Tumorgerichte en biocompatibele MoSe2 Nanodots@Albumin-nanosferen als een middel voor dual-modaliteit therapie voor synergetische fotothermische radiotherapie

Abstract

Het integreren van meerdere tumortherapiefuncties in één nanoplatform is de afgelopen jaren een nieuwe strategie voor tumortherapie geweest. Hierin wordt een middel voor therapie met twee modaliteiten bestaande uit nanodots van molybdeenselenide (MoSe₂ ND's) en runderserumalbumine (BSA) geassembleerde nanosferen (MoSe₂ @BSA NSs) is met succes gesynthetiseerd. Na conjugatie van foliumzuur (FA) moleculen via polyethyleenglycol (PEG) "bruggen", de FA-MoSe₂ @BSA NS's waren uitgerust met een tumortargeting-functie. De BSA- en PEG-modificaties zorgden voor de onstabiele MoSe₂ ND's met uitstekende fysiologische stabiliteit. Sinds het eindproduct FA-MoSe₂ @BSA NS's hadden sterke bijna-infrarood (NIR) en röntgenabsorptie-eigenschappen, ze vertoonden goede fotothermische eigenschappen met uitstekende fotothermische stabiliteit en radiosensibilisatievermogen, en werden daarom onderzocht als fotothermische radiotherapiemiddelen. In vitro en in vivo experimenten gaven aan dat de FA-MoSe₂ @BSA NS's bezaten een zeer efficiënt tumortargeting-effect, grote biocompatibiliteit en synergetisch fotothermisch radiotherapie-effect. Dit werk suggereert dat dergelijke biocompatibele FA-MoSe₂ @BSA NS's kunnen een veelbelovend multifunctioneel middel voor tumortherapie met twee modaliteiten zijn voor gebruik in combinatietherapie voor tumoren.

Achtergrond

Wereldwijd komt borstkanker met een zeer hoge incidentie bij vrouwen voor en is berucht om zijn lage overlevingspercentage en hoge percentages van metastase en terugval [1,2,3]. Chirurgische resectie, radiotherapie (RT) en chemotherapie zijn in de praktijk veelgebruikte behandelstrategieën, hoewel deze therapieën nadelen hebben [4]. RT is een zeer effectieve therapie, maar ook schadelijk voor normaal weefsel. RT is onderzocht voor een verbeterd therapeutisch effect terwijl het de schadelijke effecten ervan vermindert. RT maakt gebruik van ioniserende straling (bijv. γ-straling, röntgenstraling) om watermoleculen te ioniseren tot reactieve vrije radicalen die lokaal DNA in kankercellen beschadigen, zelfs in diepe gebieden [5]. Aangezien de micro-omgeving van de tumor hypoxisch bleek te zijn, werd dit beschouwd als een van de belangrijkste obstakels voor RT [6, 7]. Gezien deze nadelen, werd gemeld dat het combineren van RT met andere therapeutische strategieën met andere modaliteit efficiënt was in het vergroten van de therapeutische effecten. Tot op heden is fotothermische therapie (PTT) uitgebreid onderzocht als een minimaal invasieve kankerbehandeling vanwege minder bijwerkingen, hoge specificiteit en minimale bijwerking voor normale weefsels [8,9,10,11,12,13,14,15 ]. PTT alleen is echter vaak onvoldoende vanwege onvolledige tumorsuppressie, vooral voor de ontoegankelijke tumoren, die mogelijk een tumorrecidief zouden kunnen veroorzaken [16,17,18]. Interessant is dat PTT naar verluidt leidde tot nabij-infrarood (NIR)-geïnduceerde hyperthermie die de bloedcirculatie in de tumor verhoogt en vervolgens de beschikbaarheid van zuurstof in de micro-omgeving van de tumor verhoogt, waardoor de cellen gevoeliger worden voor RT [19,20,21]. Het combineren van RT met PTT zou de voordelen van beide kunnen combineren, wat de voorkeur heeft voor het verbeteren van de therapeutische resultaten van kanker.

Onlangs hebben tweedimensionale (2D) gelaagde overgangsmetaal dichalcogeniden (TMD's), zoals MoS₂ , WS₂ , ReS₂ , enzovoort, zijn gebruikt als de NIR-adsorberende middelen of radiosensitizers voor het verbeteren van de werkzaamheid van PTT of RT vanwege hun fysieke eigenschappen [7, 19, 21]. Shen en co-auteurs hebben melding gemaakt van een bottom-up bereiding van uniform ultradun ReS₂ nanosheets voor beeldgestuurde zeer effectieve PTT en RT [21]. Naast deze TMD's is molybdeenselenide (MoSe₂ ) zijn gerapporteerd als een NIR fotothermische transducer voor PTT [22, 23]. Aangezien PTT alleen zijn nadeel heeft, is er meer reden voor de exploitatie van MoSe₂ eigenschappen zoals radiosensibilisatie voor een betere kankertherapie.

In dit werk hebben we eerst de ultrakleine MoSe₂ . voorbereid nanodots, die vervolgens werden geassembleerd met runderserumalbumine (BSA) tot nanosferen (NS's) en uiteindelijk geconjugeerd met tumortargeting-molecuul foliumzuur (FA) via polyethyleenglycol (PEG) "bruggen". Naast het geweldige fotothermische effect, heeft de verkregen FA-MoSe₂ @BSA NS's bleken uitstekende radiosensibilisatie-eigenschappen te hebben. De BSA-modificatie schonk de MoSe₂ nanodots (ND's) met uitstekende fysiologische stabiliteit en biocompatibiliteit. In vitro en in vivo experimenten toonden aan dat de FA-MoSe₂ @BSA NS's vertoonden een uitstekend tumortargeting-effect, terwijl ze tegelijkertijd fungeerden als NIR-fotothermisch middel en radiosensitizer voor synergetische fotothermische radiotherapie zonder toxiciteit voor gezondheidsweefsel.

Methoden

Materialen

FA-PEG₅₀₀₀ -NHS en CH₃ -PEG₅₀₀₀ -NHS werden verkregen van Shanghai Ponsure Biotech. Co. Ltd. Fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC), runderserumalbumine (BSA, gezuiverd ≥ 98,0%), bulk MoSe₂ poeder en Calcein-AM (CA)-propidiumjodide (PI) -kleuring werden gekocht bij Sigma-Aldrich (St. Louis, Mo, VS). 4′,6-Diamidino-2-fenylindol (DAPI) werd verkregen van Aladdin (Shanghai, China). Reagentia voor het kweken van cellen werden allemaal geleverd door Corning Inc. Cell counting kit-8 (CCK-8) werd geleverd door Dojindo Laboratories (Japan). Het γ-H2AX-antilichaam werd geleverd door Millipore (Temecula, CA).

Voorbereiding van FA-MoSe₂ @BSA NS'ers

Ten eerste, in een typische procedure, 50 mg MoSe₂ poeder werd toegevoegd aan het 25 ml gedestilleerd water met 20 minuten roeren en werd vervolgens gesoniceerd in een ijsbad met behulp van tip-sonicatie (Scientz-IID, 950 W, 25 kHz). De sonicatie werd gepulseerd gedurende 2 s aan en 3 s uit voor een totale sonicatietijd van 12 uur met een amplitude van 70%. Daarna werd het mengsel 25 min gecentrifugeerd met 6000 rpm. Het supernatant werd verzameld en opnieuw 30 minuten bij 12.000 tpm gecentrifugeerd, wat resulteerde in MoSe₂ nanodots (MoSe₂ ND's) oplossing. Daarna werd onder licht roeren 25 mg BSA-poeder toegevoegd aan het bovenstaande supernatant, waarbij geharde coacervaten werden gevormd na 6 uur roeren onder 25 ° C en pH =-7,4, en werd vervolgens verwerkt door verknoping met 0,5% glutaaraldehyde (250 μL). Daarna werd het glutaaraldehyde verwijderd door 1 dag in water te dialyseren, wat resulteerde in de MoSe₂ @BSA-nanobolletjes (MoSe₂ @BSA NS). Vervolgens MoSe₂ @BSA-nanobolletjes werden in twee delen verdeeld, de ene is gemengd met FA-PEG₅₀₀₀ -NHS (8 mg), en de andere werd gemengd met CH₃ -PEG₅₀₀₀ -NHS (8 mg) oplossing en 2 uur geroerd. Ten slotte werd de oplossing gedialyseerd in water om te resulteren in gezuiverd FA-MoSe₂ @BSA NSs en MoSe₂ @BSA NSs-oplossing. De bereide oplossing werd bewaard bij 4 ° C. Bovendien werd een UV-VIS-spectrometer gebruikt om de FA op de FA-MoSe₂ te kwantificeren. @BSA NS. In detail, na het mengen van MoSe₂ @BSA-nanobolletjes met FA-PEG₅₀₀₀ -NHS (8 mg) en 2 uur reagerend, werd het mengsel gecentrifugeerd om de ongebonden FA te verwijderen. Het supernatant werd verzameld voor absorptiedetectie. De FA-concentratie werd gedetecteerd door een UV-vis-spectrometer bij de FA-absorptiepiekgolflengte (280 nm). De FA-inkapselingsefficiëntie (EE) werd berekend zoals beschreven in de volgende vergelijking:

$$ \mathrm{EE}\ \left(\%\right)=\frac{{\mathrm{FA}}_{\mathrm{total}}-{\mathrm{FA}}_{\mathrm{unloaded} }}{{\mathrm{FA}}_{\mathrm{total}}}\times 100\% $$

Kenmerken van FA-MoSe₂ @BSA NS'ers

De morfologie van de monsters werd waargenomen door transmissie-elektronenmicroscoop (TEM, JEOL JEM2011, Tokyo, Japan) en scanning elektronenmicroscoop (SEM, Hitachi FE-SEM S-9300, Janpan). Zetasizer (Nano ZS, Malvern Instruments Ltd., VK) werd gebruikt voor de grootte en het zeta-potentieel. De ultraviolet-zichtbare (UV-Vis) absorptiespectra werden geregistreerd op een UV2550 ultraviolet-zichtbare spectrofotometer (Shimadzu, Kyoto, Japan). De Fourier-transformatie-infraroodspectra (FTIR) werden gedetecteerd door een FTIR-spectrometer (BRUKER VERTEX 70, Ettlingen, Duitsland). De röntgenpoederdiffractie (XRD) van de nanosferen werd geregistreerd door een röntgendiffractometer (Seifert Jso-Debyerex-2002, Duitsland). Het gehalte aan Mo in cellen en weefsel werd gemeten met inductief gekoppelde plasma-atomaire emissiespectrometrie (ICP-AES, Hitachi P4010, Japan). Tijdens NIR-bestraling werd elke 30 s de temperatuurvariatie geregistreerd met behulp van een thermokoppelthermometer (Fluke, VS).

Celcultuur en cellulaire opname

Muizenborsttumor 4T1-cellen werden gekocht van de American Type Culture Collection (ATCC) en gekweekt in DMEM-media aangevuld met 10% FBS en 1% penicilline-streptomycine bij 37 ° C met 5% CO₂ .

Voor cellulaire opname werd FITC gebruikt om de NS's te labelen door fysieke absorptie. 4T1-cellen hechtten aan glasplaatjes in platen met 6 putjes en werden geïncubeerd met gratis FITC, MoSe₂ @BSA NSs, FA-MoSe₂ @BSA NSs + FA en FA-MoSe₂ @BSA NSs bij dezelfde concentratie FITC (0,05 mg/ml) gedurende respectievelijk 3 uur. De cellen werden vervolgens driemaal gewassen met PBS en gefixeerd met 0, 2 ml glutaaraldehyde, gevolgd door kleuring met DAPI gedurende 10 minuten. De fluorescentiebeelden van cellen werden vastgelegd met behulp van de laserscanmicroscoop. Om de cellulaire opname verder te observeren, hebben 4T1-cellen (2 × 10⁵ cellen/putje) werden 24 uur gekweekt in een celkweekplaat met 6 putjes en vervolgens geïncubeerd met MoSe₂ @BSA NSs, FA-MoSe₂ @BSA NSs + FA en FA-MoSe₂ @BSA NS's voor 3 uur extra. Daarna werden de behandelde cellen driemaal voorzichtig met PBS gewassen, gehomogeniseerd en gedurende 4 uur behandeld met 1 ml aquaregia-oplossing. ICP-AES werd gebruikt om het Mo-gehalte in de cellen te detecteren. Opnameverhouding =$ \frac{\mathrm{Ma}}{\mathrm{Mb}} $× 100%, waarbij Ma de massa van de Mo in cellen is, en Mb de massa van het totale Mo is.

In vitro biocompatibiliteit

Ten eerste werd volbloed van gezondheidsmuizen verzameld om de in vitro hemolyse van de FA-MoSe₂ te detecteren @BSA NS. In detail werden rode bloedcellen (RBC's) verzameld door centrifugeren. Door de supernatanten weg te gooien, werden de verzamelde RBC's gemengd met FA-MoSe₂ @BSA NS's (in PBS, 1:4) bij vooraf bepaalde concentraties (50 g/ml, 100 μg/ml, 150 g/ml, 200 μg/ml en 400 g/ml). Als positieve of negatieve controle werden RBC's geïncubeerd met gedeïoniseerd water of PBS. Na 1 uur staan geïncubeerd bij 37 ° C, werd de bovenstaande set suspensies gecentrifugeerd (10.000 rpm, 1 min) en de absorptie van de supernatanten bij 541 nm werd gevolgd door een UV-Vis-spectrometer. De hemolyseverhouding werd berekend met behulp van de volgende vergelijking.

$$ \mathrm{HR}\ \left(\%\right)=\frac{\ {A}_t-{A}_{nc}}{A_{pc}-{A}_{nc}}\times 100\% $$

waar A _t , A _pc , en A _nc zijn respectievelijk de absorptie van het supernatant bij 541 nm van het testmonster, positieve en negatieve controles.

Bovendien is de cytotoxiciteit van MoSe₂ @BSA NSs en FA-MoSe₂ @BSA NS's werden gedetecteerd met een standaard CCK-8-assay. 4T1-cellen (1 × 10⁵ cellen / ml, 0,5 ml) werden gezaaid in een plaat met 96 putjes en 24 uur gekweekt. Na het weggooien van de oude media, verse media met 0,01, 0,1, 0,15, 0,3 en 0,4 mg/ml MoSe₂ @BSA NSs en FA-MoSe₂ @BSA NS's werden 24 uur geïncubeerd met 4T1-cellen. PBS werd gebruikt om de cellen driemaal mild te wassen. Een 100 μL CCK-8-werkoplossing (10% CCK-8 +-90% DMEM) werd vervolgens aan elk putje toegevoegd, gevolgd door incubatie bij 37 ° C gedurende 1 uur. De absorptiewaarde bij 450 nm is gedetecteerd met een microplaatlezer (Labtech, Inc., Durham, North Carolina).

In vitro fotothermische radiotherapie

Ten eerste werd de in vitro fotothermische prestatie van de NSs onderzocht. MoSe₂ @BSA NSs en FA-MoSe₂ @BSA NS's met dezelfde Mo-concentraties 3 uur gekweekt met cellen en vervolgens 5 min bestraald met NIR-bestraling (808 nm, 1 W/cm² ). De temperatuur van de behandelde cellen in elk putje werd respectievelijk gedetecteerd met een infrarood thermische camera (Fluke TI25, VS).

Vervolgens werden voor in vitro fotothermische therapie hechtende 4T1-cellen gekweekt met verschillende concentraties MoSe₂ @BSA NSs en FA-MoSe₂ @BSA NS's gedurende 3 uur. De NS's buiten de cellen werden verwijderd. De cellen werden vervolgens behandeld met of zonder NIR (808 nm, 1 W/cm² , 5 min) en verschillende doseringen van röntgenstraling (RT, 0-5 Gy, 0,084 Gy/s). Na nog een incubatie van 24 uur werd de levensvatbaarheid van de cellen gedetecteerd met een standaard CCK-8-assay. De behandelde cellen hierboven werden verder co-gekleurd door calceïne-AM/PI om de levende en dode cellen te detecteren en vervolgens afgebeeld met een confocale laserscanningmicroscoop (calceïne-AM:Ex = 488 nm, Em = 515 nm; PI:Ex =535 nm, Em = 617 nm). Bovendien werden de behandelde cellen ook geanalyseerd met γ-H2AX-immunofluorescentie. Na de bovenstaande behandeling werden de cellen gedurende 10 minuten gefixeerd met 4% paraformaldehyde en 15 minuten bij -20 ° C gepermeabeliseerd met methanol en gewassen met PBS. Daarna werden de cellen gemengd met een blokkerende buffer (1% BSA in PBS-oplossing) gedurende 1 uur bij 25 ° C en verder geïncubeerd met anti-fosfo-histon γ-H2AX monoklonaal muisantilichaam (verdunning 1:500) overnacht bij 4 ° C. Na het wassen met PBS werd de fluorescentie van de cellen waargenomen met een confocale laserscanmicroscoop.

Dierenmodel

Balb / c naakte muizen (5-8 weken oud) werden geleverd door Charles River Laboratories (Beijing, China). Om een dierlijk 4T1-tumormodel vast te stellen, 150 L van 10⁶ suspensiecellen werden subcutaan in de rug van de muis geïnjecteerd. De muizen werden in de dierenkamer gevoerd en om de 2 dagen geobserveerd. Alle welzijns- en experimentele procedures in deze studie werden uitgevoerd in overeenstemming met het beleid van het nationale ministerie van Volksgezondheid en goedgekeurd door de ethische commissie van het First People's Hospital van Shangqiu City. Toen het tumorvolume 100 mm bereikte³ , werden de muizen aangevraagd voor in vivo experimenten.

In vivo biodistributie en bloedcirculatie

Systemische biodistributie van de NS's werd onderzocht in 4T1-tumordragende muizen. 1 uur, 1 dag, 7 dagen en 24 dagen na intraveneuze injectie van MoSe₂ @BSA NSs en FA-MoSe₂ @BSA (10 mg/kg), werden de tumor en de belangrijkste organen (hart, lever, milt, long en nier) 12 uur gewogen en verteerd door middel van aqua regia-oplossing. Het Mo- en Se-gehalte in deze weefsels werd geanalyseerd door een ICP-AES. Bovendien werden gezonde Balb/c-muizen intraveneus geïnjecteerd met FA-MoSe₂ @BSA (10 mg/kg). Ongeveer 10 μL bloed uit de staart van muizen werd verzameld en geanalyseerd door een ICP-AES op bloedcirculatie.

In vivo fotothermische radiotherapie

Voor in vivo fotothermische radiotherapie kunnen tumordragende muizen (n = 5 per groep) werden behandeld met PBS + NIR, PBS + RT, MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT, FA-MoSe₂ @BSA NSs + RT, FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR en FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT (met 5 mg/kg MoSe₂ ). De radiotherapiedosis was 5 Gy. 24 uur na intraveneuze injectie werd het tumorgebied bestraald met 5 min NIR-bestraling (808 nm, 1 W/cm² ). Tijdens de bestraling werden de thermische beelden van de muizen opgenomen door een infrarood thermische camera. In de volgende 30 dagen werden de lengte en breedte van de tumor elke 4 dagen gecontroleerd. Het relatieve tumorvolume werd berekend als V /V ₀ , waar V ₀ vertegenwoordigt het tumorvolume toen de behandeling werd gestart. Ondertussen werd het lichaamsgewicht van elke muis ook om de 4 dagen gecontroleerd.

In vivo biocompatibiliteit

Voor in vivo biocompatibiliteit, 150 μL FA-MoSe₂ @BSA NSs (15 mg/kg) werd intraveneus geïnjecteerd in gezonde Balb/c naakte muizen. Vóór injectie en na 30 dagen werd het bloed verzameld voor volledige evaluatie van het bloedbeeld, waaronder witte bloedcellen (WBC), rode bloedcellen (RBC), hemoglobine (HGB), gemiddeld bloedplaatjesvolume (MPV), gemiddeld corpusculair hemoglobine (MCH), hematocriet (HCT), gemiddelde corpusculaire hemoglobineconcentratie (MCHC), gemiddeld corpusculair volume (MCV) en bloedplaatjes (PLT). Tegelijkertijd werden de muizen opgeofferd en het hart, de lever, de milt, de long en de nier werden verzameld. De verkregen organen werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde en in plakjes van 5 m gesneden en gekleurd met hematoxyline en eosine (H &E). De gekleurde coupes werden in beeld gebracht met een digitale microscoop.

Statistische analyse

Gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± SD. Tweezijdige studenten t test werd gebruikt om de statistische significantie van twee groepen te analyseren. De verschillen werden als significant beschouwd voor *P < 0,05 en zeer significant voor **P < 0.01.

Resultaten en discussie

Voorbereiding en karakterisering van FA-MoSe₂ @BSA NS'ers

De voorbereidingsprocedure van de FA-MoSe₂ @BSA NSs is afgebeeld in Fig. 1a. Kortom, onstabiele MoSe₂ nanodots werden bereid uit bulk MoSe₂ onder ultrasone trillingen, vervolgens gestabiliseerd en geassembleerd door BSA-eiwit, en gelijktijdig geconjugeerd aan het doelmolecuul FA via PEG-"bruggen". De voorbereide MoSe₂ ND's waren ultrakleine nanodots zoals waargenomen in TEM (figuur 1b). Het XRD-patroon van MoSe₂ ND's werden weergegeven in Aanvullend bestand 1:Afbeelding S1. De diffractiepiek bij 13,1° behoort tot het (002) vlak, overeenkomend met de piekpositie van bulk MoSe₂ . De duidelijke (002) piek geeft het bestaan aan van enkele lagen in de c-as van MoSe₂ ND's. De diffractiepiek van (100) vlak voor MoSe₂ ND's worden aanzienlijk breder in vergelijking met bulk MoSe₂ , die mogelijk afkomstig is van de verkleining van MoSe₂ ND's [23]. Na assemblage en conjugatie met BSA-eiwit en FA vormden de nanocomposieten bolachtige deeltjes (figuur 1c). De FTIR-spectra toonden het bestaan van –CONH- binding in FA-MoSe₂ @BSA NS's, wat aangeeft dat FA waarschijnlijk is geconjugeerd aan MoSe₂ via esterbinding (aanvullend bestand 1:Afbeelding S2). Daarnaast hebben we de FA gekwantificeerd op de FA-MoSe₂ @BSA-nanobolletjes, wat 10,5 ± 0,11% was. Uit DLS-analyse bleek dat de gemiddelde diameters van MoSe₂ ND's en FA-MoSe₂ @BSA NS's waren respectievelijk ongeveer 3,8 nm en 139,8 nm (Fig. 1d). Na 7 dagen opslag, de grootte van MoSe₂ ND's stegen van 3,8 naar 63,2 nm, terwijl FA-MoSe₂ @BSA NS's vertoonden geen duidelijke verandering in grootte (Fig. 1e), wat wijst op aggregatie en de lage stabiliteit van MoSe₂ ND's in langdurige opslag. Bovendien, wanneer gedispergeerd in verschillende media zoals water, PBS en celmedium, FA-MoSe₂ @BSA NS's vertoonden een vergelijkbare grootteverdeling (Fig. 1f). Deze resultaten wezen op de FA-MoSe₂ @BSA NS's zijn stabiel in fysiologische omstandigheden en deze verbeterde stabiliteit van MoSe₂ ND's worden waarschijnlijk toegeschreven aan BSA-assemblage en PEG-coating [24, 25]. Zoals weergegeven in Fig. 1g, zijn de ultraviolet-zichtbare (UV-Vis) spectra van MoSe₂ ND's en FA-MoSe₂ @BSA NS's hadden vergelijkbare hoge NIR-absorptiekenmerken, wat aangeeft dat de BSA- en FA-modificaties geen invloed hadden op de absorptie van MoSe₂ .

een Een schema van FA-MoSe₂ @BSA NSs-synthese. b TEM-afbeelding van MoSe₂ ND's. Inzet was het TEM-beeld met hoge resolutie. c De TEM- en SEM-afbeeldingen van FA-MoSe₂ @BSA NS. d De grootteverdeling van MoSe₂ ND's en FA-MoSe₂ @BSA NS. e De grootteverandering van MoSe₂ ND's en FA-MoSe₂ @BSA NS's in water gedurende 7 dagen. v De grootteverdeling van FA-MoSe₂ @BSA NS's in respectievelijk water, PBS en medium. g De absorptiespectra van MoSe₂ ND's en FA-MoSe₂ @BSA NS'ers

Fotothermisch effect van FA-MoSe₂ @BSA NS'ers

Afbeelding 2a laat zien dat de temperatuur van FA-MoSe₂ @BSA NSs-oplossing nam toe met toenemende concentraties (0-200 μg/ml). Na NIR-bestraling (808 nm, 1 W/cm² ) gedurende 5 min, de temperatuurverandering van FA-MoSe₂ @BSA NSs-oplossing bij 200 μg/ml bereikte ongeveer 41 °C, terwijl de temperatuur van zuiver water onder dezelfde omstandigheden slechts met ongeveer 1,5 °C toenam. Bovendien is de temperatuurverandering van FA-MoSe₂ @BSA NS's bestraald met verschillende vermogensintensiteiten (0,5–2,0 W/cm² ) gedurende 5 min werd ook opgenomen. Zoals weergegeven in figuur 2b, nam de temperatuur toe tot een maximum van 40,6 °C met toenemende laservermogensintensiteit. Afbeelding 2c toont de fotostabiliteit van FA-MoSe₂ @BSA NSs, wat impliceert dat de FA-MoSe₂ @BSA NS's behielden hun uitstekende fotothermische effecten zonder enige verzwakking van de temperatuurverhoging na drie cycli van NIR-bestraling. Deze resultaten toonden aan dat FA-MoSe₂ @BSA NS's hadden een aanzienlijke fotostabiliteit en uitstekende fotothermische eigenschappen. Zoals getoond in Fig. 2d, de Hounsfield unit (HU) waarden van FA-MoSe₂ @BSA NS's-beelden verkregen met computertomografie (CT) waren positief gecorreleerd met hun concentraties, wat aangeeft dat de NS's mogelijk als radiosensitizer kunnen worden gebruikt.

een Fotothermische verwarmingscurves van FA-MoSe₂ @BSA NSs-oplossing in verschillende concentraties (0, 50, 100 en 200 g/ml) onder 808 nm laserstraling bij een vermogensdichtheid van 1 W/cm² . b Fotothermische verwarmingscurves van FA-MoSe₂ @BSA NSs-oplossing bij 100 μg/ml onder 808 nm laserstraling bij verschillende vermogensdichtheid (0,5, 1, 1,5 en 2 W/cm² ). c Temperatuurvariaties van FA-MoSe₂ @BSA NS's onder drie cycli van 808 nm laserbestraling bij een vermogensdichtheid van 1 W/cm² . d CT-beelden (inzet) en HU-waarden van FA-MoSe₂ @BSA NS's met verschillende concentraties

Cellulaire opname en in vitro biocompatibiliteit

Om de cellulaire opname te evalueren, MoSe₂ @BSA NSs en FA-MoSe₂ @BSA NS's werden gelabeld door FITC. Zoals weergegeven in Fig. 3a, werd veel sterkere FITC-fluorescentie waargenomen in het cytoplasma in FA-MoSe₂ @BSA NSs-behandelde cellen, vergeleken met die van MoSe₂ @BSA NSs- en vrije FITC-behandelde cellen. ICP-AES kwantitatieve analyse toonde een hogere cellulaire opname van FA-MoSe₂ @BSA NSs dan MoSe₂ @BSA NS's (Fig. 3b). Deze resultaten toonden aan dat FA de cellulaire opname van FA-MoSe₂ . verhoogde @BSA NS. Interessant is dat na een FA-blokkering de FA-MoSe₂ @BSA NSs-behandelde cellen vertoonden zwakkere groene FITC-fluorescentie in het cytoplasma vergeleken met die zonder FA-blokkering. Overeenkomstig de celopnamesnelheid van FA-MoSe₂ @BSA NSs + FA-behandelde cellen is minder dan die van FA-MoSe₂ @BSA NSs-behandelde cellen. Het geeft aan dat de FA-receptor op het celmembraan wordt gehinderd (door vrije FA), en op zijn beurt vermindert het het richtend vermogen en de toegankelijkheid van FA-MoSe₂ @BSA NS. Het toont verder aan dat FA-receptor tot overexpressie wordt gebracht in 4T1-cellen en FA-MoSe2@BSA-NS's cellen binnenkomen waarschijnlijk via een receptor-gemedieerde endocytoseroute [26, 27].

een Confocale fluorescentiebeelden van 4T1-cellen na incubatie met vrij FITC en FITC-gelabeld MoSe₂ @BSA NSs, FA-MoSe₂ @BSA NSs + FA-blokkering en FA-MoSe₂ @BSA NS. Rode en blauwe kleuren vertegenwoordigen respectievelijk FITC-fluorescentie en DAPI-gekleurde celkernen. b ICP-AES kwantitatieve analyse van 4T1-cellen in de richting van MoSe₂ @BSA NSs, FA-MoSe₂ @BSA NSs + FA-blokkering en FA-MoSe₂ @BSA NS'ers

De in vitro biocompatibiliteit van de NS's werd geëvalueerd door hemolyse en cytotoxiciteitsanalyses. Afbeelding 4a toonde geen duidelijke hemolyse voor FA-MoSe₂ @BSA NSs-behandelde rode bloedcellen (RBC's) of PBS-behandelde RBC's. Bovendien, wanneer concentraties tot 0,4 mg/ml MoSe₂ @BSA NSs en FA-MoSe₂ @BSA NS's werden 24 uur met cellen geïncubeerd, er was minder dan 10% onderdrukking van de levensvatbaarheid. Deze resultaten suggereerden dat de FA-MoSe₂ @BSA NS's hebben een uitstekende biocompatibiliteit in vitro.

een Hemolyseverhouding van RBC's na 1 uur incubatie met FA-MoSe₂ @BSA NS's in verschillende concentraties. De inzet toont de foto van RBC's die zijn blootgesteld aan gedestilleerd water, PBS en FA-MoSe₂ @BSA NS's met verschillende concentraties gevolgd door centrifugeren. b Cellevensvatbaarheid van 4T1-cellen na behandeling met richting MoSe₂ @BSA NSs en FA-MoSe₂ @BSA NS's bij verschillende concentraties gedurende 24 uur

In vitro fotothermische radiotherapie

Zoals getoond in Fig. 5a, b, cellen behandeld met FA-MoSe₂ @BSA NS's vertoonden de hoogste temperatuurstijging (ΔT = 23,6 °C) na 5 min NIR-bestraling (808 nm, 1 W/cm² ) vergeleken met MoSe₂ @BSA NSs- en PBS-behandelde cellen. Figuur 5c toonde een verbetering van de RT-werkzaamheid door toevoeging van FA-MoSe₂ @BSA NS. Met toenemende röntgendoses neemt de RT-werkzaamheid van FA-MoSe₂ @BSA NS's verbeterden veel meer dan die van MoSe₂ @BSA NS. Er werd aangetoond dat FA-MoSe₂ @BSA NS's zouden het radiotherapie-effect kunnen versterken, waarschijnlijk vanwege hun röntgenverzwakkingsvermogen dat röntgenstralingsenergie in tumorcellen zou kunnen concentreren en secundaire Auger-elektronen zou kunnen genereren, wat resulteert in DNA-schade en onderdrukking van celgroei [28, 29].

een Warmtebeelden van PBS, MoSe₂ @BSA NSs en FA-MoSe₂ @BSA NSs behandelde cellen, en b de bijbehorende temperatuurveranderingscurven bij continue bestraling met een 808 nm-laser (1 W/cm² ). c Cellevensvatbaarheid van 4 T1-cellen behandeld met PBS, MoSe₂ @BSA NSs en FA-MoSe₂ @BSA NS's gecombineerd met een verschillende dosis röntgenstraling (0–5 Gy). d Cellevensvatbaarheid van 4T1-cellen behandeld met verschillende monsters onder 808 nm NIR-laser (5 min, 1 W/cm² ) en röntgenbestraling (5 Gy)

Voor verdere evaluatie van het gecombineerde RT- en PTT-therapeutisch effect werden 4T1-cellen behandeld met alleen NIR of RT, FA-MoSe₂ @BSA NSs + RT, FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR, of FA-MoSe₂ @BSA NS + NIR + RT. Zoals weergegeven in Fig. 5d, FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT-behandelde groep vertoonde de meest significante concentratieafhankelijke celdood, met een onderdrukkingspercentage van 92,8%. Het uitstekende therapeutische effect van de FA-MoSe₂ @BSA NSs was waarschijnlijk te wijten aan (1) de fotothermische ablatie van PTT en DNA-schade door RT van FA-MoSe₂ @BSA NS's, en (2) FA-targeting verbeterde de celinternalisatie van FA-MoSe₂ @BSA NS's en dus het genereren van meer warmte en röntgenstraling om de cellen te doden.

Zoals getoond in Fig. 6a, konden weinig dode cellen worden waargenomen in de PBS + NIR- en PBS + RT-controlegroepen. Ook al werden dode cellen gevonden in FA-MoSe₂ @BSA NSs + RT of FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR groepen, maar er bestonden nog levende cellen. Omgekeerd, in de FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT-groep, meer dan 95% van de cellen was beschadigd en vertoonde rode fluorescentie, wat aangeeft dat gecombineerde RT en PTT van FA-MoSe₂ @BSA NS's zouden de therapeutische efficiëntie kunnen verbeteren.

een Levend dood en b γ-H2AX-kleuringsbeelden van 4T1-cellen behandeld met PBS + RT, PBS + NIR, FA-MoSe₂ @BSA NSs, FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR, FA-MoSe₂ @BSA NSs + RT en FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT, respectievelijk

Sinds FA-MoSe₂ @BSA NS's hebben een hoge röntgenabsorptie, het zou potentieel hebben om RT te verbeteren. Zoals getoond in Fig. 6b, werden zeer lage niveaus van γ-H2AX-signalen waargenomen in de met PBS behandelde groepen, FA-MoSe₂ Alleen @BSA NSs en FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR-behandelde groepen. Ondertussen, FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT-behandelde groep vertoonden hogere niveaus van γ-H2AX-signalen, wat wijst op meer significante DNA-schade in celkernen. Deze resultaten toonden aan dat FA-MoSe₂ @BSA NS's zouden het RT-effect kunnen versterken dat wordt toegeschreven aan het vermogen om röntgenstraling te verzwakken, waardoor röntgenstralingsenergie in tumorcellen wordt geconcentreerd en secundaire en Auger-elektronen worden gegenereerd om DNA-schade en onderdrukking van celgroei te veroorzaken [30-32].

In vivo biodistributie en bloedcirculatie

Zoals getoond in Fig. 7a, b, verzamelden de Mo- en Se-elementen zich 24 uur na injectie in de tumor, behalve de lever en de nier. De inhoud van Mo-elementen in tumorweefsel na injecties met MoSe₂ @BSA NSs en FA-MoSe₂ @BSA NS'en werden ook geëvalueerd. Zoals weergegeven in Fig. 7c, zijn de Mo-niveaus in tumorweefsel voor FA-MoSe₂ @BSA NSs-treated group increased with time and reached the peak at 24-h post-injection, which was higher than that of MoSe₂ @BSA NSs-treated group. Figure 7d shows the blood circulation curve of Mo at different time point post-injection of FA-MoSe₂ @BSA NSs. The Mo t _1/2 α (blood distribution half-life) and t _1/2 β (blood terminal elimination half-life) of the FA-MoSe₂ @BSA NSs group are 0.91 ± 0.06 h and 16.96 ± 1.3 h, respectively. These results were likely due to (1) prolonged blood circulation promoted by PEG and BSA modifications [24, 33], (2) decreased macrophage clearance of nanoparticles by the reticuloendothelial system [34, 35], and (3) facilitated tumor targeting effect by the FA modification and subsequent accumulation in tumor tissues. The tumor optimum accumulation time of FA-MoSe₂ @BSA NSs could guide the in vivo photothermal radiotherapy.

De een Mo en b Se elements content of tumor and major organs including heart, liver, spleen, lung, and kidney in MoSe₂ @BSA NSs and FA-MoSe₂ @BSA NSs-treated mice. c Quantitative in vivo analysis of the Mo elements content of the tumor regions in MoSe₂ @BSA NSs and FA-MoSe₂ @BSA NSs-treated mice as a function of injection time. d Blood circulation curve of Mo at different time points post-injection of FA-MoSe₂ @BSA NSs

In Vivo Photothermal Radiotherapy

As shown in Fig. 8a, b, the temperature of the tumor region under NIR irradiation (5 min, 1 W/cm² ) showed about 22.1 °C increase at 24-h post-injection of FA-MoSe₂ @BSA NSs, compared with that of PBS- or MoSe₂ @BSA NSs-treated groups. This indicated that FA-MoSe₂ @BSA NSs have excellent photothermal effect in vivo. As shown in Fig. 8c, no distinct weight changes were observed in the control or any of the treated Balb/c mice during the 30-day treatment duration, demonstrating that the treatments did not affect the health of these mice. Next, 4T1-tumor-bearing mice were randomly divided into six groups. Group 1:NIR; group 2:RT; group 3:FA-MoSe₂ @BSA NSs + RT; group 4:FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR; group 5:MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT; and group 6:FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT. Then, 5 mg/kg of MoSe₂ was used in all groups. The radiotherapy dose was 5 Gy, and the dose rate is 0.084 Gy/s. At 24-h intravenous post injection, tumor region was irradiated by 5 min NIR irradiation (808 nm, 1 W/cm² ). The tumor sizes were closely monitored afterward (Fig. 8d). Compared to other groups, the most remarkable tumor growth inhibition was observed in group 6 after the combined photothermal-radiotherapy with FA-MoSe₂ @BSA NSs, achieving an obvious synergistic therapeutic outcome in comparison to PTT alone or RT alone delivered by FA-MoSe₂ @BSA NSs (Fig. 8d).

een In vivo thermal images of mouse after intravenous injection of saline, MoSe₂ @BSA NSs and FA-MoSe₂ @BSA NSs and durations NIR irradiation (808 nm, 1 W/cm² ). b The corresponding temperature change curves of tumor regions in mice. c The weight and d relative tumor volume profile of 4T1 xenografted tumors after intravenous injection of PBS + RT, PBS + NIR, FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR, FA-MoSe₂ @BSA NSs + RT, MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT, and FA-MoSe₂ @BSA NSs + NIR + RT, respectively. **P < 0.01 vs control group and other groups

In Vivo Biocompatibility

As a kind of nanoagent for in vivo biomedical applications, their potential toxic side effect is something that always requires particular attention. In addition to the body weight data of mice in different groups post various treatments in Fig. 8c, the H&E staining images of major organs and complete blood panel assays were provided to evaluate the safety of the FA-MoSe₂ @BSA NSs. As shown using H&E staining in Fig. 9a, no apparent pathological tissue damage or abnormality in major organs (heart, liver, spleen, lung, and kidney) was observed in FA-MoSe₂ @BSA NSs-treated mice. Moreover, as illustrated in Fig. 9b, the parameters of WBC, RBC, HGB, MCH, HCT, MCHC, MCV, and PLT for FA-MoSe₂ @BSA NSs-treated mice were within the normal range. These results demonstrated that FA-MoSe₂ @BSA NSs exhibited low toxicity and excellent in vivo biocompatibility.

een H&E-stained tissue sections of major organs, including the heart, liver, spleen, lung, and kidney from mice treated with FA-MoSe₂ @BSA NSs at day 0 and day 30 (scale bar = 100 μm). b Blood biochemistry of mice at days 0 and 30 post-treatment with FA-MoSe₂ @BSA NSs

Conclusies

In summary, MoSe2 NDs was first prepared by ultrasonication, and MoSe₂ @BSA nanospheres was then successfully synthesized via a simple BSA self-assembly method. The BSA surface provided a rich modifiable functional group that readily conjugated FA molecules, enabling the synthesis of versatile FA-MoSe₂ @BSA NSs which showed outstanding physiological stability and excellent tumor targeting effect. Due to the strong radio-sensitization ability and high NIR absorption of MoSe₂ NDs, FA-MoSe₂ @BSA NSs could be used as a photothermal agent for NIR-induced tumor ablation, and act as a radio-sensitizer to enhance the efficacy of RT. In vitro and in vivo experiments verified that FA-MoSe₂ @BSA NSs exhibited high cytotoxicity under NIR and X-ray irradiation, contributing to remarkably enhanced therapeutic effect in the tumor-targeted combined photothermal-radiotherapy. Most importantly, it was demonstrated that FA-MoSe₂ @BSA NSs have great biocompability in vitro and in vivo, encouraging further biomedical or clinic applications. Therefore, considering all the above desirable characteristics, the FA-MoSe₂ @BSA NSs with highly integrated functionalities is promising for applications in cancer therapy.