Kwantitatieve evaluatie van cellulaire internalisatie van polymere nanodeeltjes in larynxkankercellen en immuuncellen voor verbeterde medicijnafgifte

Resultaten en discussie

Karakterisatie van poly(melkzuur-co-glycolzuur)deeltjes

Fluorescentiemicrofoto's van PLGA-deeltjes (Fig. 1a,b,c) vertoonden robuuste fluorescentie-intensiteit en geen significante afname van fluorescentiesignalen in de loop van 14 d na bereiding (aanvullend bestand 1:S1), wat wijst op een relatief homogene grootteverdeling en hoge fluorescentie stabiliteit. Zoals aangegeven door de leverancier, vertoonden 100, 500 en 1000 nm PLGA-deeltjes de afmetingen van respectievelijk ongeveer 80,6 ± 19,3 nm, 542,6 ± -128,3 nm en 951,9 ± 237,5 nm (Fig. 1d,e,f). Volgens zeta-potentiaalmetingen bleken de gemiddelde oppervlakteladingen op de deeltjes − 20,6 ± 5,3, −17 ± 4,6 en − 16,5 ± 3,5 te zijn met een polydispersiteitsindex van 0,057, 0,056 en 0,062 voor 100, 500 en 1000 nm-deeltjes, waarvan de laatste hun zeer monodisperse standaarden aangaven. Alle deeltjes werden gevortext en vervolgens gedurende 5 minuten in een waterbad gesoniceerd om de deeltjesaggregatie grotendeels te elimineren. Er werden echter kleine pieken waargenomen die overeenkomen met deeltjes van 100 en 1000 nm met een diameter van ongeveer 4-6 µm vanwege de onvermijdelijke deeltjesaggregatie in zeer kleine hoeveelheden (ongeveer 3-4%).

Karakterisering van PLGA-deeltjes. Fluorescentiemicrofoto's tonen de verschillende maten (a 100 nm, b 500 nm en c 1 µm) PLGA-deeltjes. Die deeltjes kunnen worden gedetecteerd onder Olympus optische microscopie en vertonen relatief uniforme deeltjesgrootteverdelingen in watersuspensie. Dynamische lichtverstrooiing (DLS)-metingen geven de grootteverdeling gewogen per volume weer voor 100 nm (d ), 500 (e ), 1 µm (f ) PLGA-deeltjes. Ondanks een klein deel van de deeltjesaggregatie (kleinere pieken:3-4%) in 100 nm en 1 µm PLGA-suspensies, is de algehele deeltjesgrootteverdeling vrij homogeen vanwege de smalle hoofdpiek

Evaluatie van cellevensvatbaarheid en cytotoxiciteit

Vanwege hun uitstekende biocompatibiliteit en biologische afbreekbaarheid zijn PLGA-deeltjes goedgekeurd door de FDA en het Europees Geneesmiddelenbureau voor biomedische toepassingen [27, 28]. PLGA-deeltjes zijn dus momenteel in de kliniek gebruikt en worden op grote schaal toegepast in preklinische onderzoeken als nanodragers die medicijnen afleveren aan specifieke zieke regio's of tumoren. De doelgerichtheid en therapeutische werkzaamheid van PLGA-deeltjes worden echter, ten minste gedeeltelijk, gehinderd door het immuunsysteem. Hoge deeltjesfagocytose door Kupffer-cellen in de lever zorgde er bijvoorbeeld voor dat de nanodrugsdragers de tumor niet binnendringen [15]. Daarom is het van vitaal belang om geavanceerde in vitro modellen op te zetten om de interactie tussen kankercellen, immuuncellen en deeltjes te bestuderen om de in vivo situatie van medicijnafgifte beter na te bootsen. UM-SCC-17A is een unieke larynx plaveiselcarcinoom cellijn geïsoleerd uit het primaire larynx kankerspecimen [29]. Echter, informatie over de in vitro cellulaire opname-efficiëntie in co-cultuursystemen (bijv. , co-incubatie van macrofagen en kankercellen) is nog steeds onvoldoende, een probleem dat moet worden aangepakt om het voorspellend vermogen van in vivo reacties te verbeteren. Bovendien is bewezen dat deeltjesgrootte en oppervlaktecoating een belangrijke rol spelen bij het afleveren aan solide tumoren, zieke plaatsen en kankercellen in diermodellen en celculturen [30,31,32,33]. Hier hebben we dus drie maten PLGA toegepast op UM-SCC-17A-carcinoomcellen om de effecten van deeltjesgrootte op cellulaire opname en intracellulaire distributie in monocultuur- en co-cultuursystemen te onderzoeken.

Deze studie bepaalde de levensvatbaarheid van de cellen met behulp van WST-1 (4-[3-(4-joodfenyl)-2-(4-nitrofenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzeendisulfonaat) methode voor monocultuur THP-1 en UM-SCC-17A-cellen, evenals een co-cultuur van beide soorten cellen. Ondanks dat er geen duidelijke celdood was opgetreden in groepen behandeld met 100 en 500 nm PLGA bij alle geteste concentraties, verminderden 500 nm en 1 µm PLGA-deeltjes bij de hoogste concentratie (20 µg/ml) de levensvatbaarheid van de cellen in monocultuur UM-SCC-17A aanzienlijk cellen (Fig. 2a). Zoals verwacht werd de levensvatbaarheid van THP-1-cellen niet significant beïnvloed na 24 uur incubatie met alle drie de soorten PLGA in concentraties van 5-20 µg/ml (≥ 95% levensvatbaarheid in vergelijking met onbehandelde cellen, waarvan de levensvatbaarheid als 100% wordt beschouwd , Afb. 2b). Identiek aan de resultaten van monocultuur UM-SCC-17A-cellen, werd de levensvatbaarheid van de cellen in het co-cultuursysteem niet veranderd door de aanwezigheid van 100 en 500 nm PLGA-deeltjes in drie doseringen die hier werden gebruikt, terwijl het significant afnam in de groep behandeld met 20 µg/ml 1 µm PLGA (Fig. 2c).

Bepaling van de levensvatbaarheid van cellen in monocultuur- en co-cultuurcellen met behulp van de WST-assay. UM-SCC-17A (a ) en THP-1-cellen (b ), en samen gekweekte UM-SCC-17A- en THP-1-cellen (c ) werden behandeld met verschillende concentraties (5-20 µg/ml) PLGA-deeltjes in drie maten

Evaluatie van de cytotoxiciteit van deeltjes met behulp van de LDH-assay is om lekkage van het celmembraan te bepalen door de hoeveelheid extracellulair LDH te meten [9]. De afgifte van dit cytoplasmatische enzym in het supernatant van de celcultuur is kenmerkend voor celmembraanbeschadiging, wat leidt tot onomkeerbare celdood. Ondanks de lichte verhoging van LDH-niveaus met hogere doseringen in monocultuur UM-SCC-17A-cellen die werden behandeld met verschillende doses van 1 µm PLGA, werd geen duidelijke cytotoxiciteit voor de cellen waargenomen, zelfs niet bij de hoogste concentratie van 20 µg/ml (Fig. 3a) . Het is niet verrassend dat alle drie de groottes van PLGA die hier in verschillende doseringen werden gebruikt niet in staat waren om substantiële LDH-afgifte in het supernatant te induceren, wat wijst op de onbeduidende toxische effecten op monocultuur THP-1-cellen, wat ook zeer consistent is met de hierboven beschreven cellevensvatbaarheidsresultaten (Fig. . 3b). In de co-cultuurexperimenten vertoonden alle deeltjes met verschillende concentraties een uitstekende biocompatibiliteit met beide cellen in termen van vrijgegeven LDH-niveaus (figuur 3c). Over het algemeen omvat het brede deeltjesgroottebereik, van 100 nm tot 1 µm, dat hier werd gebruikt de typische afmetingen van nanodragers (50-200 nm), zoals liposomen, micellen, dendrimeren, polymeren en minicellen. Dit bereik omvat ook deeltjes met een grootte van submicron (deeltjes van 500 nm kunnen nog steeds worden beschouwd als NP's, bijv. deeltjes met een grootte van ongeveer 500 nm hebben dezelfde klaringsroutes in de long als die van NP's in 10-100 nm [34] en micron-sized 1 µm. Geen van deze PLGA-deeltjes vertoonde enige duidelijke cytotoxiciteit voor de THP-1- en/of UM-SCC-17A-cellen in monocultuur- en co-cultuursystemen, behalve de 500 nm en 1 µm PLGA-deeltjes in de hoogste concentratie tegen UM-SCC- 17A en co-cultuurcellen (maar meer dan 85% van de cellen wordt overleefd), wat aangeeft dat ze gunstig zijn voor toepassingen in medicijnafgiftesystemen.

Bepaling van cytotoxiciteit voor monocultuur- en co-cultuurcellen met behulp van de LDH-assay. UM-SCC-17A (a ) en THP-1-cellen (b ), en samen gekweekte cellen (c ) werden behandeld met PLGA-deeltjes. Er werd geen significante celdood waargenomen na 24 uur incubatie van deeltjes (met verschillende groottes en concentraties die hier worden gebruikt) en cellen in zowel monocultuur- als co-cultuursystemen

Mogelijkheden van cellulaire opname van PLGA in monocultuur- en co-cultuursystemen

Figuur 4 toont de celmorfologie (Fig. 4a,d,g), celkernen en 100 nm NP's (Fig. 4b,e,h), en samengevoegde vergrote afbeeldingen (Fig. 4c,f,i) in monocultuur en co- cultuur systemen. Er werden geen deeltjes waargenomen in de onbehandelde cellen van de controlegroep (Aanvullend bestand 1:S2). Enorme grote 100 nm PLGA NP's-agglomeraten werden waargenomen in het celcytoplasma van de macrofaagmonocultuurcellen (figuur 4c). Ondertussen vertoonde monocultuur UM-SCC-17A een uitstekend opnamevermogen van 100 nm PLGA, bewezen door de heldergroene fluorescentiesignalen die in het celmembraan werden waargenomen (figuur 4f). Om de intracellulaire accumulatie van PLGA-deeltjes in THP-1- of UM-SCC-17A-cellen en extracellulaire deeltjes in de co-culturen beter te illustreren, werden overlays van helderveldbeelden met fluorescentiebeelden toegepast zoals in aanvullend bestand 1:S3). In het co-cultuursysteem zijn beide celtypen differentieerbaar in termen van morfologie en celgrootte in de helderveldbeelden, waarin macrofagen een ronde vorm en een klein formaat vertoonden, terwijl de kankercellen een groot formaat en langwerpige vorm vertoonden. De kankercellen vertoonden echter onvoldoende cellulaire opname vanwege de hoge opname van 100 nm PLGA door macrofagen in het samengekweekte systeem. Dit wordt verwacht omdat macrofagen worden beschouwd als een efficiënt en specifiek type immuuncellen om de fagocytosefunctie uit te voeren voor het opruimen van vreemde micro-organismen, allergenen en deeltjes. Evenzo tonen Fig. 5 en Fig. 6 kwalitatieve analyse van het cellulaire opnamevermogen van respectievelijk 500 nm en 1 µm PLGA-deeltjes in eencellige of gemengde celculturen. Het is opmerkelijk dat beide celmorfologieën niet veranderden na behandeling met PLGA-deeltjes van verschillende groottes in de hier gebruikte concentratie van 10 mg/ml (Fig. 4a,d,g, Fig. 5a,d,g en Fig. 6a, d,g). 500 nm en 1 µm PLGA-deeltjes vertoonden een sterkere fluorescentie-intensiteit in enige UM-SCC-17A-cellen (Fig. 5e,f en Fig. 6e,f) dan die in enige THP-1-cellen (Fig. 5b,c en Fig. 6b,c). In co-cultuurincubaties (Fig. 5h,i en Fig. 6h,i) zijn er duidelijke signaaldalingen in kankercellen, waarbij de fluorescentie-intensiteit van de deeltjes lager bleek te zijn dan die van de macrofagen. Macrofagen fagocyteerden alle soorten deeltjes snel en effectief, zodat kankercellen niet genoeg deeltjes in co-cultuursysteem kunnen opnemen. Om het effect van fagocytose op de opnamecapaciteit door kankercellen voor verschillende groottes van PLGA-deeltjes te kwantificeren, werd een semi-kwantitatieve optische analyse uitgevoerd. In het kort, de fluorescentie-intensiteiten van de deeltjes werden berekend op basis van bijvoorbeeld 50 afzonderlijke met deeltjes beladen cellen om een ​​gemiddelde waarde voor beide celtypes te bereiken, en de opname-index van kankercellen werd bepaald door het gemiddelde te nemen van de fluorescentie-intensiteit van de intracellulaire deeltjes per kankersoort. cel genormaliseerd naar die van macrofagen (Fig. 7). In monocultuur bleek de kankercelopname-index voor 100 nm PLGA ongeveer 1,34 ± -0,19 te zijn, wat suggereert dat de kankercellen meer deeltjes hebben opgenomen dan die opgenomen door macrofagen in de eencellige cultuur (Fig. 7). Dit is niet verrassend vanwege de hoge viscositeit van PLGA-deeltjes en de grotere omvang van larynxkankercellen. Evenzo werden 500 nm en 1 µm PLGA ook sterk geïnternaliseerd door kankercellen met opname-indexen van respectievelijk ongeveer 1,5 ±  0,25 en 1,4 ±  0,31 in monocultuur. De opname-indices voor grote deeltjes waren aanzienlijk afgenomen (0,59 ± -0,12 en 0,47 ± -0,1) in aanwezigheid van macrofagen in co-cultuursystemen. Ondertussen identieke cellulaire internalisatiemogelijkheden voor beide celtypen na 24 uur incubatie van 100 nm PLGA-deeltjes in de gemengde celcultuur. Overall, the results accumulated here suggested that the ingestion of particles by cancer cells and macrophages might depend on different routes of uptake pathway in single-cell culture and co-culture environment. Moreover, the presence of macrophages reduced the cellular internalization of PLGA particles by cancer cells particularly for large ones, a biological event that has been observed in in vivo nanomedicine drug delivery studies [3, 15].

Microscopic examination of cellular internalization of 100 nm PLGA nanoparticles in monoculture and co-culture cells. Single type of cells or mixed cells was treated with 100 nm PLGA nanoparticles for 24 h at 37 °C at a concentration of 10 µg/mL. Cells were observed under bright-field (a , d , g ) and fluorescent channels (b, e, and h) with particles observed at the green channel and cell nuclei in the blue channel after stained with Hoechst. Massive cellular uptake of 100 nm PLGA nanoparticles can be visualized in magnified images (c , v , i ) for monoculture THP-1 macrophages (yellow arrows) and laryngeal cancer cells UM-SCC-17A (red arrows). In the co-culture system, 100 nm PLGA nanoparticles were still highly ingested by macrophages but less efficient for cancer cells compared to single cultured cells

Microscopic examination of cellular internalization of 500 nm PLGA nanoparticles in monoculture and co-cultured cells. Single type of cells or mixed cells was treated with 500 nm PLGA nanoparticles for 24 h at 37 °C at a concentration of 10 µg/mL. Cells were observed under bright-field (a , d , g ) and fluorescent channels (b , e , u ) with particles observed at the green channel and cell nuclei in the blue channel after stained with Hoechst. Massive cellular ingestion of 500 nm PLGA nanoparticles can be visualized in magnified images (c , v , i ) for monoculture THP-1 macrophages (yellow arrows) and laryngeal cancer cells UM-SCC-17A cells (red arrows). In the co-culture system, 500 nm PLGA nanoparticles were still highly uptake by macrophages, while cancer cells had inadequate particle internalization

Microscopic examination of cellular internalization of 1 µm PLGA particles in monoculture and co-culture cells. Single type of cells or mixed cells was treated with 1 µm PLGA particles for 24 h at a concentration of 10 µg/mL. Cells were observed under bright-field (a , d , g ) and fluorescent channels (b , e , u ) with particles observed at the green channel and cell nuclei in the blue channel after stained with Hoechst. A large amount of particle uptake and tremendous accumulation of 1 µm PLGA particles can be visualized in magnified images (c , v , i ) for monoculture THP-1 (yellow arrows) and UM-SCC-17A laryngeal cancer cells (red arrows). In the co-culture system, 1 µm PLGA particles were still efficiently uptake by macrophages, while cancer cells had insufficient particle ingestion

Quantitative analysis of PLGA particle internalization in UM-SCC-17A cells in monoculture and co-culture systems. The percentage of particle fluorescent intensity in UM-SCC-17A cells normalized to that in THP-1 cells for solely and mixed cultured cells

Quantification of cellular uptake by flow cytometry

Flow cytometry is widely used to determine of particle-cell interplay in a quantitative manner, for example, the size-dependent uptake of polystyrene particles with sizes ranging from 20 to 1000 nm by dendritic cells in vivo [35]. FACS was thus utilized for analysis of the percentage of NP-positive cells and particle number in those NP-positive cells in monoculture and co-culture systems. Then, average NP counts in a single cell were calculated by determining the total fluorescence intensity in particle-laden cells normalized to the fluorescence of total applied dose. For example, about 70% of 500 nm PLGA was deposited in the cancer cells, whereas the residual was kept in the supernatant of cell cultures (Additional file 1:S4). This fluorescence intensity measured by a Tecan reader was then compared to the average/total FACS signals (FITC signal values of P5 and P6 in Fig. 8,) to estimate the particle number in the co-culture system. As seeded in the co-cultured cells, about half of the cells were recognized as macrophages and the rest were considered as cancer cells. It was observed that approximately 13,000 of single 100 nm PLGA particles accumulated in cancer cells and 9700 particles in macrophages (Fig. 8i) in the monoculture, consistent with the above microscopic examinations. A much lower particle number (164 ± 30 and 45 ± 15) was ingested by monocultured cancer cells for 500 nm and 1 µm PLGA, with a slightly lower particle count in the respective macrophages (Fig. 8i). The number of particles ingested by single cells is in great agreement with the literature records [24]; for instance, an average 2500 of gold NPs coated with cetyltrimethylammonium bromide were deposited in epithelial cells, while PEG-modified gold NPs only had a few tens per cell [36]. In co-culture systems, unexpectedly, there is a slight increase of 100 nm particle number in cancer cells, despite a higher enhancement of NP internalization by macrophage. Comparing to the uptake index in the single-cell to mixed cell culture, it also reduces about 25% for 100 nm PLGA particles. The uptake indices were found to significantly decline with around 2.5 and 3 folds reduction in co-cultured system for 500 nm and 1 µm PLGA, respectively (Fig. 8i). Generally, it was found that the existence of macrophages largely affects the uptake ability of cancer cells especially for large particles, which is also in excellent agreement with the above observations.

Particle uptake quantification in monoculture UM-SCC-17A cells and co-culture with THP-1 cells by flow cytometry. Grating strategy to identify respective cell populations in mixed cell culture (a –h ). Gating is showing one representative experiment of cells exposure to 500 nm PLGA particles. With initial live gating in the y-axis with a side scatter (SSC-A) and x-axis with a forward scattering (FSC-A), P2 a were further gated with FSC-A versus APC-A to differentiate the THP-1 cells in P4 c from UM-SCC-17A cell population in P3 (monoculture cells (b ) and mixed cells (c )). The cell population of P3 further displayed as counts versus FITC plots (P5) in non-exposed cells (d ), monoculture cells (e ), and co-cultured cells (h ). Also, P6 is the counts versus FITC-A plot originated from P4 population in non-exposed cells (g ) and co-cultured cells (f ). Both types of cells efficiently ingested the 500 nm PLGA indicated by the solid histogram completed shifted to the right side of the x -axis, indicating particles are taken up by all exposed cells. Quantification of particle-laden numbers (i ) in both types of cells for mono-culture and co-culture systems

Currently, different uptake pathways by cancer cells in ingesting particles with different sizes and surface modifications like clathrin-mediated endocytosis, caveolae-mediated endocytosis, clathrin- and caveolae-independent endocytosis, micropinocytosis, and macropinocytosis have been claimed in the literature [37]. For instance, it has been proved that iron oxide aggregates with a size of < 200 nm are taken up by MCF-7 cells through the clathrin-mediated endocytosis, whereas larger aggregates tend to be ingested via macropinocytosis [38]. Another study has demonstrated that 100 nm plain polystyrene particles tended to be taken up mainly through macropinocytosis, whereas the internalization of carboxylated polystyrene particles prefer to occur via the clathrin-mediated endocytic route [25]. Phagocytosis is a classical uptake pathway for immune cells such as neutrophils, dendritic cells, and most importantly monocytes/macrophages. The uptake pathways tightly depend on various parameters of drug delivery vesicles, e.g. , the particle size, chemical composition, surface modification, proteins in the culture environment, as well as cell type. Usually, multiple uptake pathways can be involved in particle ingestion such as the caveolae-mediated endocytosis, clathrin-mediated endocytosis, and macropinocytosis, which has been found to participate in cellular internalization of 300–400 nm chitosan NPs in human HeLa cells [39]. It has also been observed that 63 nm cholesterol-modified pullulan NPs enter into the human hepatocellular carcinoma (HepG2) cells via macropinocytosis and clathrin-mediated endocytosis [40]. Several previous studies showed that PLGA particle cell uptake involves different endocytic pathways, in which clathrin-independent endocytosis is the main route responsible for the internalization of PLGA in in vitro models [23, 24, 37]. Nevertheless, once they entered into the cells, PLGA particles applied here were highly potentially entrapped by the endo-lysosomal system consisting of early endosomes, recycling endosomes, late endosomes, and lysosomes [41]. It should be noted, however, that there is a lack of studies showing the cellular uptake mechanisms in co- or tri-cultured systems in vitro, a notion that has to be probe in the future.

Induction of cell fusion by PLGA NPs

Extensive scientific evidence has shown that the fusion of monocytes/macrophages into multinucleated giant cells (MGCs) occurred in a broad range of biological processes [42, 43]. Generally, implantation of biomaterials into the body causes a foreign body response characterized by the fusion of macrophages into MGCs and fibrotic encapsulation [44]. A wide type of human and murine primary cells like alveolar macrophages, splenic macrophages, microglia, bone-marrow-derived macrophages, and blood monocytes, as well as cell lines such as RAW264.7 and UG3 were also frequently observed to form MGCs in vitro [26, 45]. It is well-known that the macrophages form a fusogenic phenotype when they are unable to ingest foreign materials via phagocytosis because of the large size of particles or implants. So far, it is unclear whether in vitro macrophage cell fusion relates to the particle size in the range 100–1000 nm, which can be easily phagocytized. Here, the cell fusions were observed in all groups by microscopic examination (Fig. 9). The cellular fusion was confirmed only when multiple nuclei were found to share the same cytoplasm in both fluorescence images and bright-field images. Spontaneous formation of giant cells by THP-1 cells was occurred in the control group without particle treatment (Fig. 9a), with a fusion percentage of about 10% of the total cells (Fig. 9h), as reported in the literature [46]. Size-dependent cellular fusion was found for 100 and 500 nm PLGA particles, whereas 1 µm PLGA-induced insignificant enhancement of fusions in monoculture. This may be due to the small number of 1 µm PLGA particles exposed to cells (approximately 60 particles exposed to each cell at a concentration of 10 µg/mL). When the macrophages were co-cultured with cancer cells, the percentages of MGC formation were increased in all groups in comparison with the corresponding monoculture groups. In particular, there is a significant increment of cellular fusion for 1 µm PLGA (19%) in the mixed cell culture. The most prominent increase in fusion occurred in co-cultured 500 nm PLGA particles, which might be attributed to the large size of particles and sufficient particle numbers ingested per cell.

Visualization and quantification of THP-1 cell fusion in monoculture and co-culture systems. Cell fusion occurred in all groups including the control group without particle treatment for THP-1 cells (a ). Monocultured (b , c ) 100 nm and 500 nm NP-induced significant cell fusion compared to 1 µm PLGA group (d ), which has a slightly higher level than that of the control group. In co-cultured systems, 100 nm (g ) and 1 µm (e ) PLGA had an identical percentage of cellular fusion, which is apparently smaller than that of 500 nm group (f ). Quantification of cell fusion for all groups after 24 h incubation was displayed in h

The molecular machinery involved in macrophage fusion has been widely probed, achieving substantial progress [43]. For example, the formation of macrophage fusion receptors CD47and CD44 together allowed mediating the process of macrophage fusion, and subsequent the differentiation of giant cells [42] and miR-223 delivery by a NP vesicle permitted attenuating it [47]. Hence, further study should focus on the determination of key molecules in regulating particle-induced macrophage fusion and the dominant receptors expressed in the giant cell membrane. Another important concern is the fate of MGCs. It is believed that MGCs fused with particles or stimuli might subsequently experience the process of apoptosis or necrosis [48]. This may lead to the release of undigested particles or other giant materials to the other cells in vitro or biological tissues in vivo, further inducing the long-term inflammatory response or granulomas. On the other hand, the macrophage fusion itself may be benefit for NP drug delivery, for example, in tumorous tissues, the re-release of drugs from macrophages to the cancer cells might represent an enhanced tumor killing ability. More importantly, future nanomedicine study should address how to exploit the application of macrophage fusion for nanocarrier drug delivery to improved disease diagnosis and therapy. This is because not only macrophages an abundant type of immune cells in the body with the excellent uptake ability of nano-drugs, but also they may be used in targeted gene delivery for repair of injured tissues.