Gerichte Kankerlevering: Decoreren van Nanovesikels met pHLIP voor Herkenning vanzure Tumormicro-omgeving

Samenvatting

Zuurheid aan het oppervlak van kankercellen is een kenmerk van tumormicro-omgevingen, wat niet afhangt van tumorperfusie, dus kan het dienen als algemene biomarker voor het targeten van tumorcellen. We gebruikten het pH (laag) insertie peptiide (pHLIP) voor decoratie van liposomen en niosomen. pHLIP zintuigt pH aan het oppervlak van kankercellen en insert in het membraan van getargette cellen, en brengt nanomateriaal in nabijheid van het cellulaire membraan. DMPC liposomen en Tween 20 of Span 20 niosomen met en zonder pHLIP in hun coating werden volledig gekarakteriseerd om fundamenteel inzicht te verkrijgen in nanodragerkenmerken en het rationele ontwerp van zuurheidsgevoelige nanovectoren te vergemakkelijken. De stabiliteit van de monsters over tijd en in aanwezigheid van serum werd gedemonstreerd. De grootte, ζ-potentiaal, en morfologie van nanovectoren, evenals hun vermogen om een hydrofiele probe in te sluiten en de afgifte te moduleren, werden onderzocht. pHLIP gedecoreerde vesikels zouden nuttig kunnen zijn om een verlengde (gewijzigde) afgifte van biologisch actieve stoffen te verkrijgen voor het targeten van tumoren en andere zurre ziekteweefsels.

Inleiding

Ongeveer een eeuw geleden droeg Paul Ehrlich het idee voor van het realiseren van "magische kogels" voor specifieke en effectievere levering van geneesmiddelen [1]. De "magische kogels" zouden in staat moeten zijn het geleverde geneesmiddel te beschermen tegen een harde omgeving, de bijwerkingen te verminderen door het geneesmiddel te richten op ziekteweefsel, de farmacokinetiek en farmacodynamica van het geneesmiddel te verbeteren, en de afgifte van het geneesmiddel te moduleren [2].

In 1965 observeerde Bangham fosfolipide-gebaseerde vesikels voor het eerst [3] en in de daaropvolgende jaren vestigde Gregory Gregoriadis het concept dat liposomen geneesmiddelen kunnen encapsuleren en dan gebruikt kunnen worden als geneesmiddelleveringssystemen. In het bijzonder zijn ze samengesteld uit fosfolipide gesloten bilagen (lamellen), waar de hydrofobe lipidenketens gesloten zitten tussen twee hydrofiele kopgroepenlagen. De gesloten bilage omringt een waterige kern, wat respectievelijk de lokalisatie van lipofiele of hydrofiele geneesmiddelen toelaat [4, 5].

Lipoomgrootte is een kritische parameter die het lot van de drager na toediening beïnvloedt, in termen van plasma-eiwitafsorptie, herkenning door reticulo-endotheliale systeem (RES), circulatie halfwaardetijd, en cellulaire verkeersstromen. Nanosized dragers kunnen celinternalisatie en tumortargeting bevorderen, dus veel onderzoekers hebben zich gericht op "nanonisatie" [6,7,8,9].

Om meer veelzijdige en economische nanodragers te verkrijgen, zijn synthetische surfactanten gebruikt om liposoom-achtige geneesmiddelleveringssystemen te verkrijgen. Non-ionische surfactanten worden wijd gebruikt voor dit doel en zijn in staat zich zelf te assembleren in unilamellaire of multilamellaire vesikels (non-ionische liposomen, niosomen, of non-ionische surfactanten vesikels). Sorbitanestersurfactanten (Spans®) zijn lipofiele stoffen wijd gebruikt in niooom preparatie. Om de circulatiетijd van de vesikels te verlengen en "stalth" nanodragers te verkrijgen, is polyethyleenglycol (PEG) incorporatie een gouden standaard benadering: door deze conjugatie worden ethoxyethylatesorbitanestersurfactanten (Tweens®) verkregen. Zowel Span als Tween worden gekenmerkt door een ander hydrofiel/lipofiel balans (HLB) waarde en de keuze van de surfactant maakt het mogelijk om niosomen met de gewenste eigenschappen te prepareren [10]. Verder wordt de toevoeging van cholesterol gebruikt voor de verbetering van de bilagestabiliteit door de surfactantensterten uit te rekken, wat de gel-naar-vloeistof faseovergangstemperatuur van de surfactant beïnvloedt en rigiditeit van de lipofiele bilage verleiht [11, 12]. De "geoptimaliseerde" nanodrager is ontworpen om de formulering te verbeteren en/of targeting te verbeteren [10].

Tegenwoordig is kanker een van de belangrijkste doodsoorzaken in de wereld. Huidige therapeutische benaderingen hebben een aantal beperkingen waaronder niet-efficiënte geneesmiddellevering aan tumoren en gebrek aan tumortargeting geassocieerd met ongewenste en gevaarlijke bijwerkingen, wat nanotechnologiebenaderingen kunnen helpen overwinnen [13].

Momenteel zijn diverse targetingbenaderingen in ontwikkeling. De meeste ervan zijn gebaseerd op het targeten van specifieke biomerkers die overexprimeerd zijn aan het oppervlak van kankercellen. Echter, vanwege het feit dat humane tumoren zeer heterogeen zijn, zullen meer algemene benaderingen van tumortargeting veel meer voordelig zijn. Zuurheid aan het oppervlak van kankercellen is een kenmerk van tumormicro-omgevingen, en het hangt niet af van tumorperfusie, dus kan het dienen als algemene biomarker voor het targeten van tumorcellen [14]. pH (laag) insertie peptiide (pHLIP) technologie ontwikkelt zich snel voor het targeten van imaging en therapeutische kleine moleculen, alsook nanomaterialen naar tumoren. pHLIP zintuigt pH aan het oppervlak van kankercellen en insert in het membraan van getargette cellen [15, 16]. Het insertiemechanisme van pHLIP wordt getriggerd door de protonering van negatief geladen residuen van het peptiide bij lage pH (pH < 7,0). Dit leidt tot een toename van de hydrofobiciteit van het peptiide, wat het evenwicht verschuift naar partitionering van het peptiide in de bilage [17]. Nanodragers gedecoreerd met pHLIPs zijn biocompatibel, kunnen tumoren targeten, en tonen versterkte cellulaire opname door kankercellen. Onder de onderzochte pHLIP-gecoate nanopartikels zijn lipide, polymere en metaal-gebaseerde nanomaterialen [18,19,20,21].

Het doel van het huidige werk is om nieuwe vesiculaire nanodragers gedecoreerd door pHLIP volledig te karakteriseren om fundamenteel inzicht te verkrijgen in nanodragerkenmerken en het rationele ontwerp van zuurheidsgevoelige nanovectoren te vergemakkelijken.

Materialen en Methodes

Materialen

Polyoxyethylenesorbitan monolauraat (Tween 20), sorbitan monolauraat (Span 20), cholesterol (Chol), Hepes zout {N-(2-hydroxyethyl)piperazine-N'-(2-ethaanzuur)}, humaan serum, Sephadex G-75, calceïne, en difenylhexatrieen (DPH) werden aangeschaft bij Sigma-Aldrich. 1,2-Dimyristoil-sn-glycero-3-fosfocholine (DMPC) en 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamine-N-[4-(p-maleimidofenyl)butyramide] natriumzout (DSPE-maleimide) werden aangeschaft bij Avanti Polar Lipids en pyreen werd verkregen van Fluka. pHLIP peptiide (ACEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT) werd gesynthetiseerd en gezuiverd door CS Bio. Alle andere producten en reagentia waren van analytische graad.

Synthese van DSPE-pHLIP

pHLIP geconjugeerd met DSPE lipiden in methanol door de covalente conjugatie van DSPE-maleimide met de enkele cysteïne rest aan de N-terminus van pHLIP, zoals eerder beschreven [18, 21, 22]. Kortweg, 5 mg peptiide opgelost in 250 μL methanol (afgeblazen met argon) en DSPE-maleimide (uit 9,9 mM voorraadsoplossing) opgelost in chloroforme werden gemengd in een molaire verhouding van 1:1. Reactiemengsel werd bij kamertemperatuur gehouden gedurende ongeveer 2-6 uur tot de conjugatie voltooid was. De reactievoortgang in conjugatie van DSPE-maleimide met pHLIP werd gemonitord door RP-HPLC gebruikmakend van een gradiënt van 25 tot 80% acetonitrile in water bevattende 0,05% TFA door een daling van de piek te monitoren die overeenkomt met het ongelabelde pHLIP in het reactiemengsel. De gesynthetiseerde construct werd gekarakteriseerd door SELDI-TOF massaspectrometrie. De concentratie van DSPE-pHLIP conjugaat werd bepaald door absorbantie gebruikmakend van de molaire extinctiecoëfficiënt voor pHLIP: ε₂₈₀ = 13.940 M⁻¹ cm⁻¹.

Vesikel Preparatie en Zuivering

De dunne laag verdampingsmethode werd gebruikt om non-ionische surfactanten (van Tween 20 of Span 20) en fosfolipide (van DMPC) vesikels te prepareren, met en zonder pHLIP. In elke vesikelformulatie werd cholesterol toegevoegd in verschillende molaire verhoudingen (Tabel 1) [23].

Monster samenstelling is geoptimaliseerd door het kiezen van eerdere goed gekarakteriseerde structuren [24, 25] waar hetzelfde bedrag pHLIP is toegevoegd.

De lipofiele componenten werden eerst opgelost in CHCl₃:CH₃OH mengsel (3:1); het organische oplosmiddel werd vervolgens onder vacuüm verwijderd bij verschillende temperaturen afhankelijk van het monster. De verkregen film werd gehydrateerd met 5 mL Hepes buffer (0,01 M pH 7,4) of natrium calceïne oplossing 10⁻² M. De suspensie werd voor ongeveer 5 minuten vortex-gemengd, gevolgd door sonicatie (zie Additioneel bestand 1: Tabel S1, ondersteunende informatie) gebruikmakend van een microprobe werkend op 20 kHz (VibraCell-VCX 400-Sonics, Taunton, MA, USA). LipoDMPC sonicatie werd uitgevoerd onder inerte atmosfeer om oxidatie te voorkomen.

De vesikelsuspensie werd vervolgens gezuiverd door gelpermeatie chromatografie gebruikmakend van Sephadex G-75 (glazen kolom van 50 × 1,2 cm) en Hepes buffer als eluent. Daarna werd de gezuiverde vesikelsuspensie gefiltreerd door middel van cellulase filters met de passende poriendiameter.

Deze zelfde preparatiemethode werd gebruikt om pHLIP-gecoate niosomen en liposomen te prepareren.

Dynamische Lichtverstrooiing Metingen

De gemiddelde grootte en grootteverdeling van de vesikels werden gemeten bij T = 25 °C door dynamische lichtverstrooiing (DLS), gebruikmakend van een Malvern NanoZetaSizer ZS90, uitgerust met een 5 mW HeNe laser (golfengte λ = 632,8 nm) en een digitale correlator. De genormaliseerde autocorrelatiefuncties van de verstrooide intensiteit bij 90° hoek werden geanalyseerd door het Contin algoritme om de verdeling van de deeltjesdiffusiecoëfficiënt D te verkrijgen, dus de verdeling van de effectieve hydrodynamische straal R_H van de vesikels via de Stokes-Einstein relatie R_H = K_B T/6πηD, waar K_B T de thermische energie is en η de oplosmiddelviscositeit. De breedte van de grootteverdeling van niosomen/liposomen is vrij klein maar niet te verwaarlozen. De waarden gerapporteerd in Tabel 2 corresponderen met de intensiteit-gewogen gemiddelde hydrodynamische diameter van de deeltjes [26].

ζ-Potentiaal Metingen

De electroforetische mobiliteitsmetingen werden uitgevoerd door de laser Doppler electroforese techniek, gebruikmakend van het Malvern NanoZetaSizer ZS90 apparaat. De mobiliteit u werd omgerekend in het ζ-potentiaal gebruikmakend van de Smoluchowski relatie ζ = uη/ε, waar η en ε de viscositeit en de permitiviteit van de oplosmiddelfase zijn, respectievelijk [27].

Kleine Hoek Röntgenverstrooiing

Kleine hoek Röntgenverstrooiing (SAXS) experimenten werden uitgevoerd bij European Synchrotron Radiation Facility (ESRF, Grenoble, Frankrijk). Het gebruik van de ID02 high-brilliance beamline maakte het mogelijk om metingen uit te voeren op verdunte oplossingen in het gebied van impulsoverdracht 0,1 nm⁻¹ ≤ q ≤ 6 nm⁻¹, q = (4π/λ)sin(θ/2), waar θ de verstrooiingshoek is en λ = 0,1 nm de Röntgengolfengte. De corresponderende onderzochte lengteschaal ligt tussen 1 en 60 nm, geschikt voor toegang tot de interne structuur van niosomale en liposomale vesikels in oplossing. Alle experimenten werden uitgevoerd bij T = 25 °C met korte bestralingstijd, 0,1 s, om stralingsbeschadiging te voorkomen. Voor elk monster werd de verstrooide intensiteit bij verschillende verstrooiingshoeken vastgelegd op een 2D detector, dan hoekmatig hergroeperd, gecorrigeerd voor de achtergrond en oplosmiddelbijdragen, en geanalyseerd om informatie te verkrijgen over de vorm en interne structuur van de vesikels in oplossing.

In het geval van unilamellaire vesikels, werd de gesloten bilage gemodelleerd met drie concentrische schillen corresponderend met de externe kopgroepen, de hydrofobe ketens en de interne kopgroepen. Een Schulz-verdeling voor de vesikelgrootte werd aangenomen.

Cryo-TEM

Vesikeloplossing (5 μL druppel) werd uitgebreid op een Lacey formar/koolstof elektronenmicroscopie rooster en bewaard in een bevroren-gehydrateerde toestand door snelle bevriezing in vloeibaar ethane. Het vitrificatieproces werd uitgevoerd met FEI Vitrobot systeem met de instelling van een enkele blot van 3 s, een offset van 1, en afvoer en wachttijd van 1 s. Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) (JEOL 2100) met een versnellingsspanning van 200 kV bij vergrotingen in het bereik van × 10.000 tot × 150.000 werd gebruikt om vesikels te visualiseren.

Stabiliteitsstudies

Fysieke stabiliteitsstudies van niosomen en liposomen, bereid met en zonder pHLIP, werden uitgevoerd bij twee verschillende opslagtemperaturen (25 °C en 4 °C). Het doel was om te evalueren of significante veranderingen in grootte en ζ-potentiaal van de vesikeldispersie optreden over een periode van 90 dagen. Monsters uit elke batch werden op vaste tijdstippen (1, 30, 60 en 90 dagen) onttrokken en de vesikelgrootte en ζ-potentiaal werden bepaald zoals eerder beschreven.

Op dezelfde manier werd de stabiliteit van de monsters ook onderzocht in de aanwezigheid van biologische vloeistoffen, zoals humaan serum. De suspensies werden in contact gebracht met 45% humaan serum bij 37 °C. Op vaste tijdstippen (0, 30 min, 1 uur, 2 uur en 3 uur) werden variaties in vesikelgrootte en ζ-potentiaal bepaald zoals beschreven.

Bilage Karakterisering

Vloeibaarheid en microviscositeit-polariteit van niosomale en liposomale bilagen werden benaderd door fluorescentiemetingen van twee fluorescente probes, difenylhexatrieen (DPH) en pyreen, respectievelijk, gelokaliseerd in de hydrofobe regio van het membraanmembraan. Zowel DPH (2 mM) als pyreen (4 mM), 220 μL en 2,5 mg respectievelijk, werden toegevoegd aan de surfactanten of fosfolipide/cholesterol mengsel voor vesikelpreparatie [28]. Daarna werden pyreen-geladen vesikels gezuiverd zoals eerder beschreven, terwijl DPH-geladen vesikels gefiltreerd werden door progressief kleinere poriendiameter (van 5,0 tot 0,22 μm).

De fluorescentie-anisotropiemetingen werden uitgevoerd bij kamertemperatuur gebruikmakend van een LS55 spectrofluorometer (PerkinElmer, MA, USA) bij λ_exc = 400 nm en λ_em = 425 nm en de fluorescentie-anisotropie (A) van monsters werd berekend volgens de volgende vergelijking [29]:

waar I_vv en I_vh de intensiteiten van de geëmiteerde fluorescentie (arbitraire eenheden) zijn, respectievelijk parallel en loodrecht op de richting van de verticaal gepolariseerde opwekkingslicht. De correctiefactor G = I_hv/I_hh is de verhouding tussen de verticaal en horizontaal gepolariseerde emissiecomponenten wanneer het opwekkingslicht horizontaal gepolariseerd is. De fluorescentie-anisotropiewaarden zijn omgekeerd evenredig met de membraanvloeibaarheid. Daarom correspondeert een hoge fluorescentie-anisotropiewaarde met een hoge structurele orde en/of lage membraanvloeibaarheid [30].

Om de microviscositeit en de micropolariteit van de vesikelbilage te evalueren, werden fluorescentie-experimenten met pyreen uitgevoerd met een Perkin-Elmer LS55 spectrofluorometer bij λ_exc = 330 nm, het emissiespectrum opnemend in het bereik 350 < λ_em < 550 nm [28]. De fijne structuur van pyreen fluorescentie presenteert vijf pieken. De verhouding tussen de intensiteiten van de eerste (372 nm) en de derde (382 nm) trillingbanden van het pyreen fluorescentiespectrum, I₁/I₃, is gerelateerd aan de polariteit van de pyreen omgeving [31]. Inderdaad, lage waarden van de I₁/I₃ verhouding corresponderen met een apolaire omgeving. Verder kunnen pyreenmoleculen geïncorgeerd in de vesikelbilage intramoleculaire excimers vormen en dit proces is gevoelig voor de viscositeit van de probe micro-omgeving [32]. Daarom is de excimer/monomer fluorescentie-intensiteitsverhouding, I_E/I_M, gerelateerd aan microviscositeit.

Deze studies werden uitgevoerd op de vesikels bereid zowel met als zonder pHLIP en de verkregen resultaten werden vervolgens vergeleken.

Calceïne Vrijgave Studies

Non-ionische surfactanten of fosfolipide vesikels werden geladen met calceïne in concentratie van 10⁻² M. Bij deze concentratie is de calceïne fluorescentie zelf-gekwetst [33]. Dewetting metingen werden vervolgens gebruikt om de calceïne vrijgave van de vesikel waterige kern te bepalen. De fluorescente probe werd in de vesikels geladen tijdens hydratatie van de dunne film door toevoeging van 5 mL van de calceïne waterige oplossing. De vesikelsuspensies werden gezuiverd door gelpermeatie chromatografie, in contact gebracht met 45% humaan serum of Hepes, en vervolgens geladen in een cellulase membraan dialysezak (afsnij molecuulgewicht 8.000 Da van Spectra/Por®). De vrijgave experimenten werden uitgevoerd bij 37 °C, onder magnetische roering in Hepes buffer (10 mM, pH 7,4) als extern medium. Aliquots van het externe medium werden op verschillende tijdstippen over 0-24 uur onttrokken. Van tijd tot tijd werden de onttrokken aliquots heringeführt in het systeem [34].

De calceïne vrijgave werd gemonitord door metingen van de fluorescentie van het medium gebruikmakend van een Perkin-Elmer LS50B spectrofluorometer met λ_ex = 492 en λ_em = 520 nm. De referentiewaarde F_∞ (arbitraire eenheden), gecorreleerd met het totale calceïne bedrag ingesloten in de vesikels [35], werd bepaald na de disrupte van de vesikels met isopropylalcohol (1:1 v/v). De vrijgave percentages (F%) bij elk tijdstip werden verkregen met de volgende vergelijking:

waar F_t (arbitraire eenheden) de fluorescentie is gelezen op een specifiek tijdstip t.

Statistische Analyse

Een eenrichtings ANOVA werd gebruikt voor statistische analyse. Een posteriori Bonferroni t-toets werd uitgevoerd om de statistische significantie van de ANOVA toets te evalueren. Een p-waarde < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. Resultaten zijn het gemiddelde van drie experimenten ± standaarddeviatie.

Resultaten en Discussie

Tween20-, Span20-, en DMPC-vesikels, bereid met en zonder DSPE-pHLIP, werden gekarakteriseerd voor grootte en ζ-potentiaal (Tabel 2).

Volgens de resultaten gepresenteerd in Tabel 2, tonen de geanalyseerde monsters geen significante variaties in zowel grootte als ζ-potentiaal, ongeacht de aanwezigheid van pHLIP.

De boven gerapporteerde groottebereiken werden bevestigd door middel van een andere analysetechniek, zoals cryo-TEM (Fig. 1).

Representatieve cryo-TEM beelden van niosomen en liposomen gecoate met pHLIP. Beelden van NioSpan20-pHLIP niosomen (a) en LipoDMPC-pHLIP liposomen (b) verkregen bij × 10.000 vergroting en LipoDMPC-pHLIP liposomen (c) verkregen bij × 40.000 vergroting

De interne structuur van niosomen/vesikels met en zonder DSPE-pHLIP werd bepaald door SAXS experimenten. De SAXS intensiteitsspectra, gepresenteerd in Fig. 2, zijn verschillend, wat aangeeft dat elk systeem eigentijds kenmerken heeft.

SAXS spectra. Intensiteitsspectra van niosomen/vesikels zonder (zwarte open symbolen) en met DSPE-pHLIP (kleur symbolen)

Tween20-gebaseerde niosomen zijn unilamellaire, terwijl DMPC vesikels een zekere graad van multilamellariteit vertonen (als liposomen), zoals getoond door de aanwezigheid van de karakteristieke piek bij q ≅ 1 nm⁻¹, corresponderend met een interlamellaire afstand van 6 nm (ongeveer 5 nm lipide bilage en 1 nm water). Span20-gebaseerde vesikels zijn definitief multilamellaire, met een karakteristieke piek bij q = 1,6 nm⁻¹ corresponderend met een interlamellaire afstand van 3,8 nm, wat tweemaal de lengte van het Span20 molecuul matcht. Resultaten geven aan dat de meervoudige schil van Span20 vesikels samengesteld is uit aangrenzende bilagen met bijna geen interlamellair water.

De aanwezigheid van DSPE-pHLIP (minder dan 1% molfractie) beïnvloedt de systemen niet dramatisch. De verstrooide intensiteit in alle onderzochte q-bereik is vrij vergelijkbaar, wat aangeeft op vergelijkbare fractie van gestructureerd materiaal en vergelijkbare algehele grootte van de vesiculaire deeltjes.

DMPC-gebaseerde vesikels tonen een lichte toename in het aantal bilagen binnen het lipoom, afleidbaar door de intensiteitstoename van de Bragg-piek bij q = 1 nm⁻¹. De insertie van een lage fractie van DSPE C18-ketens, gekoppeld aan elk peptidemolecuul, verandert de dikte van de lipide bilage niet, en wordt voornamelijk gedicteerd door de grote fractie cholesterol ten opzichte van DMPC (ongeveer 40-50%). Bij deze concentratie van cholesterol zijn lipidenketens georganiseerd in de vloeibare geordende (Lo) fase, en gekenmerkt door het ontkoppelen van de zwakke laterale positionele orde van de ketens ten opzichte van de hoge orientatieorde langs de ketens en in staat om enkele C18-ketens te herbergen zonder structurele verandering [36]. Ook Span20-gebaseerde meervoudig gelaagde vesikels tonen geen veranderingen in hun interne structuur.

In het Tween20 + pHLIP systeem is een kleine hoeveelheid cholesterol kristallieten aanwezig, zoals getoond door de typische scherpe piek bij q = 1,84 nm⁻¹ (karakteristieke afstand van 3,41 nm), en de vesikelstructuur is ongewijzigd. De aanwezigheid van enkele microkristallieten is vaak gevonden geassocieerd met Tween-gebaseerde niosomen [37] in hoeveelheid afhankelijk van samenstelling, preparatieprocedure en zuivering. In Fig. 2 worden de twee experimentele spectra van Tween20 en Tween20 + pHLIP vesikels getoond samen met de fittingcurves verkregen door het modelleren van de sferisch gesloten bilage met drie concentrische schillen: de externe kopgroepen, de ketens en de interne kopgroepen. De fitting gemiddelde grootte van vesikels is ongeveer 168 nm in beide systemen, in overeenstemming met DLS resultaten. Structurele parameters zijn hetzelfde voor de twee gesloten bilagen (zie Additioneel bestand 1: Figuur S1 en Tabel S2) behalve voor de externe schil: in de aanwezigheid van DSPE-pHLIP wordt een lichte daling (5%) van de elektrondichtheid van de kopgroepen waargenomen (van 0,42 tot 0,40 e/ų), samen met een toename in de ruwheid van de laag. Dit resultaat geeft aan dat toevoeging van DSPE-pHLIP voornamelijk de externe schil van de vesikels beïnvloedt. Dit is consistent met een beeld waar de DSPE C18-ketens in de bilage inserten en het peptiide ankeren aan het vesikeloppervlak, tussen de uitgebreide en vertakte polyethyleenglycol kopgroepen. We merken op dat de capaciteit van het pHLIP peptiide zelf (niet gekoppeld aan lipide moleculen) om te interageren met het externe oppervlak van vesikels bij hoge pH en in te insert in de bilage bij lage pH recentelijk waargenomen is door SAXS in het geval van onverzadigde fosfolipide bilagen [38]. In de huidige studie is de molfractie van het peptiide significant lager en is het peptiide gekoppeld aan lipiden, omdat het doel is om pHLIP-gecoate pH-gevoelige geneesmiddel nanovectoren te ontwerpen. De pHLIP associatie wordt gedreven door de hydrofobe interactie van de geconjugeerde DSPE C18-ketens die in de hydrofobe regio van de nanovector inserten. Het pHLIP peptiide is geankerd en ligt in de externe kopgroepenregio, geneigd om te interageren met doelwitmembranen bij zure pH en/of de nanovectorinhoud vrij te geven na bilage herrangschikking in lage pH omgeving.

Om te onderzoeken of de pHLIP aanwezigheid de bilage microreologische eigenschappen (vloeibaarheid, microviscositeit en polariteit) kon beïnvloeden, werd een lipofiele schil karakterisering uitgevoerd. De karakterisatiestudies werden uitgevoerd door gebruik te maken van de fluorescente probe pyreen, toegevoegd aan de monsters aan het begin van de preparatieprocedure. Vanwege de lipofiele natuur, insert het in de vesikelbilage en levert informatie over de polariteit en microviscositeit van de membraanomgeving.

Zoals getoond in Tabel 3, in alle drie monstersets, dalen polariteitswaarden slechts licht in de aanwezigheid van pHLIP vergeleken met het tegenhanger vesikel zonder pHLIP, terwijl microviscositeitswaarden een drievoudige toename tonen, voor alle vesikels.

De bilage werd verder gekarakteriseerd door metingen van fluorescentie-anisotropie van een andere lipofiele fluorescente probe, DPH, geïncorgeerd in lipiden. Deze metingen reflecteren de probe beweging en zijn oriëntatie binnen de bilage wat informatie geeft over de bilagevloeibaarheid die de vesikels capaciteit om hun inhoud vrij te geven kan beïnvloeden [29]. Fluorescentie-anisotropiewaarden zijn omgekeerd evenredig met de membraanvloeibaarheid. Dus, hoge fluorescentie-anisotropiewaarde correspondeert met een hoge structurele orde en/of lage membraanvloeibaarheid, als in vloeibare-geordende fase [30].

De anisotropiewaarden voor elk monster worden getoond in Tabel 3. De data geven aan dat de aanwezigheid van DSPE-pHLIP in de vesikels de membraanvloeibaarheid verhoogt, aangezien de fluorescentie-anisotropie daalde. Het is goed bekend dat de bilagevloeibaarheid niet alleen beïnvloed wordt door orde en laterale organisatie van de apolaire ketens maar ook door de polaire kopgroepen [31]. SAXS resultaten op de drie verschillende systemen tonen aan dat DSPE-pHLIP moleculen voornamelijk de kopgroepenregio beïnvloeden, uiteindelijk een andere pakking van de polaire koppen veroorzakend. Structurele resultaten lijken overeen te komen met microreologische eigenschappen van de bilagen in aanwezigheid van geassocieerde DSPE-pHLIP zoals onthuld door de insertie van twee verschillende probes. Resultaten tonen een verhoogde microviscositeit zoals onthuld door pyreen, een probe die dicht bij de buitenste regio kan inserten (pyreen log P is 4,88). Aan de andere kant, DPH wordt verondersteld in de kern van de bilagen ingesloten te zijn, georiënteerd parallel aan de lipide acyl-keten as of beperkt in het centrum van de bilage, parallel aan het oppervlak. Het is grotendeels gevoelig voor de hoekmatige reoriëntatie van amphifiele acyl-ketens [39]. De verhoogde vloeibaarheid, zoals onthuld door DPH, kan gerelateerd zijn aan zowel het effect van de insertie van DSPE ketens tussen de andere acyl-ketens en aan het effect van pHLIP partition in de polaire kopgroepenregio, wat de pakkingseigenschappen van de surfactanten verandert. (Fig. 3).

Representatie van pHLIP interacties met vesikelmembraan

Verder karakterisatiestudies werden uitgevoerd op de onderzochte preparaten. Alle monsters, bereid met en zonder pHLIP, werden 90 dagen opgeslagen bij 4 °C temperatuur om de stabiliteit van de vesikels over tijd te evalueren, door hun grootte en ζ-potentiaal variaties te meten (Additioneel bestand 1: Figuur S2). Geen significante variaties in grootte en ζ-potentiaal werden waargelopen langs het experiment; daarom bleken alle onderzochte preparaten stabiel als opgeslagen bij 4 °C temperatuur.

Daarnaast werd de stabiliteit van de monsters ook onderzocht in de aanwezigheid van 90% (v/v) humaan serum en opgeslagen bij 37 °C gedurende 3 uur (Additioneel bestand 1: Figuur S3).

In contact met humaan serum toonden Tween20 vesikels een toename in grootte, hoewel onder 300 nm bleven. De grootte en de PDI waarden werden gemeten als constant langs het 3-uurs experiment, wat suggereert dat de vesikels in suspensie intact bleven langs het hele experiment.

Zowel de Span20 monsters in contact met humaan serum toonden een toename in grootte, met name in de preparatie met pHLIP, terwijl PDI waarden een homogene grootteverdeling suggereren (data niet getoond). Deze gebeurtenis kan te wijten zijn aan de absorptie van plasma-eiwitten op het niosomale oppervlak, als resultaat van electrostatische interacties, echter zonder in vesikel disrupte te vallen. Deze hypothese wordt ondersteund door de ζ-potentiaal daling na de vesikels contact met humaan serum. Dit fenomeen treedt op wanneer het ζ-potentiaal licht negatieve waarden bereikt, rond de neutraliteitsregio, wat het systeem onstabiel maakt en vesikels beginnen te aggregeren.

Evenals Tween20 tonen DMPC vesikels een toename in grootte in vergelijking met het pre-contact monster. Echter, deze variatie bleek niet-significant en de groottewaarden bleven onder 280 nm (DMPC) of onder 240 nm (DMPC + pHLIP).

De vrijgavecapaciteit werd geëvalueerd voor de monsters bereid met en zonder pHLIP volgend het bedrag calceïne (hydrofiele probe) vrijgegeven van de vesikels over de tijd.

De studies werden uitgevoerd bij de temperatuur van 37 °C voor een tijdsperiode van 24 uur, door de gezuiverde monsters te blootstellen aan HEPES buffer of humaan serum. Zoals getoond in Fig. 4, blijken calceïne vrijgaveprofielen zeer vergelijkbaar voor zowel Tween20 en Tween20-pHLIP in HEPES buffer of humaan serum.

Calceïne vrijgaveprofiel. NioTween20 en NioTween20-pHLIP in contact met HEPES buffer (a) of humaan serum (b)

Het vrijgegeven bedrag calceïne was tussen 30 en 50% wat geen verschillen in vrijgavecapaciteiten aangeeft tussen de monsters bereid met en zonder pHLIP.

Deze zelfde resultaten zijn verkregen voor Span en DMPC monsters (data niet getoond).

Vergelijkbare vrijgaveprofielen zijn gerapporteerd voor verschillende stimuli-responsieve nanodragers, zoals thermo-gevoelige cubosomen [40] of polymere zelf-geassembleerde nanodragers (SANs) [41, 42].

Concluderend, de fysico-chemische verschillen waargenomen in termen van microviscositeit en vloeibaarheid voor de monsters bereid met en zonder pHLIP (Tabel 3) beïnvloeden hun vrijgavecapaciteiten niet (Fig. 4), volgens het bewijs dat de insertie van DSPE-pHLIP moleculen voornamelijk de kopgroepenregio beïnvloedt. Deze data zijn in overeenstemming met eerdere gerapporteerde resultaten die tonen dat bij neutrale en hoge pH's, pHLIP gebonden is aan het oppervlak van liposomen gemaakt door 1-Palmitoil-2-oleoyl-sn-glycero-3-fosfocholine (POPC) en geen fusie of membraanlekken induceert.

Conclusie

Deze studie bevestigt de mogelijkheid van het prepareren van pHLIP gedecoreerde vesikels. Monsters zijn stabiel als opgeslagen bij 4 °C temperatuur voor ten minste 3 maanden en in de aanwezigheid van serum. Bovendien zijn de voorgestelde nanovectoren in staat om een hydrofiele probe in te sluiten en de afgifte ervan te moduleren.

pHLIP vesikels werden volledig gekarakteriseerd om fundamenteel inzicht te verkrijgen in nanodragerkenmerken en het rationele ontwerp van zuurheidsgevoelige nanovectoren te vergemakkelijken.

De pHLIP associatie wordt gedreven door de hydrofobe interactie van de geconjugeerde DSPE C18-ketens die in de hydrofobe regio van de nanovector inserten. Het pHLIP peptiide is geankerd en ligt in de externe kopgroepenregio, geneigd om te interageren met doelwitmembranen bij zure pH en/of de nanovectorinhoud vrij te geven na bilage herrangschikking in lage pH omgeving.

Volgens deze bevindingen zouden de voorgestelde pHLIP gedecoreerde vesikels nuttig kunnen zijn om een verlengde (gewijzigde) vrijgave van biologisch actieve stoffen te verkrijgen voor het targeten van tumoren en andere zurre ziekteweefsels.

Afkortingen

Chol:

Cholesterol

Cryo-TEM:

Cryo-transmissie elektronenmicroscopie

DLS:

Dynamische lichtverstrooiing

DMPC:

1,2-Dimyristoil-sn-glycero-3-fosfocholine

DPH:

Difenylhexatrieen

pHLIP:

pH (laag) insertie peptiide

SAXS:

Kleine hoek Röntgenverstrooiing

Span20:

Sorbitan monolauraat

Tween20:

Polyoxyethylenesorbitan monolauraat