Hoog-Efficiënte Tumor-Gerichte Foto-Chemo Theranostische Nanopartikelen: Artesunaat-Geladen, ICG-Geconjugeerd Humaan Serum Albumine

Samenvatting

We rapporteren een tumor-specifiek theranostisch platform dat vier klinisch goedgekeurde middelen combineert - artesunaat (Arte), humaan serum albumine (HSA), zuurstofzuur (FA) en indocyaan groen (ICG) - in een enkele nanopartikel (FA-IHA NPs). Deze nanopartikelen vertonen uitzonderlijke foto- en fysicochemische stabiliteit. ICG voorziet nabij-infrarood (NIR) fluorescentie voor imaging en verleent fotothermische (PTT) en fotodynamische (PDT) therapeutische mogelijkheden onder een enkele 808 nm laser. Tegelijkertijd activeert 808 nm bestraling gecontroleerde Arte-afgifte, wat de chemotherapeutische effectiviteit versterkt. In vitro en in vivo studies demonstreren snelle cellulaire opname en selectieve tumoraccumuler, geverifieerd door confocal microscopie en NIR-imaging in HepG2 xenotransplantatie muizen. Een enkele NIR-bestraalingssessie (808 nm, 1 W/cm²) gecombineerd met FA-IHA NPs onderdrukt tumorgroei volledig zonder recidief. Deze bevindingen vestigen FA-IHA NPs als een veelbelovend platform voor klinische vertaling van beeld-geleide foto-chemo-therapie.

Achtergrond

Beeld-geleide foto-chemo-therapie (IGPC) is uitgegroeid als een overtuigende strategie voor gepersonaliseerde oncologie, die nauwkeurige tumorlokalisatie combineert met multimodale behandeling terwijl collaterale schade wordt geminimaliseerd (1-4). Een succesvol IGPC-platform moet zijn: (i) multifunctioneel, diagnostische en therapeutische modaliteiten integrerend; (ii) biocompatibel, stabiel en tumor-selectief (5-8). Fluorescentie-imaging, vanwege de hoge gevoeligheid en gunstige temporele resolutie, wordt veel gebruikt voor real-time begeleiding (9-16).

Fotothermische therapie (PTT) en fotodynamische therapie (PDT) kunnen worden geïntegreerd onder NIR-bestraaling, wat zowel warmte als reactieve zuurstofvormen (ROS) levert om tumorcellen te ablateren (17-19). Niettemin faalt monotherapie vaak om residuele ziekte te eradiceren, wat leidt tot recidief (17-19). Conventionele chemotherapie biedt systemische cytotoxiciteit maar lijdt onder non-specificiteit en geassocieerde toxiciteiten (20-22). Dus IGPC, dat gelokaliseerde fototherapie combineert met gerichte chemotherapie, belooft deze beperkingen te overwinnen.

Nanomedicine heeft een verscheidenheid aan IGPC-theranostica geproduceerd, waaronder indocyaan groen (ICG), metaal-gebaseerde nanopartikelen, koolstof-nanomaterialen en polymere systemen (23-27). ICG, een FDA-goedgekeurde NIR-kleurstof, wordt klinisch breed gebruikt voor hartinoutput, leverfunctie en oogheelkundige angiografie (28-29). De sterke absorptie bij 800 nm faciliteert efficiënte PTT-PDT. Echter, vrij ICG is onstabiel, clairt snel uit de circulatie, zelf-bleekt en mist tumor-specificiteit (31-32). Inkapseling in dragers zoals micellen, polymeren of proteïne-nanostructuren heeft de prestaties verbeterd, toch blijft de behoefte aan meer biocompatibele, gerichte ICG-gebaseerde composieten bestaan (33-34).

Hier hebben we een tumor-gerichte IGPC-agent ontworpen door covalente koppeling van FA en ICG aan HSA-nanopartikelen, gelijktijdig Arte ingekapseld - een natuurlijk antimalaria-middel met bewijs van antikanker-activiteit tegen lever-, long- en borstkanker (35). De resulterende FA-IHA NPs benutten FA-gemedieerde receptoropname, HSA's uitstekende biocompatibiliteit en de dubbele therapeutische kracht van ICG en Arte. Dit multifunctionele construct biedt NIR-imaging, PTT-PDT en gecontroleerde chemo-afgifte, wat het positioneert als een veelzijdig platform voor klinische vertaling.

Methoden

Materialen

Reagentia omvatten EDC, NHS en Arte (≥ 99%) van Sigma-Aldrich; DAPI en CCK-8 van Aladdin; NH₂-PEG₂₀₀₀-COOH en NH₂-PEG₂₀₀₀-FA van Xi'an Ruixi; DMEM en PBS van Gibco; ICG-NHS van Dojindo. Alle chemicaliën werden gebruikt zoals ontvangen.

Synthese en Karakterisering van FA-IHA NPs

Arte werd opgelost in DMSO, daarna toegevoegd aan 15 mL water. HSA (10 mg) werd geïntroduceerd en 3 uur gerold bij kamertemperatuur, gevolgd door verneting met 150 µL 0,5% glutaraldehyde. Het mengsel werd gedialyseerd tegen gedestilleerd water (MWCO 8-12 kDa) gedurende 24 uur om Arte-geladen HSA (Arte-HSA) te verkrijgen. Activering van HSA's carboxylgroepen met EDC/NHS werd gevolgd door conjugatie met NH₂-PEG₂₀₀₀-FA (3 uur, 4 °C) en daaropvolgende hechting van ICG-NHS (30 min, RT). Finale FA-ICG-HSA@Arte (FA-IHA NPs) werden gezuiverd door 24-uurs dialyse in gedemineraliseerd water. Arte- en ICG-ladings-efficiënties werden gekwantificeerd door UV-vis-spectroscopie (lading% = W₁/W₂ × 100%).

Morfologie werd beoordeeld door TEM (Hitachi). Hydrodynamische grootte en ζ-potentiaal werden gemeten door DLS (Malvern Zetasizer). Absorptiespectra werden opgenomen op een Shimadzu UV-vis-spectrofotometer. Fotothermische responsen werden gemeten met een 808 nm CW-laser (1 W/cm²) met temperatuur gemonitord door een Fluke-thermocouple. Fotostabiliteit en fluorescentie-longeviteit werden geëvalueerd over 5 cycli en 30 dagen, respectievelijk.

Thermische en pH-Getriggerde Arte-Afgifte

FA-IHA NPs (50 µg/mL) werden geïncubeerd bij pH 6,5, pH 7,4 en pH 6,5 + NIR (808 nm, 1 W/cm², 1 min puls) over 36 uur. Arte-afgifte werd gekwantificeerd door UV-vis bij 287 nm in het supernatans.

Detectie van Enkelvoudige Zuurstofproductie

DPBF (15 µL) werd gemengd met 1 mL van 10 µg/mL ICG of FA-IHA NPs en bestraald (808 nm, 1 W/cm², 5 min). Absorptiedaling bij 410 nm over tijd weerspiegelt enkelvoudige zuurstofgeneratie.

Celkweek en Cellulaire Opname

HepG2-cellen (ATCC) werden gekweekt in DMEM met 10% FBS, 1% penicilline-streptomycine bij 37 °C, 5% CO₂. Voor opname-studies werden cellen geïncubeerd met vrij ICG, IHA NPs of FA-IHA NPs (0,05 mg/mL ICG) gedurende 6 uur, gewassen, gefixeerd, DFA-gekleurd en afgebeeld door confocal microscopie. Stroomcytometrie kwantificeerde internalisatie-snelheden.

Generatie van Intracellulaire ROS

HepG2-cellen (2 × 10⁵ cellen/mL) werden behandeld met PBS, Arte, FA-HA-NPs, vrij ICG, IHA-NPs of FA-IHA NPs gedurende 12 uur, daarna bestraald (808 nm, 1 W/cm², 5 min). DCFH-DA (5 µg/mL) werd 30 min toegevoegd, gevolgd door stroomcytometrie en fluorescentiemicroscopie om ROS-niveaus te beoordelen.

In Vitro Tumor Combinatorische Foto-Chemo-Therapie

HepG2-cellen (2 × 10⁴ cellen/put) werden behandeld met vrij ICG, Arte, IHA NPs of FA-IHA NPs (Arte 0-30 µg/mL) gedurende 6 uur, daarna bestraald (808 nm, 1 W/cm², 5 min) of onbehandeld gelaten. Cellevensvatbaarheid werd gemeten door CCK-8 na 24 uur. Live/dood-kleuring (calceïne-AM/PI) bevestigde cytotoxiciteit via confocal imaging.

Diermodel en In Vivo Fluorescentie-Imaging

Balb/c naakte muizen (n=5) werden subcutane geïnjecteerd met 1 × 10⁶ HepG2-cellen. IVIS Spectrum imaging (Caliper) volgde NIR-fluorescentie op 10 min, 6 u, 12 u, 24 u en 48 u na staartveisinjectie van vrij ICG, IHA NPs of FA-IHA NPs.

In Vivo Tumor Combinatorische Foto-Chemo-Therapie

Muizen werden gerandomiseerd in zes groepen (n=5): PBS, Arte, FA-IHA NPs, ICG + NIR, IHA + NIR, FA-IHA + NIR (gelijke Arte-dosis). NIR-bestraaling (808 nm, 1 W/cm², 5 min) werd toegepast op 24 u en 48 u. Tumorvolumes werden elke 4 dagen vastgelegd en uitgedrukt ten opzichte van baseline. Na behandeling werden belangrijke organen geoogst voor H&E-histologie.

Resultaten en Discussie

Synthese en Karakterisering van FA-IHA NPs

Figuur 1 schematiseert FA-IHA NPs' ontwerp en therapeutische werkstroom. De nanopartikelen werden samengesteld via een eenvoudige, biocompatibele methode, ICG integrerend voor NIR-imaging en fototherapie, en Arte voor chemotherapeutische actie.

Hoog-Efficiënte Tumor-Gerichte Foto-Chemo Theranostische Nanopartikelen: Artesunaat-Geladen, ICG-Geconjugeerd Humaan Serum Albumine

Transmissie-elektronenmicroscopie onthulde monodisperse, spherische deeltjes (~131,2 nm). Dynamische lichtverstrooiing bevestigde een hydrodynamische diameter van 131 ± 2,3 nm over water, PBS en celmedium, met een stabiel ζ-potentiaal van -29,2 ± 1,13 mV. Grootte bleef onveranderd over 7 dagen, wat robuuste colloïdale stabiliteit aantoont door PEG en HSA-coating. UV-vis-spectra toonden karakteristieke pieken van Arte en ICG, wat succesvolle lading bevestigt (Arte 98,6 ± 3,1%, ICG 56,9 ± 2,4%). Fluorescentiespectra matched vrij ICG, wat bewaarde fotofysieke eigenschappen bevestigt.

Fotothermische evaluatie toonde aan dat FA-IHA NPs (gelijke ICG-inhoud) de temperatuur verhoogden met ~36 °C binnen 5 min onder 808 nm (1 W/cm²) bestraling, terwijl vrij ICG een vergelijkbare stijging toonde en water nauwelijks steeg (<4 °C). Fotostabiliteitstesten onthulden dat FA-IHA NPs absorptie behielden over vijf bestralingscycli, terwijl vrij ICG intensiteit verloor, wat het beschermende effect van covalente conjugatie en HSA/PEG-inkapseling benadrukt. Fluorescentielongeviteit over 30 dagen bij 4 °C toonde een 28% reductie voor FA-IHA NPs versus een 88% daling voor vrij ICG, wat superieure fotostabiliteit benadrukt.

DPBF-assays toonden aan dat FA-IHA NPs 58% van de standaard enkelvoudige zuurstofopbrengst produceerden binnen 5 min NIR-blootstelling, wat vrij ICG (35%) overtrof. Deze verbetering reflecteert het synergistische effect van dubbele fototherapie.

Onder zuur condities (pH 6,5) en NIR-bestraaling steeg Arte-afgifte van FA-IHA NPs van 11,6% (pH 7,4) naar 68,4% (pH 6,5 + NIR). De dubbele triggers - thermische expansie van HSA en proton-gemedieerde oppervlaktelading-verandering - faciliteren gecontroleerde medicijnafgifte (37-38).

Celopname en Detectie van Intracellulaire ROS

Confocal imaging onthulde uitgesproken rode ICG-fluorescentie in HepG2-cellen behandeld met FA-IHA NPs, wat vrij ICG en IHA NPs overtrof. Stroomcytometrie kwantificeerde een opnamepercentage van 52,3% voor FA-IHA NPs, aanzienlijk hoger dan IHA NPs (25,2%) en vrij ICG (3,9%) - een duidelijke indicatie van FA-gemedieerde receptor-targeting (39-41).

ROS-productie, beoordeeld met DCFH-DA, was significant hoger in FA-IHA NPs-behandelde cellen na 5 min NIR-bestraaling vergeleken met alle andere groepen, wat versterkte fotodynamische activiteit bevestigt (Figuur 6a,b).

In Vitro Tumor Combinatorische Foto-Chemo-Therapie

FA-IHA NPs bereikten de hoogste temperatuurstijging (~31 °C) onder alle behandelingen na 5 min NIR-blootstelling, correlerend met superieure fotothermische prestaties (Figuur 7a). Zonder bestraling toonden Arte, IHA NPs en FA-IHA NPs concentratie-afhankelijke cytotoxiciteit, terwijl vrij ICG inert bleef. Na bestraling daalde cellevensvatbaarheid dramatisch in de FA-IHA NPs-groep, toeschrijfbaar aan synergistische chemo-fotothermische effecten. Calceïne-AM/PI-kleuring bevestigde bijna volledige celdood in FA-IHA NPs + NIR, terwijl andere groepen levende cellen behielden (Figuur 7d).

In Vivo Fluorescentie-Imaging

IVIS-imaging onthulde sterke heel-lichaam-fluorescentie binnen 10 min post-injectie van alle formuleringen. Tumorfluorescentie piekte op 24 u, met FA-IHA NPs die het hoogste signaal vertoonden op elk tijdstip, wat FA-gedreven tumoraccumuler bevestigt (Figuur 8b). Ex vivo orgaananalyse op 24 u toonde overwegende leveropname in alle groepen, consistent met hepatische clearance-paden (Figuur 8c).

In Vivo Tumor Combinatorische Foto-Chemo-Therapie

Thermische imaging op 24 u post-injectie onder NIR-bestraaling toonde de grootste temperatuurstijging (~22,1 °C) voor FA-IHA NPs, wat krachtige fotothermische conversie bevestigt (Figuur 9a,b). Twee bestralingssessies (dag 0 en dag 2) leidden tot complete tumorregressie in de FA-IHA + NIR-groep, zonder recidief over 90 dagen en een 100% overlevingsratio, terwijl alle andere groepen faalden om sustained onderdrukking te bereiken (Figuur 9c,d). Histologische onderzoek onthulde geen significante orgaanpathologie in de FA-IHA + NIR-groep, wat verwaarloosbare systemische toxiciteit benadrukt (Figuur 10).

Conclusies

We hebben een multifunctionele theranostische nanopartikel ontworpen die FA en ICG covalente conjugaert terwijl Arte ingekapseld wordt binnen HSA. De FA-IHA NPs demonstreren robuuste colloïdale en fotothermische stabiliteit, behouden NIR-fluorescentie en geven Arte vrij bij NIR-bestraaling. FA-gemedieerde receptor-targeting levert hoge cellulaire opname en tumoraccumuler, wat een synergistische fotothermische-fotodynamische-chemotherapeutische aanval mogelijk maakt die tumoren in vitro en in vivo uitschakelt zonder recidief. Deze resultaten positioneren FA-IHA NPs als een hoogst veelbelovend platform voor klinische vertaling van beeld-geleide, tumor-gerichte foto-chemo-therapie.

Afkortingen

Arte:: Artesunaat
FA:: Zuurstofzuur
HSA:: Humaan serum albumine
ICG:: Indocyaan groen
NIR:: Nabij-infrarood
PDT:: Fotodynamische therapie
PEG:: Polyethyleenglycol
PTT:: Fotothermische therapie

Fotonische Controle van Spin Hall Effect in GaAs/AlGaAs 2DEG: Bewijs voor Extrinsieke Inverse Spin Hall Respons Invloed van dubbellaag CeO₂−x/ZnO heterostructuren en electrovormingspolariteit op de weerstandsschakelprestaties van niet-vluchtige geheugentoestellen

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal