,0), en sonificatie gedurende 3 min op ijs. 25 µL van het lysaat werd vervolgens geïncubeerd met 1 mL p-nitrofenylfosfaatoplossing (16 mM) bij 30 °C gedurende 5 min. Spectrofotometrische metingen werden uitgevoerd bij 405 nm om de productie van p-nitrofenol in aanwezigheid van ALP te monitoren.

In vivo ALP-activiteit

Negen mannelijke athymische naakte ratten, gewicht 100-120 g elk, werden genomen en bilateraal gedissecteerd aan de buikspieren om zakken te creëren. Een naakte muismodel werd gebruikt om het osteoïnductieve potentieel van het skelet in vivo te demonstreren. Eén van elk van de drie typen skeletten (5 mm × 5 mm) werd gesneden en apart in de spierzakken geplaatst. De zak werd vervolgens gesloten met een niet-resorbeerbare hechting. Na 14 dagen operatie werden implantaten verwijderd door de rectus abdominis spieren te exciseren en in PBS te bewaren. Spierflaps werden geëxcideerd, en explant-weefsel werd verkregen dat gehomogeniseerd werd in extractiebuffer om alkaline fosfatase vrij te maken. 50 µL aliquot van de oplossing werd gebruikt voor de meting van ALP-activiteit.

Statistische analyse

Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd, en gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie (SD) van monsters, tenzij anders vermeld. Eenrichtings variantieanalyse (ANOVA) werd uitgevoerd met statistische software Origin 6.0, om onzekere verschillen en significante verschillen te evalueren. P-waarde van 0,05 of minder duidt op significante verschillen tussen de studie groepen.

Resultaten

Morfologie van het skelet

SEM-beelden (Fig. 1) van het gefabriceerde skelet onthulden een fijn gesponnen nanovezelstructuur. De gemiddelde diameters van vezels in SF en SF+BMP2 skeletten blijken vergelijkbaar, variërend van 100 tot 900 nm, bij alle concentraties, aangezien de diameter een functie is van de tijd waarvoor elektrospinning werd uitgevoerd, terwijl SF nanovezels uniform bleken te zijn, en BMP2-conjugatie leidde tot non-uniformiteit in vezeldiameter. De poriegrootte van de skeletten lijkt homogeen in de gefabriceerde skeletten en onafhankelijk van de concentratie van fibroïne. De concentratie van SF beïnvloedt de poriegrootte niet significant.

Mechanische eigenschappen van het skelet

Spanning-vervormingscurves van nanovezel-skeletten worden weergegeven in Fig. 2. Er werd waargenomen dat toevoeging van BMP de mechanische eigenschappen van SF-skelet niet verandert, maar met toename van de concentratie van het fabricagemateriaal (SF), werd de trek-eigenschap van matrices verbeterd. Dit kan te wijten zijn aan de vorming van interfibre bindingen tijdens kruising. Laag-concentratie SF vezels vertoonden dus geen betere mechanische sterkte in vergelijking met hogere concentraties.

Zwelstudie

Zwelverhoudingen als functie van de tijd voor de skeletten werden weergegeven in Fig. 3. De skeletten zwollen goed met de tijd uniform aanvankelijk en bereikten evenwicht in ongeveer 380 min. rhBMP2-gekoppelde vezels absorbeerden meer water in vergelijking met SF-enkel skeletten, wat duidt op toename in hydrofiele pockets door BMP2-associatie. SF vezels balanceerden op ~70% terwijl BMP2-bevattende vezels balanceerden op ~81% water.

Celadhesie-assay

Adhesie van cellen aan het skelet is vereist voor de groei van cellen en inductie voor differentiatie. In deze studie observeerden we dat hMSC's goed adheerden aan de skeletten, en de adhesie van hMSC aan de 4SF-BMP2, SF-BMP2 en SF skeletten werd weergegeven in Fig. 4. Er was een zorg voor verlies in adhesie in het gemengde skelet wat uitgesloten werd met de waargenomen resultaten. Het mengen met BMP2 verlaagt niet de adherentiecapaciteit van het skelet. Zoals duidelijk uit Fig. 3, was het goed begrepen dat met een toename in poriegrootte (afname in concentratie van SF), adhesie van cel aan het skelet toeneemt. ANOVA onder de drie formuleringen differentieert significant variaties in de 3e en 6e uur. Er werd echter geen significant verschil waargenomen in het 1e uur.

Cytotoxiciteitsassay en celproliferatie-assay

Cellevensvatbaarheid was significant verhoogd in de rhBMP2-geconjugeerde skeletten, en de geconstrueerde skeletten creëren geen cytotoxische effecten op de gastcellen (Fig. 4), en cellen prolifereren goed in alle skeletten comparatief (Fig. 5). Er was een toenemende trend in levensvatbaarheid met aantal dagen, en SF+BMP2 skelet vertoonde de minst toxiciteit op elk tijdstip. ANOVA onthulde significant verschil tussen de waarden van cellevensvatbaarheid van de drie formuleringen.

Uit Fig. 6 kan celproliferatie worden onderzocht. Cellen prolifereren goed in alle drie skeletbereidingen met het beste in SF+BMP2 op elk tijdstip. Grotere poriën in SF + BMP2 skelet boden maximale ruimte voor groei van cellen. De significantie van verschillen tussen de groepen was goed vastgesteld vanuit ANOVA.

ALP-assay

ALP-activiteit is een standaard marker van osteoïnductieve eigenschap van de omgeving rond de cel. In ons experiment observeerden we een hogere ALP-activiteit in de SF+BMP2 constructen in vergelijking met SF-enkel constructen (Fig. 7). SF nano-gestructureerde skeletten waren in staat om osteoïnductie alleen te vertonen, maar zo duidelijk uit Fig. 7 en ANOVA, bleek SF+BMP2 skelet het beste te zijn onder de skeletten. De ALP-concentratie nam in de loop van de tijd van het experiment toe, en de constructen met hogere SF-concentratie vertoonden echter lagere ALP-activiteit in vergelijking met constructen met lagere SF-concentratie.

In vivo ALP-activiteit

Fig. 8 beeldt ALP-activiteit van explantaten voor (a) SF, (b) SF+rhBMP2, en (c) 4SF+rhBMP2. Zoals verwacht, induceerden explantaten van behandeling met rhBMP2 hogere ALP-activiteit terwijl rhBMP2-vrije skelet-behandelde muizen lagere ALP-activiteit produceerden.

Discussie

Skelet-gebaseerde weefseltechniek heeft haar potentieel in regeneratieve geneeskunde bewijzen en heeft indrukwekkende vooruitgang geboekt als hulpmiddel voor BWT. Eerdere studies hebben de cruciale rol van microarchitectuur en fysieke eigenschappen van structuren in het vertalen van in vitro-ontworpen cel-skelet constructen naar botweefsel vastgesteld.

Optimale mechanische eigenschappen (poriegrootte, trekkracht, etc.) en biocompatibiliteit van de constructen zijn potentiële kenmerken die overwogen moeten worden voor celkolonisatie en organisatie. Het gepresenteerde werk beschrijft fabricage en karakterisering van skelet voor botweefseltechniek gebruikmakend van combinatie van gunstige eigenschappen van materialen voorgesteld voor hetzelfde. Terwijl SF een geschikt sterke en biocompatibele platform biedt, induceert ingesloten rhBMP2 de formatie van nieuwe osteocyten. SF wordt uitgebreid bestudeerd door verschillende groepen in verschillende formuleringen voor osteoblastische celproliferatie en weefselregeneratie inclusief ligament, pees, kraakbeen, bot, lever, huid, trachea, hoornvlies, zenuw, trommelvlies, en blaas.

We hebben waterige oplossingen van SF en SF+rBMP2 gebruikt voor onze studie omdat waterige oplossingen bevorzugd worden boven organische oplosmiddelen voor bereiding van SF-oplossingen aangezien degradatie van SF ongunstig is in organische oplossingen. Elektrogesponnen SF vezels werden eerder gerapporteerd om homogene structuur van vezels met uniforme diameter te hebben, en het netwerk is sterk porieus met onderling verbonden en gekruiste poriën wat in nauwe overeenstemming is met onze studie. Er was geen observatie van vorming van parel-achtige structuren in SF vezels in onze skeletten en de eerder gerapporteerde. Diameter van de zuivere SF vezel werd eerder gerapporteerd om af te nemen met toename in mengsel; echter, we observeerden geen verlies in diameter door mengen. Maar uniformiteit van vezel werd gestoord in gemengde vezels mogelijk door onevenredige associatie van rBMP2 op de SF vezels.

Voldoende mechanische sterkte is een essentiële eigenschap voor een weefselskelet. Mengen van zuivere SF verhoogde de flexibiliteit van nanovezel in ons experiment, en eerdere rapporten onthulden ook een vergelijkbare trend in verbetering van mechanische eigenschappen bij mengen van SF met andere materialen om bruikbare gemengde biomaterialen te produceren. Dus, ons gefabriceerd skelet bezit de essentiële mechanische sterkte en flexibiliteit die vereist is in weefseltechnische toepassingen.

Skeletten voor weefseltechniek moeten in staat zijn om cellen erop te hechten, moeten celproliferatie en osteoïnductie faciliteren en moeten minstens cytotoxisch zijn voor betere acceptatie. Eerdere rapporten over SF skeletten hebben de niet-cytotoxische en celproliferatieve activiteiten ervan vastgesteld, en onze studies waren in nauwe overeenstemming met de eerder gerapporteerde resultaten.

Vanwege de osteoïnductieve eigenschappen wordt rhBMP2 gebruikt in botweefseltechniek door verschillende groepen. Deze studies hebben onthuld dat cellen gekweekt op BMP2-bevattende skeletten hogere ALP-activiteit bezitten, een biomarker van osteoïnductie. Het effect van BMP2-associatie was beter gecontrasteerd naarmate de incubatietijd vooruitschreed. Kim et al. gebruikten BMP2-geassocieerde porieuze microsferen en observeerden een vergelijkbare verbetering in osteoïnductie.

Conclusies

We hebben met succes SF-gebaseerde vezel-skeletten met rhBMP2 gefabriceerd. Deze skeletten waren homogeen en bleken voldoende mechanische eigenschappen en biocompatibiliteit te hebben. Verder attribuutte rhBMP2-associatie aan het osteoïnductieve potentieel van de gefabriceerde skeletten. De skeletten werden verder geëvalueerd voor in vivo toepassingen en bleken geschikt voor toepassingen met betrekking tot botweefseltechniek.

Afkortingen

ALP:

Alkaline fosfatase

BWT:

Botweefseltechniek

hMSC's:

Humane mesenchymale stamcellen

rhBMP2:

Rekombinant humaan botmorfogenetisch proteïne-2

SF:

Zijdefibroïne