Morfomechanische verstoringen van cellen op maat maken door middel van metaaloxide-nanodeeltjes

Resultaten

Karakterisering van SiO₂ NP's en TiO₂ NP's

SiO₂ NP's en TiO₂ NP's zijn gesynthetiseerd met verschillende en reproduceerbare syntheseroutes om NP's te verkrijgen met een smalle en gecontroleerde grootteverdeling (zie het gedeelte "Methoden"). Vervolgens werden NP's diep gekarakteriseerd door middel van TEM, DLS, ζ-potentiaal en XRD, zowel in water als in de celkweekmedia (DMEM) met verschillende concentraties eiwitbron (FBS). Dit is cruciaal, omdat de media-eiwitten het oppervlak van de NP's kunnen bedekken, waardoor hun fysisch-chemische eigenschappen en dus de biologische effecten veranderen [36]. TEM-analyses toonden aan dat SiO₂ NP's zijn bolvormig, met een gemiddelde diameter van 20  ±  2 nm (figuur 1a). TiO₂ NP's hebben een vergelijkbare grootte (25 ± 5 nm), maar een andere morfologie (Fig. 1). DLS-metingen uitgevoerd in water bij 96 h bevestigden een hydrodynamische straal van 21 ± 7 nm en 27 ± 12 nm voor SiO₂ NP's en TiO₂ NP's, respectievelijk (Fig. 1b en Fig. 1e). Zoals verwacht komen deze gegevens goed overeen met de TEM-waarnemingen. ζ-potentiaalanalyses bevestigden ook oppervlakteladingswaarden in water van − 45 ± 3 mV voor SiO₂ NP's en van − 50 ± 3 mV voor TiO₂ NP's (Fig. 1c, f). Zoals verwacht veranderden de fysisch-chemische eigenschappen van de NP's na inoculatie in de celkweekmedia. DLS bevestigde een significante toename van de NP-grootte, vooral in de aanwezigheid van DMEM aangevuld met 20% FBS (tabel 1). In het bijzonder SiO₂ NP's vertoonden een grootte van 29 ± 9 nm, terwijl TiO₂ NP's namen toe tot 41 ± 14 nm na 96 h. De vergroting van de DLS-piek waargenomen in de DMEM-metingen (met of zonder FBS) is een teken van NP's-agglomeratie, die kan worden bevorderd door de ionsterkte van het medium (gegevens niet getoond). Ook toonden de ζ-potentiaalmetingen aan dat de oppervlaktelading van beide NP's verschoof naar meer negatieve waarden. Dit grote tijdsafhankelijke fenomeen was te wijten aan de vrij stabiele eiwitcorona-vorming [37, 38] veroorzaakt door de aanwezigheid van serumeiwitten in celkweekmedia die waren geadsorbeerd op het oppervlak van NP's:de grootte en de lading van NP's veranderen als functie van de FBS-concentratie.

Karakteriseringen van SiO₂ NP's en TiO₂ NP's in water. een –d Representatieve TEM-afbeeldingen. b –e Dynamische lichtverstrooiing (DLS) en c –f ζ-potentiaalmetingen. g Röntgendiffractieanalyse (XRD) patroon van TiO₂ NP's

Het XRD-patroon van TiO₂ NP_S , gecalcineerd bij 430 °C, vertoonde een mengsel van anatase en rutiel kristallijne fasen (Fig. 1g) . De dominante pieken bij 2θ =-25,4 ° (101), 48,1 ° (200), 54,1 ° (211), 62,4 ° (204) en 68,8 ° (116) waren kenmerkend voor de anatasefase die goed overeenkwam met de standaard JCPDS-gegevens ( kaart nr:21-1272). De rutielfase werd weergegeven met diffractiepieken bij 27,5° (110), 36,2° (101) en 41,2° (111).

Opname van NP's in Caco-2- en A549-cellen

Om de hoeveelheid SiO₂ . te kwantificeren NP's en TiO₂ NP_S opgenomen door cellen, voerden we ICP-AES-elementanalyse uit op gelyseerde cellen als voorlopig onderzoek. Cellen werden behandeld met 15 g/ml en 45  μg/ml NP's. De experimentele gegevens bevestigden de aanwezigheid van SiO₂ NP's en TiO₂ NP's in beide cellijnen, met een tijdsafhankelijke internalisatie-efficiëntie (figuur 2a). TiO₂ NP's vertoonden een grotere opname met betrekking tot SiO₂ NP's. Dit was vooral duidelijk in de Caco-2, waar het Ti-gehalte intracellulaire concentraties bereikte van 8,2 ± 0,4μg en 9,7 ± 0,031 g na respectievelijk 72 h en 96 h. De hoeveelheid Ti die in de A549 werd gedetecteerd, was lager, omdat we 5  ± -0,599 g na 72 h en 7,12   ± -0,11 μg na 96  h incubatietijd vonden. SiO₂ NP's werden minder opgenomen door cellen in vergelijking met TiO₂ NP's, zelfs als de internalisatie meer uitgesproken was in Caco-2. Ook in dit geval is in feite de hoeveelheid geïnternaliseerd SiO₂ NP's in Caco-2-cellen waren 4,69 ± -0,031 g na 72 h en 5,78 ± -0,045 g na 96 h incubatie. De waarden namen af ​​in A549, waar we 2,58 ± 0,045 g kwantificeerden na 72 h en 4,7 ± 0,04 μg na 96 h.

TiO₂ NP's en SiO₂ Accumulatie van NP's in Caco-2- en A549-cellijnen blootgesteld aan 15 g/ml en 45  μg/ml TiO₂ NP's en SiO₂ NP's voor 24 h, 48 h, 72 h en 96 h. Cellen werden vervolgens geoogst, levende cellen werden geteld en het Ti- en Si-gehalte werd gemeten in 360.000 cellen (μg Ti en μg Si). Gegevens gerapporteerd als gemiddelde  ± SD van drie onafhankelijke experimenten; statistische significantie van blootgestelde cellen versus controlecellen voor p waarde < 0,05 (< 0,05*, < 0,01** en < 0,005***)

Effecten van NP's op CaCo-2 en A549:levensvatbaarheid van cellen, membraanschade en ROS-productie

De levensvatbaarheid van Caco-2 en A549-cellen werd geëvalueerd met de WST-8-assay. De behandeling met SiO₂ NP's en TiO₂ NP's induceerden een lichte dosisafhankelijke vermindering van de levensvatbaarheid in beide geteste cellijnen (Fig. 3). TiO₂ NP's induceerden een verhoogde cytotoxiciteit met betrekking tot SiO₂ NP's en de cellevensvatbaarheid van CaCo-2-cellen werd meer beïnvloed dan de A549, na behandeling met TiO₂ NP's. In het bijzonder zagen we een vermindering van de levensvatbaarheid van ongeveer 40% in Caco-2 behandeld met 45  μg/ml TiO₂ NP's voor 72 h. Deze reductie daalde verder tot 50% na 96 h, terwijl in A549-cellijnen TiO₂ NP's induceerden pas na 96   uur behandeling een vermindering van 30% van de levensvatbaarheid. De LDH-afgifte en ROS-productie werden geëvalueerd in Caco-2- en A549-cellen na blootstelling aan TiO₂ NP's en SiO₂ NP's. Zoals getoond in Fig. 4a, b, induceerden NP's celmembraanporatie (en inderdaad LDH-afgifte) in nauwe overeenstemming met de levensvatbaarheidsresultaten. Het effect was duidelijker in Caco-2 met betrekking tot A549, vooral op TiO₂ NP-behandeling, op de hoogste tijdstippen (72 en 96 h). Het LDH-afgiftepercentage bereikte een toename van ongeveer 160% ten opzichte van de onbehandelde (controle) cellen, na 96  h blootstelling. De ROS-generatie is uitgebreid bestudeerd omdat het een van de belangrijkste effecten is die door NP's worden veroorzaakt [39]. Dit fenomeen interfereert met de biologische afweerreactie van antioxidanten [40], hoewel het belangrijk is om te vermelden dat het echte actiemechanisme nog steeds wordt onderzocht. De potentiële NP-geïnduceerde oxidatieve stress werd geschat met een DCFH-DA-assay. Zoals verwacht stimuleerde de interactie tussen NP's en cellen de vorming van ROS, op een dosisafhankelijke manier met een sterk effect in Caco-2 op TiO₂ NP-behandeling (Fig. 4c, d). Het afgiftepercentage bereikte waarden van 165% met betrekking tot de controlecellen, bij de hoogste geteste concentratie.

Levensvatbaarheidstest (WST-8) van Caco-2 (a ) en A549 (b ) cellen na 24 h, 48 h, 72 h en 96 h blootstelling aan twee doses (15 μg/ml en 45 μg/ml) TiO₂ NP's en SiO₂ NP's. De levensvatbaarheid van met NP behandelde cellen werd genormaliseerd naar niet-behandelde controlecellen. Als positieve controle (P) werden cellen geïncubeerd met 5% DMSO (gegevens niet getoond). Gegevens gerapporteerd als gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke experimenten worden als statistisch significant beschouwd in vergelijking met controle (n = 8) voor p waarde < 0,05 (< 0,05*, < 0,01** en < 0,005***)

LDH (een –b ) en ROS (c –d ) testen op Caco-2- en A549-cellen. Cellen werden geïncubeerd met 15 g/ml en 45  μg/ml TiO₂ NP's en SiO₂ NP's voor 24 h, 48 h, 72 h en 96 h. Het percentage LDH-lekkage van met nanodeeltjes behandelde cellen wordt uitgedrukt ten opzichte van niet-behandelde controlecellen. Positieve controles (P) bestonden uit de behandeling van cellen met 0,9% Triton X-100 met ca. 500% LDH-toename (gegevens niet getoond). ROS-niveaus werden geregistreerd door Caco-2- en A549-cellen bloot te stellen aan 15 g/ml en 45  μg/ml TiO₂ NP's en SiO₂ NP's voor 24 h, 48 h, 72 h en 96 h geïncubeerd met 100 μM DCFH-DA. Celfluorescentie werd gemeten. Als positieve controle (P) werden cellen geïncubeerd met 500  μM H₂ O₂ toont een ca. 300% DCFH-DA-toename (niet weergegeven). Gegevens gerapporteerd als gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke experimenten worden als statistisch significant beschouwd in vergelijking met controle (n = 8) voor p waarde < 0,05 (< 0,05*, < 0,01** en < .005***)

Effecten geïnduceerd door NP's op antioxidantenactiviteit en lipideperoxidatie in Caco-2- en A549-cellen

SOD-enzym is betrokken bij het afweersysteem van antioxidanten na inductie van oxidatieve stress. Dit enzym katalyseert de dismutatie van zeer reactief superoxide (O₂ ^•− ) anion in peroxiden H₂ O₂ [41]. We zagen een dosisafhankelijke afname van de SOD-enzymactiviteit in zowel Caco-2 als A549 na incubatie met SiO₂ NP's en TiO₂ NP's (15 g/ml, 45 g/ml) op verschillende tijdstippen (van 24 tot 96 h) (Fig. 5a, b). In nauwe overeenstemming met de cytotoxiciteitsbeoordelingen was het effect duidelijker in de Caco-2 op TiO₂ NP blootstelling. De SOD-activiteitsniveaus waren bijvoorbeeld verlaagd van 4,1 ± ±0,2 E/ml in de controle tot 1,03 ± ±0,325 E/ml in Caco-2-cellen die waren blootgesteld aan 45  μg/ml TiO₂ NP's, na 96 h. De blootstelling aan dezelfde concentratie SiO₂ NP's verminderden de SOD-activiteit tot 1,45 ± 0,12 U/ml. De op MDA gebaseerde test werd gebruikt om mogelijke ROS-gemedieerde lipideperoxidatie te controleren, wat op zijn beurt een andere manier is om celoxidatieve stress te controleren. [42] De cellulaire niveaus van MDA groeiden na blootstelling aan de twee soorten NP's voor zowel Caco-2 als A549 (Fig. 5c, d). Zoals verwacht waren de verhoogde MDA-spiegels evenredig met de concentratie en blootstellingstijd.

een –d SOD- en MDA-assays op Caco-2- en A549-cellen. Cellen werden geïncubeerd met 15 g/ml en 45  μg/ml TiO₂ NP's en SiO₂ NP's voor 24 h, 48 h, 72 h, 96 h. De SOD-assay gebruikte een tetrazoliumzout voor de detectie van superoxideradicalen gegenereerd door xanthine-oxidase en hypoxanthine. De standaardcurve werd gebruikt als een positieve controle (gegevens niet getoond). De MDA-niveaus werden gedetecteerd door de kwantificering van MDA-TBA-adduct (OD =532 nm). Gegevens gerapporteerd als gemiddelde ± SD van drie onafhankelijke experimenten worden als statistisch significant beschouwd in vergelijking met controle (n = 8) voor p waarde < 0,05 (< 0,05*, < 0,01** en < 0,005***)

Morfomechanische effecten veroorzaakt door NP's

Confocale microscopie-analyses van Caco-2 en A549 geïncubeerd met 15 g/ml en 45  μg/ml SiO₂ NP's en TiO₂ NP's voor 24 h, 48 h, 72 h en 96 h worden gerapporteerd in Fig. 6 en 7. Controle Caco-2-cellen vertoonden een morfologie vergelijkbaar met intestinale enterocyten met tight junctions en borstelrand aan de apicale zijde [43]. Na behandeling met NP's stortten de tight junctions van de cellen in en het patroon van de cellen werd geïsoleerd, met een langwerpige vorm. Deze effecten waren duidelijker wanneer cellen werden behandeld met TiO₂ NP's bij 45 g / ml gedurende 72  h incubatietijd, die relevante veranderingen van de actinepatronen en veranderingen in de celmorfologie laten zien. De onbehandelde A549-cellen vertoonden een kiezelachtige vorm en functionele cel-celadhesies [44], terwijl de behandeling met NP's de cel-celcontacten verminderde en de celmorfologie aanpaste naar meer langwerpige vormen. Afbeelding 8 toont een ingezoomde confocale figuur, waarmee veranderingen in de actineverdeling kunnen worden gedetecteerd. De veranderde organisatie van het actinenetwerk na blootstelling aan NP (72 h van 45  μg/ml SiO₂ NP's en TiO₂ NP's) werd kwantitatief geanalyseerd door fluorescentiedichtheid en coherentie met behulp van ImageJ-software (Fig. 9). We kozen specifiek voor deze twee parameters omdat we dankzij de geïntegreerde dichtheid de hoeveelheid actine konden kwantificeren, terwijl coherentie ons informatie gaf over de mate van vezeloriëntatie in vergelijking met de omgeving [45]. Onbehandelde Caco-2-cellen hadden een dichtheidswaarde van 129,4 ±  16, en dit bleef onaangetast bij NP-behandelingen; de waarden waren 127,7 ± 20 en 128,5 ± 18 na blootstelling aan SiO₂ NP's en TiO₂ respectievelijk NP's, Fig. 9a). Evenzo bleef ook de dichtheid van met actine gekleurd netwerk hetzelfde in A549 voor en na de behandeling (68,4 ± 14, 67,9 ± 15 en 67,7 ± 18 voor negatieve controle, SiO₂ NP's en TiO₂ respectievelijk NP's, Fig. 9b). Hoewel NP-behandelingen geen verandering in de hoeveelheid actine veroorzaakten, suggereerden de coherentieanalyses een ongelijke ruimtelijke reorganisatie van actine. In Caco-2 zijn de coherentiewaarden van behandelde cellen voor SiO₂ NP (0,16 ± 0,04) en voor TiO₂ NP (0,09 ± 0,02) behandeling nam af ten opzichte van die van de controle (0,26 ± 0,03) (Fig. 9c). Even the A549 cells underwent a decrease of coherency after interacting with SiO₂ NPs and TiO₂ NPs (0.2 ± 0.07 and 0.158 ± 0.04) compared to the control cells (0.4 ± 0.03) (Fig. 9d). Hence, NPs induced a significant reorganization of actin network, which showed an actin isotropic orientation, but they did not change the overall quantity of actin expressed. In addition to cytoskeletal rearrangements, we also analyzed the area described by the nucleus/cytoplasm ratio. Values of N/C ratio were calculated as the ratio between nuclear area and the whole cellular area (measured performed on 15 cells). We observed opposite values following the treatment with 45 μg/ml of NPs for 72 h with significant statistical validity. In particular, the ratio was (0.40 ± 1.7) in untreated Caco-2 cells, and this increased up to 0.554 ± 0.09 and 0.62 ± 0.12 after SiO₂ NP and TiO₂ NP exposure (Fig. 9e). The trend was different in A549. The nuclear/cytoplasm ratio dropped down upon exposure to NPs from values of 0.550 ± 0.04 for control cells to 0.334 ± 0.06 for SiO₂ NPs and 0.225 ± 0.09 for TiO₂ NP's. After the morphological investigations, we analyzed the elastic properties of cells after exposing them to 45 μg/ml of SiO₂ NPs and TiO₂ NPs for 72 h by AFM, in force–volume mode. We measured the different elasticity expressed by Young’s modulus values in the nuclear and cytoplasmic region. Caco-2 cells displayed Young’s modulus value of 105 ± 25 kPa for nuclear region and 47 ± 21 kPa for the cytoplasm. After SiO₂ NP treatment, we observed a reduction of value to 42 ± 8 kPa for the nucleus and 19.59 ± 2 kPa for the cytoplasm. The effects were more evident after treatment with TiO₂ NPs:the Young modulus for the nucleus was 27 ± 4 kPa and 18 ± 4 kPa for the cytoplasm (Fig. 10a). We found an opposite outcome concerning the elastic properties of A549 cells. In this case, Young’s modulus was 129 ± 24 kPa for the nuclear region and 147 ± 26 kPa for the cytoplasmic area. After SiO₂ NP treatment, the values of elasticity increased to 152 ± 23 kPa for nucleus and 152 ± 25 kPa for cytoplasm. When cells were doped with TiO₂ NPs, Young’s modulus values drastically increased to 372 ± 60 kPa for nucleus region and 549 ± 40 kPa for cytoplasmic region (Fig. 10b).

Effects of SiO₂ NPS and TiO₂ NPs on actin network of Caco-2 cells. Caco2 were treated with 15 μg/ml and 45 μg/ml of NPs for 24 h, 48 h, 72 h, and 96 h; cells were fixed and then stained with Phalloidin–ATTO 488 and DAPI. The 2D images of cortical actin were acquired by a Zeiss LSM700 (Zeiss) confocal microscope equipped with an Axio Observer Z1 (Zeiss) inverted microscope using a × 100, 1.46 numerical aperture oil immersion lens. All data were processed by ZEN software (Zeiss)

Effect of SiO₂ NPS and TiO₂ NPs on actin network on A549 cells. A549 were treated with 15 μg/ml and 45 μg/ml of NPs for 24 h, 48 h, 72 h, and 96 h; successively they were fixed and stained with Phalloidin–ATTO 488 and DAPI. The 2D images of cortical actin were acquired by a Zeiss LSM700 (Zeiss) confocal microscope equipped with an Axio Observer Z1 (Zeiss) inverted microscope using a × 100, 1.46 numerical aperture oil immersion lens. All data were processed by ZEN software (Zeiss)

Local enlargement of confocal acquisitions acquired in Figs. 6 and 7 showed (more in details) the effect of SiO₂ NPS and TiO₂ NPs on actin network of Caco-2 and A549 cells after the exposure of 45 μg/ml of NPs for 72 h and 96 h

Integrated density (a , b ) and coherency (c , d ) for Caco-2 and A549 cells treated with 45 μg/ml of SiO₂ NPs and TiO₂ NPs after 72 h. The integrated density and coherency values were expressed as a mean value and relative SD, calculated from confocal acquisitions by ImageJ (calculation on 15 cells). The mean values and their standard deviations were reported in the histograms. Results were statistically significant for p < 0.05 (< 0.05*, < 0.01**, and < 0.005***). e Analyses of nucleus/cytoplasm ratio on Caco-2 and A549 after exposure to 45 μg/ml of SiO₂ NPs and TiO₂ NPs for 72 h. The ratio was calculated on 15 cells by ImageJ. The mean values and the SD were reported in the histogram. Results were statistically significant for p  < 0.05 (< 0.05*, < 0.01**, and < 0.005***)

Young’s modulus values expressed in kPa, calculated from the nuclear region and the cytoskeletal area of Caco-2 (a ) and A549 (b ) cell lines after a treatment to 45 μg/ml of SiO₂ NPs and TiO₂ NPs for 72 h