DNA-tetraëder nanodragers versterken doxorubiccine-geïnduceerde apoptose in HT-29 darmkankercellen

Samenvatting

Als nanogrote geneesmiddel-drager met het voordeel van modifyerbaarheid en goede biocompatibiliteit, is DNA-tetraëder (DNA-tetra) afgifte veelbelovend om de inhibitieve efficiëntie van niet-getargete anticancer-geneesmiddelen te verbeteren. In dit onderzoek werd doxorubiccine (Dox) geassembleerd aan een foliumzuur-gemodificeerde DNA-tetra via klik-chemie om een gericht antitumor-agent te bereiden. Cellulaire opname-efficiëntie werd gemeten via fluorescente imaging. Cytotoxiciteit, inhibitie-efficiëntie en het bijbehorende mechanisme op darmkankercel-lijn HT-29 werden geëvalueerd door MTT-assay, celproliferatiecurve, western blot en flowcytometrie. DNA-tetra induceerde geen cytotoxiciteit, maar de cellulaire opname-ratio steeg duidelijk door DNA-tetra-gefaciliteerde penetratie door de celmembraan. Dienovereenkomstig verhoogde foliumzuur-DNA-tetra-Dox de antitumor-efficiëntie merkbaar met verhoogde apoptose-niveaus. In detail was 100 μM de effectieve concentratie en was een 6-uur incubatieperiode nodig voor apoptose-inductie. Concluderend, nano-grote DNA-tetraëder was een veilig en effectief afgifte-systeem voor Dox en versterkte de anticanker-efficiëntie overeenkomstig.

Achtergrond

Doxorubiccine (Dox) is een van de meest wijd gebruikte antineoplastische middelen, en talrijke klinische studies toonden aan dat Dox de groei van tumorcellen in diverse celdelingscycli aanzienlijk kan remmen door de synthese van RNA en DNA te inhibiteren. Eerdere studies suggereerden dat de proliferatie van tumorcellen effectief geblokkeerd werd in G1-fase, en metastase werd ook geremd door Dox bij een bepaalde concentratie. Bovendien kan effectieve inhibitie bereikt worden bij een relatief lagere dosis vergeleken met andere anticancer-geneesmiddelen. Echter, Dox induceert meestal bijwerkingen als gevolg van het gebrek aan specifieke targeting voor tumorcellen en niet-selectieve inhibitie van DNA en RNA, wat de klinische toepassingen serieus beperkt. Tegelijkertijd verlaagt de lage cellulaire opname-capaciteit de accumulatie van Dox in tumorcellen. Daarom moet een efficiënt afgifte-systeem voor Dox worden ontwikkeld om Dox specifieker en effectiever te targeten, makkelijker te encapsuleren, en voorzien van een uitstekende opname-capaciteit en biocompatibiliteit.

Nanogrote geneesmiddel-dragers, zoals liposomen en anorganische nanopartikels, kunnen Dox helpen de tumorcelmembraan te penetreren, wat de targeting-efficiëntie verbetert. Toch kan liposom-gebaseerde afgifte de bijwerkingen op normale cellen niet verminderen vanwege de relatief slechte targeting; anorganische dragers zoals mesoporöse silica-nanopartikels kunnen niet volledig biologisch afgebroken worden in vivo, wat het proces van verdere geneesmiddelopname belemmert en potentiële bio-toxiciteit met zich meebrengt. Voor deze functionele afgifte-systemen belemmeren de complexiteit van bereiding, inhomogeniteit van nanopartikel-structuren en lage encapsulatie-efficiëntie de klinische uitbreiding. Als nanogrote geneesmiddel-drager met uitstekende prestaties op geneesmiddelafgifte, kunnen DNA-gebaseerde structuren, zoals DNA-tetraëder (DNA-tetra), de membraan penetreren door de incompatibiliteit tussen elektro-negatief DNA en plasma-membraan te vermijden. Geneesmiddelen en targeting-moleculen kunnen beide covalent aan DNA-tetraëder gehecht worden. Bovendien vermijden de eenvoudige absorptie en biologische afbraak van DNA-tetraëder-sequenties lange retentie. Guanine-rijke aptamer-geneesmiddelen zoals AS1411 zijn met succes in A549-tumorcellen afgeleverd en functioneren als targeting-agenten en inhibitoren. Immuun-regulerende factoren zoals CpG en siRNA kunnen ook via DNA-tetra-dragers naar tumorcellen worden afgeleverd om immuunresponsen te reguleren. Met de voordelen van lage toxiciteit, goede biocompatibiliteit en afstelbare targeting, toont DNA-tetra bio-veiligheid en potentieel voor Dox-afgifte.

In deze studie werden functionele deeltjes van DNA-tetraëder geassembleerd met Dox als anticancer-geneesmiddel en foliumzuur als specifieke herkenning-moleculen, ontworpen, gesynthetiseerd en gekarakteriseerd. De anticanker-efficiëntie werd geëvalueerd op darmkankercellen rekening houdend met significant opgereguleerde folaat-receptoren op het celmembraan-oppervlak. Specifiek werden het niveau van cellulaire opname, de graad van Dox-geïnduceerde apoptose en de inhibitie op cellulaire proliferatie gemeten op HT-29-cellijnen.

Methoden

Reagentia en Apparatuur

DNA-oligonucleotide-ketens werden gekocht bij TAKARA in Dalian, China. Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) en foetale kalvesserum werden gekocht bij Gibco in NY, VS. Penicilline en streptomycine werden gekocht bij Beyotime biotechnologie in Shanghai, China. Foliumzuur, doxorubiccine, 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-difenyl-2H-tetrazoliumbromide (MTT) en agarose werden gekocht bij Sigma-Aldrich in MO, VS. Alle antilichamen werden gekocht bij Abcam Company in Shanghai, China. Overige reagentia werden gekocht bij Sinopharm Chemical Regent Co., Ltd., in Shanghai, China.

UV-Vis-spectrofotometer (Thermo Evolution 201) en constante-temperatuur-incubator werden gekocht bij Thermo Fisher in de VS; centrifugemachine (GT10-1) bij Beijing Era Beili Centrifuge Co., Ltd.; fluorescencespectrofotometer (UV-1800) bij Shimadzu Corporation. Confocale laserscanningmicroscopie (Visitech) bij Leica bedrijven; polymerase-kettingreactie-instrument (PCR, T100), eiwit-elektroforese en nucleïnezuur-elektroforese apparatuur bij Bio-Rad Company; dynamische-licht-deeltjesgrootte-analysator bij Beckman Company; celcultuurplaten met 96-put of 24-put bij Dow Corning Corporation. Hoge-prestatie vloeistof-chromatografie (HPLC, Agilent 1200) met C18-kolom bij Agilent Technologies.

De humane darmkankercel-lijn HT-29 werd onderhouden in DMEM aangevuld met 10% foetale kalvesserum, 100 U/mL penicilline en 100 μg/mL streptomycine in een verzadigde atmosfeer van 95% lucht en 5% koolstofdioxide bij 37 °C.

Synthese en Zuivering van DNA-tetraëder

In dit onderzoek volgde de synthese de schematische procedures in Fig. 1, en de enkelstreng-DNA (ssDNA) sequenties van DNA-tetraëder worden in Fig. 1 gegeven. In detail werd elke ssDNA opgelost in 0,5× TE-buffer, en de corresponderende optische dichtheid (OD) waarde van DNA werd bepaald door UV-spectrofotometrie bij 260 nm. Aanvullende TE-buffer werd toegevoegd om de vier ketens op dezelfde concentratie te brengen. Het mengverhouding van de vier ssDNA's was 1:1:1:1 bij 1 μM in 100 μL. De reactie werd uitgevoerd in een polymerase-kettingreactie (PCR) machine met de cycli: 95 °C, 10 min, natuurlijk afgekoeld tot 4 °C. Alle enkelstreng-DNA's werden gezuiverd door HPLC met 260 nm als karakteristieke absorptiepiek. In HPLC-spectrum was de piektijd van DNA-tetra sneller dan die van enkelstreng, en product werd verzameld op het corresponderende tijdstip.

Synthese en Karakterisatie van Foliumzuur-DNA-tetra-Dox

Vrije waterstofgroepen van Dox en foliumzuur werden gemodificeerd met azide-groep en daarna gekoppeld aan 3'-OH van ssDNA via klik-chemie-reactie. Door een ander hoeveelheid functionele-groep-getagde ssDNA toe te voegen, kon de verhouding van functionele groepen stoechiometrisch gecontroleerd worden via specifieke hybridisatie van zijketens. Voor synthese van foliumzuur-DNA-tetra, was de molaire verhouding van foliumzuur en DNA-tetraëder ingesteld als 1:1. Voor synthese van DNA-tetra-Dox, was de molaire verhouding van Dox en DNA-tetraëder ingesteld als 4:1. Voor synthese van foliumzuur-DNA-tetra-Dox, was de molaire verhouding van foliumzuur, DNA-tetraëder en Dox respectievelijk ingesteld als 1:1:3. Alle syntheses werden uitgevoerd op micromolaire niveau bij 37 °C en daarna opgeslagen bij 4 °C.

In deze studie werd de reeks DNA-tetra-complexen gekarakteriseerd door polyacrylamide-gel-elektroforese (PAGE) met 8% scheidingsgel (39% Acr-Bis) om de zuiverheid en relatieve moleculaire groottes te controleren. De monsters bestonden uit de verschillende DNA-tetra-structuren en 6× laadbuffer met mengverhouding 2:1. De monsters werden gekleurd en geanalyseerd na gel-elektroforese gedurende 90 min bij 110 V. Om de verschillen in deeltjesgroottes te achterhalen, werden DNA-tetra-monsters ook gescand door dynamische-licht-verstrooiings- (DLS) instrumenten met dynamisch licht.

DNA-tetra-gefaciliteerde Cellulaire Opname

Voor de verschillende koppelstructuren ontworpen in dit onderzoek, werden de opname-snelheden door HT-29-cellen vergeleken om de geneesmiddelafgifte-efficiëntie te achterhalen. Cellulaire opname-efficiëntie werd geëvalueerd en gekwantificeerd door gebruik te maken van het karakteristieke fluorescencespectrum van Dox, namelijk excitatielicht bij 470 nm en emissielicht bij 590 nm. HT-29-cellen bij 2 × 10⁵/mL werden gezaaid in 24-putplaten en gecultiveerd gedurende 24 uur. Cellen werden geïncludeerd met verschillende DNA-tetra-structuren bij 10 μM voor nog eens 24 uur. Het medium werd vervolgens verwijderd, en de cellen werden drie keer met PBS gespoeld. Voor celfixatie werd 4% paraformaldehyde direct toegevoegd bij kamertemperatuur voor een 30-min co-incubatie, en de cellen werden opnieuw drie keer met PBS gespoeld. Ten slotte werden de 24-putplaten waargenomen door lasersconfocale microscopie om de cellulaire opname-efficiëntie te vergelijken op basis van de lichtintensiteit van het emissielicht.

Cytotoxiciteit en Anticanker-efficiëntie

Cytotoxiciteit en anticanker-efficiëntie werden geëvalueerd met MTT-assay, waarbij een redoxreactie plaatsvindt tussen MTT in DMSO en intracellulaire succinaat-dehydrogenase. HT-29-cellen werden gezaaid in 96-put-cultuurplaten en gecultiveerd gedurende 24 uur.

Voor de cytotoxiciteit van DNA-tetra als geneesmiddel-drager, werd medium met DNA-tetra-structuren bij concentratie 0–100 μM toegevoegd voor nog 24- of 48-uurs incubatie. Vervolgens werd 100 μL MTT-oplossing (5 mg/mL) aan elke put toegevoegd, en het mengsel werd geïncludeerd bij 37 °C gedurende 4 uur. De vloeistof werd vervolgens verwijderd, en de cellen werden gelyseerd en opgelost met 200 μL DMSO. De absorbantie van het supernatans werd gemeten bij 570 nm door Microreader. Het onbehandelde HT-29-monster werd beschouwd als controle-groep.

Voor de DNA-tetraëder gekoppeld met foliumzuur of Dox, aan de ene kant richtte het onderzoek zich op stabiliteit, bio-veiligheid en inhibitie-efficiëntie; aan de andere kant, of de Dox van DNA-tetra-Dox vergelijkbare antitumor-eigenschappen heeft als voorheen, werd ook verkend. Daarom werden cytotoxiciteit en antitumor-efficiëntie van DNA-tetra-complexen geëvalueerd. Complexen respectievelijk bij 100 μM werden geïncludeerd met HT-29-cellen. Celmonsters werden elke 6 uur verzameld en vervolgens gedetecteerd door MTT-assay om het effect van incubatieperiode te evalueren. Bijzondere aandacht werd besteed aan het verschil in anticanker-efficiëntie als gevolg van structuurvariaties. Verder werden concentratie-effecten op inhibitie van HT-29 na behandeling met foliumzuur-DNA-tetra-Dox geëvalueerd bij 0–200 μM via MTT-assays.

Western Blot en Flowcytometrie

Om de cellulaire apoptose geïnduceerd door Dox gefaciliteerd door DNA-tetra-afgifte te karakteriseren, werden eiwitmonsters van behandelde cellen verhit en gekraakt met pyrolyse-vloeistof, geanalyseerd door 12% SDS-PAGE onder de voorwaarde van 100 V bij constante stroom om monsters te scheiden, en daarna geblottet naar 0,22-μm-diameter PVDF-membranen gedurende 1 uur. De monsters werden geblokkeerd met gemelkte melk gedurende 1 uur. Na driemaal wassen met PBST, werden monsters overnachten geïncludeerd met konijn anti-caspase-3. Vervolgens werden de monsters getest met een geit-anti-konijn IgG secundair antilichaam gedurende 1 uur en daarna gewassen met PBST en gebeeld via Bio-Rad eiwit-imaging-systeem. Verder werd GAPDH gekozen als interne referentie-eiwit vanwege de stabiele expressie in cellen.

Flowcytometrie werd verder gebruikt om de apoptose-niveaus te kwantificeren bij de geselecteerde concentratie en tijdstip via MTT-assays. HT-29-cellen werden geïncludeerd met inhibitoren voor een periode en daarna gemeten via kwantitatieve flowcytometrie met Annexin V-PI dubbele kleuring-methode.

Celproliferatie Kwantificering

Celtelmethode werd gebruikt om de celproliferatie in de tijd te kwantificeren. In detail, na behandeling met foliumzuur-DNA-tetra-Dox gedurende een periode bij 100 μM, werden cellen verteerd door 0,25% trypsine gedurende 30 s, en vervolgens werd evenveel volmedium toegevoegd om de reactie te beëindigen. Supernatans werd verwijderd na centrifugatie bij 1000 toer/min gedurende 3 min, en cellen werden opnieuw opgelost in volmedium. Het aantal cellen in elk detectiepunt werd vastgelegd onder optische microscopie met celtelplaten, om de cellulaire proliferatiecurve te tekenen.

Statistische Analyse

In dit onderzoek werden significanties van verschillen bepaald met Student's t-toets (tweezijdig; tweemonster gelijke variantie). P < 0,05 betekent significante verschillen tussen verschillende groepen.

Resultaten

Bereiding van Foliumzuur-DNA-tetra-Dox

In specifiek syntheseproces werd Dox gemengd met DNA-tetraëder in verschillende verhoudingen om laden en assembleren van Dox (w_m = 543,52) en foliumzuur (w_m = 441,4) te voltooien. Zoals getoond in Fig. 2a, doordat Dox en foliumzuur monomeren zijn met relatief lage en vergelijkbare molecuulgewichten, had DNA in een tetraëder en de conjugaten met één functioneel molecuul ruwweg equivalente molecuulgewichten. Echter, Dox of foliumzuur assembleren met alle vier de DNA-hoekpunten van de tetraëder maakte de molecuulgrootte van DNA-tetra duidelijk toenemen. Zoals getoond in Fig. 2b, was de meeste DNA-tetraëder-monomer-grootte kleiner dan 15 nm. Met de toename van koppelgroepen werd de symmetrische structuur van DNA-tetra verstoord en steeg de mediaan van de deeltjesgroottes van samengestelde stoffen significant. In het bijzonder, grootte-uitbreiding van foliumzuur-DNA-tetra-Dox verlengde de mediaan van de diameter tot 20 nm.

Geneesmiddelafgifte-efficiëntie

Na 24 uur incubatie met verschillende DNA-tetra-structuren, werd de intracellulaire efficiëntie van Dox geëvalueerd met fluorescente imaging, waarbij de intracellulaire rode fluorescentie de karakteristieke fluorescentie van Dox is; dus cellen geïncludeerd met DNA-tetra vertoonden geen fluorescentsignaal zoals getoond in Fig. 3a, en de rode signalen van cellen geïncludeerd met foliumzuur-DNA-tetra-Dox en DNA-tetra-Dox-complexen waren aanzienlijk hoger dan die met Dox, wat de aanzienlijk verhoogde cellulaire opname-efficiëntie van Dox aantoont als gevolg van de DNA-tetra-gefaciliteerde penetratie door de membraan, alsmede de intracellulaire stabiliteit van de conjugaten tussen Dox en DNA-tetra.

Cytotoxiciteit en Anticanker-efficiëntie

Allereerst werd de levensvatbaarheid van HT-29-cellen geïncludeerd met verschillende concentraties DNA-tetra onderzocht met MTT-assay. Er was geen duidelijke cytotoxiciteit van DNA-tetra-behandeling in HT-29-cellen bij 0–100 μM gedurende 24 en 48 uur (Fig. 4a). Dus leverde de nanogrote DNA-tetraëder een bio-veilig geneesmiddel-drager-platform.

Ten tweede, als gevolg van het verschil in Dox-afgifte-efficiëntie, vertoonden foliumzuur-DNA-tetra-Dox en DNA-tetra-Dox significantere inhibitie-efficiëntie binnen 48 uur (Fig. 4b). Vanwege het gebrek aan effectieve anticancer-componenten leidde DNA-tetra-foliumzuur tot verwaarloosbare afname (< 10%) van levensvatbaarheid tijdens de 48-uurs co-incubatie. Omdat Dox de membraan niet objectief kan penetreren, was Dox-geïnduceerde afname van cellulaire levensvatbaarheid minder dan de andere groepen. In het bijzonder, foliumzuur-DNA-tetra-Dox toonde een vroegere en significante afname bij 6 uur post-incubatie, wat bewijst dat foliumzuur-targeting de geneesmiddelen helpt zich op de membraan te vestigen en Dox sneller effect laat uitwerken. In tegenstelling, DNA-tetra-Dox begon pas duidelijk effect te tonen bij 12 uur post-incubatie, wat het belang van targeting-groepen aantoont.

Verder werden HT-29-cellen behandeld met foliumzuur-DNA-tetra-Dox bij 0–200 μM om de effectieve concentratie te detecteren (Fig. 4c). Cellulaire levensvatbaarheid van HT-29-cellen daalde snel met toenemende concentratie (0–100 μM) van het complex, maar er waren geen significante verschillen tussen de concentratie van 100 en 200 μM, wat een dosis-afhankelijke manier van foliumzuur-DNA-tetra-Dox aangeeft, waarbij 100 μM beschouwd kan worden als een effectieve concentratie voor antitumor-effect. Bovendien veranderde cellulaire levensvatbaarheid significant van 24 tot 48 uur voor de groepen van 10, 20 en 50 μM, wat aangeeft dat de incubatieperiode ook een factor was die de foliumzuur-DNA-tetra-Dox-gebaseerde anticanker-efficiëntie beïnvloedde.

Apoptose Geïnduceerd door Foliumzuur-DNA-tetra-Dox

Dienovereenkomstig, gebaseerd op western blot-assays (Fig. 5a), was er een significante toename van de expressie van caspase-3 geïnduceerd door foliumzuur-DNA-tetra-Dox en DNA-tetra-Dox, wat bewijst dat apoptose de hoofdweg was van Dox-geïnduceerde celdood.

De flowcytometrie (Fig. 5b–e) bewijst verder dat 6-uurs incubatie met foliumzuur-DNA-tetra-Dox bij 100 μM 68,7% apoptose induceerde. Terwijl de apoptose-niveaus geïnduceerd door Dox en DNA-tetra-Dox slechts 32,8 en 60,5% waren met dezelfde incubatie-omstandigheden.

Inhibitie op Celproliferatie

Gebaseerd op de MTT-assays, was 100 μM de effectieve concentratie voor apoptose-inductie en geselecteerd in het celproliferatie-experiment. Zoals getoond door de cellulaire proliferatiecurve (Fig. 6), door het tijdrovende proces van cellulaire opname, was de inhibitie op celproliferatie niet volledig zichtbaar tijdens het vroege stadium van co-incubatie. Een significatieve inhibitieve effect werd gepresenteerd na incubatie met foliumzuur-DNA-tetra-Dox gedurende meer dan 6 uur, wat het bestaan van DNA-tetra-verbeterde endocytose bewijst. Tegelijkertijd is 6 uur een vergelijkbare tijdsperiode met de effectieve periode gedetecteerd in Fig. 4b.

Discussie

Als gangbare methode van DNA-modificatie, was klik-chemie-reactie van voordeel door hoge reactie-efficiëntie, goed-controleerbaarheid en eenvoudige bediening. Elektroferogram getoond met een enkele band (Fig. 2a), wat aangeeft dat producten met hoge zuiverheid verkregen werden door covalente koppeling via klik-chemie-reactie. De fluorescente eigenschap van Dox maakt het traceerbaar in vitro en in vivo; tegelijkertijd bewijst de fluorescentie binnen de tumorcellen indirect de stabiliteit van foliumzuur-DNA-tetra-Dox tijdens het proces van penetratie door de celmembraan. Daarom was foliumzuur-DNA-tetra-Dox capabel en stabiel voor biomedische toepassingen.

DNA-tetra heeft de capaciteit om geneesmiddelen in cellen te leveren. Alle DNA-sequenties gebruikt in dit onderzoek waren niet gecodeerd voor enige genetische informatie. Dus werden geen bijwerkingen op zowel genexpressie als celmetabolisme gerapporteerd in alle examinaties. Tegelijkertijd, door de hoge expressie van folaat-receptor op oppervlak van tumorcellen, is foliumzuur geselecteerd als specifieke targeting-moleculen van het geneesmiddelafgifte-systeem om de opname-efficiëntie van DNA-tetra-complexen te verbeteren. Echter, onder de omstandigheden van DNA-tetra bij relatief hoge concentratie, werd het voordeel van folaat-receptor-targeting niet volledig weerspiegeld in vitro. Dienovereenkomstig, voor in-vivo toepassing was foliumzuur potentieel om de targeting-efficiëntie in het complexe circulerende systeem te verbeteren.

Op dit moment brengen anticancer-geneesmiddelen vaak onverwachte bijwerkingen met zich mee, dus het onderzoek naar het verbeteren van tumorcel-targeting-vermogen en afgifte-efficiëntie is een hot topic. Eerdere studies toonden aan dat de capaciteit van DNA-tetraëder voor het dragen van geneesmiddelen gebaseerd was op zijn goede compatibiliteit. DNA-tetraëder is een kunstmatige container van gunstige modifyerbaarheid en goede biocompatibiliteit. In deze studie bereikte de succesvolle koppeling van Dox en foliumzuur met DNA-tetraëder bevredigende inhibitieve effecten en leidde tot duidelijke apoptose van HT-29-cel. Omdat DNA-tetra gemodificeerd en gekoppeld kan worden met geneesmiddelen en targeting-moleculen, werd de verrijking van lokale geneesmiddelconcentratie in tumorcel gerealiseerd. De bovenstaande resultaten bewijzen de goede herkenning voor tumorcellen en corresponderende versterkte inhibitieve effect via DNA-tetra-afgifte, en dit nanogrote geneesmiddelafgifte-systeem kan uitgebreider gebruikt worden.

Conclusies

Als nieuw ontwikkelde geneesmiddelafgifte-strategie, zijn nanogrote DNA-structuren van lage kosten, hoge stabiliteit en haalbaarheid om te synthetiseren; tegelijkertijd is het bio-veilig door het gebrek aan exogene immuunactiviteit. DNA-tetraëder-koppelstrategie vergemakkelijkt de gerichte afgifte van Dox, versterkt de anticanker-efficiëntie van Dox op darmkankercellen, en biedt een veelbelovende inspiratie en idee voor geneesmiddelontwerp.