Microwave-Assisted Chitosan-Functionalized Graphene Oxide als gecontroleerd intracellulair nanosysteem voor medicijnafgifte voor synergetische antitumoractiviteit

Resultaten en discussie

Synthese en karakterisering

De morfologie van de gesynthetiseerde GO-vellen werd gekarakteriseerd door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). Figuur 1a onthult de uniforme grootteverdeling van GO-nanosheets onder 100 nm, met een gemiddelde grootte van ongeveer 45 nm. De hoge elektronendichtheid van GO vertoonde een beter contrast in vergelijking met chitosan, dat nauwelijks zichtbaar is vanwege de lage elektronendichtheid en gehydrateerde aard [21]. Vanwege het grotere oppervlak zijn GO-vellen op nanoschaal of gereduceerde GO-vellen op grote schaal gebruikt als medicijndragers [22]. Het geselecteerde gebied elektronendiffractiepatroon (SAED) in figuur 1c toont de concentrische ringen, wat de aanwezigheid van een polykristallijne aard demonstreert die overeenkomt met grafeenoxide [23].

een TEM-afbeelding met lage vergroting van GO-nanobladen, b TEM-afbeelding met hoge resolutie van nanosheets en c een typisch SAED-patroon van GO-nanobladen

Om GO-nanobladen in fysiologische oplossing te stabiliseren, werden chitosan-gefunctionaliseerde GO-nanobladen bereid door microgolfondersteunde reductie met behulp van een microgolfsysteem [24]. Het resulterende gereduceerde GO-chitosan (ChrGO) werd geanalyseerd met UV-Vis-spectrometrie. Figuur 2a toont de UV-Vis-spectra van GO en ChrGO. GO vertoonde een scherpe absorptiepiek bij 230 nm en een schouder bij 300 nm, wat wordt toegeschreven aan de π –π * overgang van aromatische C=C bindingen en n –π * overgang van C=O bindingen, respectievelijk [25, 26]. Nadat chitosan op GO was geënt, verschoof de piek bij 230 nm rood naar 270 nm voor ChrGO, en de schouder bij 300 nm verdween duidelijk, wat werd toegeschreven aan het gedeeltelijke herstel van elektronische conjugatie tussen de aromatische koolstofatomen [27]. Een zwarte oplossing van gesynthetiseerd ChrGO wordt getoond in Fig. 2b, wat de vorming van gedeeltelijk gereduceerd grafeenoxide (p-rGO) aangeeft. Zowel de GO-nanosheets als ChrGO waren goed verspreid in gedeïoniseerd H₂ O. De colloïdale stabiliteit van GO- of GO-derivaten in waterige oplossing is erg belangrijk voor hun biomedische toepassing. De resultaten suggereerden dat de chitosan na de reductie was geconjugeerd met GO.

een UV–Vis-spectrum van de GO-nanosheets en ChrGO in waterige oplossing, b foto's van GO nanosheets en gesynthetiseerde ChrGO

FTIR-spectroscopie werd uitgevoerd om de structuur van GO, chitosan en ChrGO te karakteriseren (figuur 3a). De karakteristieke pieken van GO bevonden zich op 3440 cm ⁻¹ en 1376 cm ⁻¹ , overeenkomend met respectievelijk O-H- en C-OH-bindingen. De piek bij 1072 cm ⁻¹ werd toegewezen aan de rektrilling van C–N–C. Opvallend is dat de pieken van chitosanmoleculen bij 2912 cm ⁻¹ en 2848 cm ⁻¹ werden toegeschreven aan de uitrekkende trillingen van de CH₃ – en –CH₂ – [28, 29]. Gefunctionaliseerd p-rGO met chitosan resulteerde in nieuwe bindingen, wat leidde tot nieuwe pieken in de ChrGO-spectra. Er is een significante afname van de intensiteiten van de C=O-band bij 1636 cm ⁻¹ in ChrGO vergeleken met die in GO, wat suggereert dat het reductieproces de zuurstofbevattende groepen van GO verwijderde [30]. Het FTIR-spectrum van ChrGO bevestigde de succesvolle conjugatie van chitosan op GO. Daarnaast werd Raman-spectroscopie gebruikt om de elektronische eigenschappen en structuur van grafeen te karakteriseren. De G-band wordt toegeschreven aan de E _2g fononen van sp ² koolstofdomeinen, terwijl de D-band wordt toegewezen aan de vibratie van sp ³ koolstofatoomdomeinen en ongeordende koolstofatomen. De intensiteit van de D-band geeft de kenmerken van aandoeningen en defecten in carbonvellen aan [31]. De reductie van GO-nanosheets werd ook geanalyseerd in de signaalverhouding van de D versus G-band [32]. Het representatieve Raman-spectrum van GO toont twee karakteristieke pieken van de D-band (1341 cm ⁻¹ ) en de G-band (1591 cm ⁻¹ ) in Afb. 3b. Verandering in de relatieve intensiteit van I_D /I_G waarde illustreert de verandering in de elektronische conjugatiestatus van de GO in het reductieproces [33]. De verschuiving van de D-band toont succesvolle functionalisering van verminderde GO. De waarde van I _D /Ik _G stijgt van 0,99 (GO) naar 1,12 (ChrGO), wat wordt toegeschreven aan de introductie van sp3 defecten na functionalisering en onvolledig herstel van de karakteristieke structuur van grafeen [34]. Deze waarneming komt goed overeen met het vorige rapport en suggereert de vorming van chitosan-gefunctionaliseerd grafeen [16].

een FTIR-spectra van GO, ChrGO en chitosan, b Raman-spectra van GO en ChrGO

De oppervlaktesamenstelling van ChrGO werd bevestigd door XPS. De volledige scan van het XPS-spectrum van ChrGO toont drie pieken bij 284, 399 en 533 eV, die respectievelijk zijn toegewezen aan C1s, N1s en O1s (Fig. 4a). De relatieve elementanalyse toonde een toename van de ChrGO-zuurstof- en stikstofniveaus, met een bijbehorende afname van het koolstofgehalte in vergelijking met GO. De C1s-spectra met hoge resolutie van ChrGO getoond in Fig. 4b vertonen vier gescheiden pieken, overeenkomend met C-C of C=C (sp ² , 284,7 eV), C-O (epoxy/hydroxyl, 286,4 eV), C=O (sp ³ , 288,2 eV) en O=C-O (carboxylaten, 289,1 eV) bindingen. Het verschijnen van een amidepiek in ChrGO levert bewijs voor de functionalisering van chitosan op GO [35]. De overvloedige hydrofiele functionele groepen op het oppervlak maakten ChrGO zeer oplosbaar in een waterige oplossing, wat consistent is met de FTIR-resultaten. De biomoleculen zoals reductieve aminozuren en alfa-linoleenzuur in het gistextract kunnen een belangrijke rol spelen bij de microgolf-ondersteunde fabricage van ChrGO [20].

een Onderzoek XPS-spectra van GO en ChrGO, b hoge resolutie spectra van C1's

Het röntgendiffractiepatroon (XRD) van GO en ChrGO wordt weergegeven in figuur 5a. In GO XRD-spectra vertonen de hoofdpiek bij 11,0° en de zwakke piek bij 20,7° duidelijk de grafietstructuur. De kenmerkende diffractiepiek bij 11,0 ° komt overeen met het (001) vlak van GO, wat de succesvolle synthese van GO laat zien [36]. De kleine bult tussen 20° en 24° toont de grafietresten, die worden toegeschreven aan het niet-geoxideerde ongerepte grafiet [37]. Met de functionalisering van chitosan verdwijnt de (001) piek van GO, terwijl de brede diffractiepiek bij 21,4 ° prominent wordt. Deze verschuiving kan worden toegeschreven aan de verlaging van de GO, waarbij de verlaging het rGO-pakket strakker maakt dan de GO. De (002) reflectie van het ChrGO-monster is erg breed, wat suggereert dat het monster erg slecht is geordend langs de stapelrichting, wat kan worden toegeschreven aan de onvolledige reductie van GO [33]. Het ontledingsgedrag van GO, chitosan en ChrGO is bestudeerd door thermische zwaartekrachtanalyse (TGA) [38]. De TGA-curven van ChrGO, GO en chitosan worden getoond in Fig. 5b, die werden gemeten in een stikstofatmosfeer. GO begon gewicht te verliezen onder 100 °C, wat werd toegeschreven aan de eliminatie van geadsorbeerd vrij water in de gestapelde structuur [39]. De GO verloor 42% van zijn gewicht in het bereik van 191-231 ° C, wat verband hield met de ontleding van labiele zuurstofbevattende groepen. De snelheid van gewichtsverlies van ChrGO bij 100-250 ° C is aanzienlijk lager dan die van GO, en het is duidelijk dat ChrGO een ander ontbindingspatroon vertoonde in vergelijking met GO. De thermische eliminatie van ChrGO en zuiver chitosan vond plaats van 250 tot 440 ° C, wat verband houdt met de depolymerisatie en pyrolyse van stabielere functionele groepen, zoals glycosidische eenheden van chitosan en carboxylgroepen [40]. Vergeleken met GO was ChrGO thermisch stabiel en gaf het een groot gewichtsverlies van 36% in de eerste ontbindingsfase bij 250-440 ° C, terwijl er weinig gewichtsverlies wordt weergegeven voor de GO. Het significante gewichtsverlies in het hogetemperatuurgebied van 450-800 °C was te wijten aan de thermische afbraak van het koolstofskelet, wat kan worden toegeschreven aan de chitosanresiduen en biomoleculen van gistextract zoals aminozuren [41].

een XRD-patronen van GO en ChrGO, b TGA-curven van GO, chitosan en ChrGO

De oppervlaktelading van GO en ChrGO werd gemeten met een Malvern Zeta Nano ZS-90-instrument, wat een belangrijke parameter is van colloïdale stabiliteit. De hogere oppervlakteladingsdichtheid op GO-nanosheets zorgt voor een stabielere colloïdale dispersie [42]. Zoals weergegeven in aanvullend bestand 1:Fig. S1 nam het zeta-potentiaal van GO monotoon af van -10,7 mV bij pH 3 tot 35,5 mV bij pH 11, wat de negatieve lading op het oppervlak van de GO-nanobladen bevestigde. De zeta-potentiële waarde voor ChrGO was relatief minder dan het potentieel van GO bij elke pH variërend van 3 tot 11. ChrGO-nanosheets vertoonden stabiliteit over het gehele bereik van pH-waarden, terwijl verminderde GO-colloïden naar verluidt minder stabiel waren in gedeïoniseerd water vanwege toegenomen π –π stapelen in de zuurstofarme oppervlakken [43]. Hoewel sommige vrije aminegroepen aanwezig waren op het oppervlak van chitosan [44], werd een hogere zeta-potentiaal van ChrGO niet bereikt. De lagere zeta-potentiële waarde van ChrGO kan worden toegeschreven aan de overvloedige negatieve aminozuurmoleculen uit het gistextract, die de colloïdale stabiliteit in fysiologische oplossing verbeterden [20]. Het negatief geladen oppervlak van ChrGO maakt ze mogelijk toepasbaar voor het laden en afleveren van het medicijn.

Biocompatibiliteit van As-Synthesized ChrGO

De biocompatibiliteit van as-gesynthetiseerde ChrGO is belangrijk voor zijn toepassingen bij medicijnafgifte. De celcytotoxiciteit van ChrGO en GO werd onderzocht door middel van een cytotoxiciteitstest. Cos-7-cellen en BT-474-cellen werden 24 uur geïncubeerd in aanwezigheid van ChrGO of GO. De resultaten van celcytotoxiciteit worden getoond in Fig. 6. Er kon worden geconcludeerd dat ChrGO geen duidelijke celcytotoxiciteit vertoonde voor Cos-7- en BT-474-cellen. Zelfs bij een concentratie van 100 μg/ml was de levensvatbaarheid van de cellen meer dan 90%. GO vertoonde echter significante celcytotoxiciteit op een dosisafhankelijke manier, met slechts 73,0 ± 0,5% en 71,0 ± 0,5% celoverleving voor Cos-7- en BT-474-cellen bij een concentratie van respectievelijk 100 μg/ml. De resultaten toonden aan dat chitosan gefunctionaliseerd op het oppervlak van GO een zeer lage cytotoxiciteit vertoonde en de biocompatibiliteit verbeterde. Er is gemeld dat oppervlaktefunctionalisering van GO met macromoleculen de cytotoxische effecten ervan opmerkelijk verzacht [45]. Hu et al. rapporteerde dat foetaal runderserum in celmedium de celcytotoxiciteit van GO in niet-kleincellige longkanker A549-cellen [46] aanzienlijk verminderde.

Biocompatibiliteit van GO en ChrGO. Variërende concentraties van nanodeeltjes werden gekweekt met a Cos-7 cellen en b BT-474-cellen en hun effect op de levensvatbaarheid van de cellen werd bepaald

Drug laden en vrijgeven

De potentiële biomedische toepassing van ChrGO als medicijndrager wordt gemeten aan de hand van het laad- en afgiftegedrag van het medicijn. De structurele kenmerken van grafeenderivaten zijn zeer effectief voor de afgifte van aromatische geneesmiddelen vanwege hun zeer grote specifieke oppervlak. Adriamycine is een van de primaire chemotherapeutica voor tumoren tegen een verscheidenheid aan hematologische maligniteiten en solide tumoren en wordt vaak gebruikt als een modelgeneesmiddel om de toedieningssystemen van grafeenderivaten te evalueren [47]. De laadcapaciteit van adriamycine op ChrGO-nanosheets werd geverifieerd door de karakteristieke UV-Vis-absorptiepiek van adriamycine bij 490 nm. Zoals verwacht, was de maximale laadefficiëntie van adriamycine gebonden aan ChrGO-nanobladen maar liefst 169,8%, wat gedeeltelijk werd toegeschreven aan het grote oppervlak van de ChrGO-nanobladen. De met adriamycine beladen ChrGO/adriamycine-nanocomposieten werden gemakkelijk gedispergeerd in een fysiologische buffer en vertoonden een transparante oplossing met een licht roodachtige kleur.

Om het afgifteprofiel van adriamycine uit de ChrGO / adriamycine-complexen te onderzoeken, werden de verschillende pH-waarden van PBS geïntroduceerd om tumorcelomgevingen te imiteren. Aanvullend bestand 1:Fig. S2 toont de cumulatieve afgifteprofielen van adriamycine uit de ChrGO/adriamycine bij pH 5 en 7,4. De adriamycine die vrijkwam uit ChrGO / adriamycine werd gekenmerkt door een aanvankelijke snelle afgifte en vervolgens een fase van langzamere afgifte in een pH 5,0 PBS-oplossing. De cumulatieve afgifte van adriamycine was 6,5% in de eerste 3 uur en vertoonde daarna een langzame toename tot 26,7% in 96 uur bij pH 5,0. Daarentegen nam het adriamycinepercentage van de ChrGO/adriamycine langzamer toe en was lager bij pH 7,4, met een afgiftepercentage van adriamycine van 2,5% in de eerdere 3 uur tot 7,4% in 96 uur. Eerdere studies hebben de afgifteprofielen van geneesmiddelen van gefunctionaliseerd GO zeer langzaam aangetoond in een medium met een pH van 7,4 [48]. De protonering van carboxylgroepen op ChrGO vermindert π–π-stapeling, H-binding en elektrostatische interacties tussen adriamycine en ChrGO, wat de afgifte van adriamycine in het azijnmedium vergemakkelijkt [49]. De pH-gevoeligheid geeft ChrGO/adriamycine potentieel voor plaatsspecifieke medicijnafgifte, wat vervolgens de cytotoxiciteit in tumorcellen verhoogt.

Therapeutische werkzaamheid van ChrGO/Adriamycine-complexen

De therapeutische werkzaamheid van de ChrGO / adriamycine-complexen in HER2-tot overexpressie brengende BT-474-kankercellen werd onderzocht met de proliferatieremmingstest. Overexpressie van de HER2-receptor speelt een sleutelrol bij de transformatie van BT-474-borstkankercellen. Behandeling met alleen trastuzumab, een anti-HER2 monoklonaal antilichaam, resulteert in significante groeiremming van BT-474-cellen [50]. As shown in Fig. 7a, after treatment with ChrGO/adriamycin complexes, the cell viability of BT-474 cells was decreased significantly, demonstrating a dosage-dependent toxic effect. Besides, when compared to free adriamycin, the ChrGO/adriamycin complexes demonstrated a less effective performance in killing BT-474 cells, which was ascribed to the gradual diffusion of loaded adriamycin rather than direct treatment with free adriamycin [51]. However, the therapeutic efficacy of the ChrGO/adriamycin complexes was close to that of free adriamycin as their concentration of ChrGO/adriamycin complexes increased, which can be explained by the sustained adriamycin release from the ChrGO carrier.

een In vitro cell viability of BT-474 cells incubated with concentrations of free adriamycin and adriamycin loaded in ChrGO/adriamycin complexes, b cytotoxicity of ChrGO/adriamycin complexes (5 μg/mL) in combination with trastuzumab (5 μg/mL) in BT-474 cells. Adria:adriamycin. **p  < 0.01, ***p  < 0.001

To study whether trastuzumab, an anti-HER2 monoclonal antibody, could improve the antitumour activity of equivalent amounts of adriamycin loaded on ChrGO, BT-474 cells were treated with trastuzumab alone or in combination with ChrGO/adriamycin. Treatment with trastuzumab alone produced a significant inhibition of BT-474 proliferation, which is consistent with a previous report [52]. The combined therapy with trastuzumab and ChrGO/adriamycin resulted in an enhanced cell growth inhibition effect, as shown by a reduction of 88.5% compared with a reduction of 54.5% with trastuzumab alone (5 μg/mL) and 59.5% with equivalent ChrGO/adriamycin alone (5 μg/mL) versus the negative control (Fig. 7b). The results suggest that the ChrGO system may be effectively used to develop composites for combination therapies, and the combined treatment of ChrGO/adriamycin and trastuzumab resulted in a modest, but significant, reduction of cell viability compared to each drug alone.

Cell Cycle Analysis and Apoptosis

To determine whether the ChrGO/adriamycin complexes have effects on cell cycle progression, a cell cycle assay of ChrGO/adriamycin complexes alone or in combination treatment with trastuzumab was performed on BT474 cells. As shown in Fig. 8a, flow cytometry analysis revealed that trastuzumab alone increased the cell population in the G0/G1 phase. Treatment with ChrGO/adriamycin alone mediated a significant reduction in the number of G0/G1 cells and accumulation in S phase and G2/M phase compared to control cells. Besides, ChrGO/adriamycin combined with trastuzumab mediated S phase arrest, accompanied by a significant decrease in the number of cells in the G0/G1 phase. While ChrGO/adriamycin is most active in the S phase of the cell cycle, ChrGO/adriamycin treatment with trastuzumab can cause an increase in G0/G1 phase compared to ChrGO/adriamycin alone. A previous report showed that trastuzumab can cause cell arrest in the G1 phase [53]. Adriamycin inhibits cell proliferation and DNA replication, ultimately leading to cell cycle arrest [54].

een Cell cycle analysis after treatment with ChrGO/adriamycin alone or in combination with trastuzumab in BT-474 cells, b effect of ChrGO/adriamycin (5 μg/mL) plus trastuzumab (5 μg/mL) on induction of apoptosis in BT-474 cells. Adria:adriamycin. **p  < 0.01, ***p  < 0.001

To assess the effects of ChrGO/adriamycin on apoptotic molecules, BT-474 cells were treated for 48 h with either ChrGO/adriamycin, trastuzumab, or a combinational treatment of both agents. For the visualization of apoptosis, caspase 3/7 activity has been extensively used as an apoptosis-specific marker due to its activity related to the process of apoptosis [55]. As observed from Fig. 8b, compared to the negative control, treatment with ChrGO/adriamycin (5 μg/mL) alone significantly increased the caspase 3/7 activity. However, trastuzumab (5 μg/mL) alone did not significantly increase caspase 3/7 expression, suggesting that trastuzumab does not induce apoptosis. In contrast, treatment with ChrGO/adriamycin (5 μg/mL) plus trastuzumab (5 μg/mL) significantly increased caspase 3/7 activity compared to that with each drug alone. The dual-targeted therapy showed higher apoptosis, indicating superior therapeutic efficacy due to the presence of different mechanisms of action. Similar to other studies, adriamycin amplifies the apoptotic response in HER2-overexpressing cancer cells [56]. In conclusion, ChrGO/adriamycin combined with trastuzumab induces cell cycle arrest and apoptosis, which ultimately results in augmented cell death.