Pruisische blauwe mesenchymale stamcellen met nanodeeltjes:evaluatie van de levensvatbaarheid, proliferatie, migratie, differentiatie, cytoskelet en eiwitexpressie van cellen in vitro

Methoden

Celcultuur

Muis MSC's C3H10T1/2 werden verkregen van Nanjing KeyGen Biotech. Inc. Cellen werden gekweekt in Dulbecco's gemodificeerd Eagle's medium (DMEM; Hyclone, VS) aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS; Israël) en 1% penicilline-streptomycine (Hyclone, VS) bij 37 ° C met 5% CO>2 verzadiging en het medium werd om de 3 dagen vervangen. Na vier passages werden de cellen gebruikt voor experimenten.

Voorbereiding van PBNP's

Bij een typische synthese werd eerst 2,5 mmol citroenzuur (490 mg) toegevoegd aan een 20 ml 1,0 mM waterige FeCl₃ oplossing onder roeren bij 60 ° C. Aan deze oplossing werd druppelsgewijs een 20 ml 1,0 mM waterige K₄ . toegevoegd [Fe(CN)₆ ]-oplossing met 0,5 mmol citroenzuur (98 mg) bij 60 °C. Er vormde zich onmiddellijk een heldere helderblauwe dispersie. Na 30 min liet men de oplossing afkoelen tot kamertemperatuur terwijl het roeren nog 5 min bij kamertemperatuur werd voortgezet. Vervolgens werd een gelijk volume ethylalcohol aan de dispersie toegevoegd en gedurende 20 minuten bij 10.000 tpm gecentrifugeerd om de vorming van een pellet van nanodeeltjes te veroorzaken. De laatste werd weer gescheiden door toevoeging van een gelijk volume ethylalcohol en centrifugeren.

Karakterisering van PBNP's

De infraroodspectroscopie van de gesynthetiseerde PBNP's werd gemeten met een infraroodspectrofotometer (IR; Thermo Fisher Nicolet IS10). De morfologie van de gesynthetiseerde PBNP's werd onderzocht met transmissie-elektronenmicroscopie (TEM; JEM 2100F). Veldafhankelijke magnetisatie van PBNP's werd onderzocht met behulp van een vibrerende monstermagnetometer (VSM; Lakeshore 7307). Röntgendiffractie (XRD) analyse werd uitgevoerd met Bruker D8 ADVANCE A25X (XRD). De polydispersiteitsindex van de PBNP's werd bepaald door Zetasizer Nano ZS.

Intracellulaire distributies van PBNP's en ultrastructuur van gelabelde C3H10T1/2-cellen

Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) werd uitgevoerd om de intracellulaire distributies van PBNP's te beoordelen. Nadat het medium was verwijderd, werden de cellen gespoeld met PBS en vervolgens verteerd met 0,25% trypsine. Vervolgens werden de cellen overgebracht naar een EP-buis van 1,5 ml om te worden gecentrifugeerd (2000 tpm, 5 min). Vervolgens werd het supernatant verwijderd en werden de cellen gefixeerd met 0,25% glutaaraldehyde en 1% osmiumzuur. Nadat de cellen opnieuw waren gespoeld, werden de cellen gedurende 20 minuten elk 20 minuten gedehydrateerd in 50% ethanol, 70% ethanol, 90% ethanol, 90% aceton en 100% aceton. Vervolgens werden de cellen een nacht bij 4 ° C ingebed. Vervolgens werd 3% uraniumacetaat-citraat dubbele kleuring in secties uitgevoerd. Ten slotte werden afbeeldingen verzameld door TEM.

Scanning-elektronenmicroscopie (SEM) werd uitgevoerd om de ultrastructuur van gelabelde C3H10T1/2-cellen te beoordelen. Nadat het medium was verwijderd, werden de cellen gespoeld met PBS en gedurende de nacht gefixeerd met 3% glutaaraldehyd dat bij 4 ° C werd voorgekoeld. Vervolgens werden de cellen tweemaal gespoeld met PBS en gedurende 1 uur gefixeerd met 1% osminezuur bij 4 ° C. Nadat C3H10T1/2-cellen opnieuw waren gespoeld, werden de cellen gedehydrateerd in oplopende alcoholen (30% ethanol, 50% ethanol, 70% ethanol, 80% ethanol, 90% ethanol, 95% ethanol en 100% ethanol) gedurende 2 × 10 min elk. Vervolgens werden de cellen gedurende 15 minuten elk 15 minuten ondergedompeld in 70%, 80%, 90%, 95% en 100% acetonitriloplossing. Vervolgens werden vacuümdrogen en sproeicoaten van goud uitgevoerd. Ten slotte werden afbeeldingen verzameld door SEM.

Cell Viability Analyses van de PBNP's

De levensvatbaarheid van de cellen werd geëvalueerd met behulp van de MTT (Sigma, VS). Cellen werden gezaaid in platen met 96 putjes bij 1 × 10 ³ cellen per putje bij 37 °C met 5% CO₂ atmosfeer. Na een nacht incubatie werd het kweekmedium vervangen door 100 L vers medium met verschillende concentraties PBNP's (0, 5, 10, 20, 40 en 80 μg / ml), en vervolgens werden de cellen nog 1 tot 3 dagen gekweekt. Het kweekmedium werd verwijderd en de cellen werden gedurende 4 uur bij 37 ° C geïncubeerd met 20 μL MTT (5 mg / ml). De geprecipiteerde violette kleurstofkristallen werden gedurende 10 minuten opgelost in 150 μL dimethylsulfoxide (DMSO; Sigma-Aldrich, VS) door zachtjes te schudden. De waarde van de optische dichtheid (OD) werd gemeten bij een golflengte van 490 nm met behulp van een microplaatlezer. De resultaten van cellen werden uitgedrukt als percentage levensvatbare cellen.

Proliferatietest

Vergelijking met MTT, MTS, WST-1 en XTT, RTCA maakt de analyse van de hele periode van het experiment mogelijk en vereist geen labeling die celkweekexperimenten negatief beïnvloedt [19]. Dus het xCELLigence-systeem (Roche/ACEA Biosciences) werd gebruikt om celproliferatie in realtime te meten. In het kort werden cellen gezaaid in E-Plate-16 (ACEA Biosciences, Inc. San Diego, VS) bij 5 × 10 ³ cellen per putje met 150 μL compleet medium. Na 24 uur groeien werd het medium vervangen door vers medium met verschillende concentraties PBNP's en nog eens 96 uur geïncubeerd. Dit systeem heeft de elektrische impedantie gemeten, die werd gecreëerd door celhechting op de micro-elektrode-geïntegreerde celcultuurplaten [20], om de kwantitatieve informatie over het celaantal en de levensvatbaarheid in realtime te verschaffen door het RTCA-DP-instrument [21]. Cellulaire proliferatie werd gedurende de volgende 4 dagen periodiek elke 15 min gemeten.

Realtime monitoring van mobiele migratie

C3H10T1/2-celmigratie werd gemeten met behulp van een real-time celinvasie- en -migratie (RT-CIM) testsysteem (ACEA Biosciences, Inc. San Diego, VS). Cellen hebben het vermogen om de impedantie te verhogen om vandaar "Cell Index"-uitlezingen te krijgen wanneer ze contact maken met en zich hechten aan de sensoren als gevolg van de celmigratie van de bovenste kamer naar de onderste kamer door het membraan. Gewoon, cellen werden in de bovenste kamer gezaaid met een dichtheid van 4 × 10 ⁴ per putje in serumvrij medium in aanwezigheid van verschillende concentraties PBNP's. De onderste kamers van CIM-platen waren gevuld met 165 μL compleet medium met 10% FBS. Celmigratie werd elke 10 minuten gevolgd door een RTCA DP-instrument gedurende een periode van 100 uur. Celindex (CI) werd gebruikt om de resultaten weer te geven. De waarde van CI werd afgeleid van de verandering in elektrische impedantie wanneer de levende cellen interageren met het biocompatibele micro-elektrodeoppervlak in de microplaatput om het celaantal, de vorm en de hechting effectief te meten. Hoe meer het aantal gemigreerde cellen, hoe groter de celindex.

Cellulair migratieonderzoek via Transwell-assay

Na 48 uur te zijn gekweekt met verschillende concentraties PBNP's, werden de cellen met een dichtheid van 2 × 10 ⁶ cel/cm ² werden gekweekt in een Transwell-kamer (8 μm poriegrootte; BD FalconTM, VS) gedurende 24 uur bij 37 ° C en 5% CO₂ . Na het kweken werd de binnenkamer schoongemaakt en werden de gemigreerde cellen op de bodem van de kamer gefixeerd en gekleurd met 0,1% kristalviolet. Elke stap werd gevolgd door drie keer wassen met PBS gedurende 5 minuten. De gemigreerde cellen werden gefotografeerd in verschillende gezichtsvelden met behulp van een omgekeerde fase-contrastmicroscoop (CK2, Olympus, Japan).

In vitro celdifferentiatie

C3H10T1/2-cel-gelabelde of niet-gelabelde PBNP's werden geïnduceerd om te differentiëren in twee stroomafwaartse cellijnen van adipocyten of osteocyten. Nadat de cellen samenvloeiing hadden bereikt in een plaat met zes putjes, werden de cellen gekweekt in osteogeen inductiemedium (10% FBS/DMEM met 10 nM dexamethason, 50 μM ascorbinezuur, 10 mM β-glycerofosfaat, Sigma) of adipogeen inductiemedium (10% FBS/DMEM met 1 M dexamethason, 0,5 mM isobutylmethylxanthine, 10 μM insuline, Sigma). Na 3 weken werden de cellen gewassen met PBS, gefixeerd met 4% polyoxymethyleen en gekleurd met Alizarine Red of Oil Red O (Sigma). De geïnduceerde cellen werden gefotografeerd in verschillende gezichtsvelden met behulp van een omgekeerde fase-contrastmicroscoop (CK2, Olympus, Japan).

Immunofluorescentietest voor F-actinevisualisatie

MSC's werden 48 uur gekweekt met verschillende concentraties PBNP's op een plaat met 24 putjes. De cellen werden gedurende 10 minuten gefixeerd met 4% paraformaldehyde, 5 minuten permeabel gemaakt met 0,2% Triton-100, gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur geblokkeerd met 1% BSA in PBS en vervolgens gekweekt met falloidine (1:100, Thermo Fisher Scientific , VS) en DAPI (1:800, Thermo Fisher Scientific, VS) gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur. Fluorescentiemicroscopie werd uitgevoerd op een Nikon eclipse Ti-S-microscoop met NIS elements-software

Eiwitexpressie door Western Blot-analyse

De eiwitexpressie van de cellen werd geëvalueerd via Western-blot-analyse. De MSC's werden 24 uur gekweekt met het medium met verschillende concentraties PBNP's (0, 25, 50 g/ml) op platen met zes putjes, tweemaal gewassen met ijskoude PBS en geschraapt in 100 μl PIPA-buffer (Beyotime) met daarin proteaseremmers en natriumorthovanadaat (Beyotime, China). Na 30 minuten werden de monsters gecentrifugeerd bij 14.000 tpm gedurende 10 minuten bij 4 ° C, waarna de eiwitconcentraties van de monsters werden bepaald met behulp van BCA-kit (Beyotime, China). Dezelfde hoeveelheid eiwitten werd geëlektroforeerd in 10% SDS-PAGE-gels (Beyotime, China) en overgebracht naar PVDF-membraan (GE Healthcare). De membranen werden geblokkeerd met 5% melk in Tris-gebufferde zoutoplossing met Tween20 (TBST) bij kamertemperatuur gedurende 2 uur en vervolgens geïncubeerd met anti-β-catenine (1:1000, CST, VS), anti-vimentine (1:1000 , Abiocode) en anti-β-actine (1:1000, CST, VS) 's nachts bij 4 ° C. De membranen werden driemaal elk 5 minuten gewassen en vervolgens 2 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met de juiste secundaire antilichamen. Signalen werden gedetecteerd met ECL en ECL-plus (Beyotime, China) en blootgesteld aan Molecular Image® ChemiDoc™ XRS+-systeem (Bio-Rad Inc., VS) met Image Lab™-software met behulp van verbeterde chemiluminescentie.

Cellulaire beeldvorming Onderzoek naar efficiëntie van cellulaire labeling via MRI

MSC's werden behandeld met verschillende concentraties (25 en 50 μg/ml) PBNP's, en de controlecellen werden 48 uur gekweekt met voltooid medium zonder PBNP's, driemaal gewassen met PBS-buffer, getrypsiniseerd, verzameld en vervolgens ingebed in 1 ml 1 % (w /v ) agarose-oplossing voor beeldvormende onderzoeken. Bovendien werden de MSC's gelabeld met 50 μg / ml PBNP's gedurende 14 dagen tot osteogene differentiatie geïnduceerd en vervolgens het MRI-signaaleffect onderzocht. De T2-gewogen beeldvorming werd uitgevoerd met behulp van een inversieherstelgradiëntechosequentie met TE = 23 ms, TR = 400 ms, NEX = 2.0, een plakdikte van 2 cm, een gezichtsveld van 20 × 20 cm en een matrixgrootte van 384 × 256.

Statistische analyse

De resultaten werden uitgedrukt als gemiddelde  ± SD van ten minste drie onafhankelijke experimenten die in drievoud werden uitgevoerd. Behandelingsgroepen werden vergeleken met behulp van eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) en Student's t proef werd gebruikt. p < 0,05 werd geaccepteerd als een significant verschil.

Resultaten en discussie

PBNP-karakterisering

Transmissie-elektronische microscopie (TEM) werd uitgevoerd om de PBNP's (figuur 1a), die een diameter van 20-25 nm hebben, te karakteriseren. Voor de morfologie vertoonden de PBNP's een kubusvormige structuur. Figuur 1b toont de infraroodspectroscopie van de gesynthetiseerde PBNP's. De PBNP's vertoonden een typische absorptiepiek van Fe ³⁺ -CN rond 2085,23 nm, wat in overeenstemming was met die van PBNP's. Veldafhankelijke magnetisatiemeting werd verder gebruikt om de magnetische eigenschappen van de PBNP's te bestuderen. Figuur 1c toont magnetisatiecurven van de PBNP's bij kamertemperatuur, die superparamagnetisme van de PBNP's aantoonden. Figuur 1d toont de diffractiepieken bij 200, 220, 400 en 420, die bevestigden met het XRD-patroon van PBNP's. Bovendien was de polydispersiteitsindex van PBNP's 0,16, wat een uniforme deeltjesgrootteverdeling aangaf.

PBNP karakterisering. een Morfologie van de PBNP's. b UV-vis absorptiespectra van de PBNP's. c Veldafhankelijke magnetisatie van PBNP's. d XRD-patroon van PBNP's

Cellulaire opname en cytotoxiciteit van PBNP's

Om de cellulaire opname van de PBNP's naar MSC's verder te bevestigen, werd de cellulaire micromorfologie van de bovengenoemde C3H10T1/2-cellen behandeld met en zonder de PBNP's bestudeerd. Figuur 2 toont SEM- en TEM-beelden van C3H10T1/2-cellen na 48 uur incubatie met en zonder de PBNP's. Van de SEM-afbeeldingen had de ultrastructuur van de gelabelde C3H10T1/2-cellen geen duidelijke veranderingen in vergelijking met de controle C3H10T1/2-cellen. Uit de TEM-afbeeldingen vertoonden de controle C3H10T1/2-cellen zonder de incubatie met de PBNP's een typische cellulaire micromorfologie met duidelijke cellulaire microstructuren. Toch werd na incubatie met de PBNP's een willekeurige verdeling van de PBNP's duidelijk waargenomen in het cytoplasma van de C3H10T1/2-cellen. En sommige PBNP's bleken gelokaliseerd in blaasjes in het cytoplasma van de cellen. Hoewel de willekeurige verdeling van de PBNP's werd waargenomen in het cytoplasma van de C3H10T1/2-cellen, was het exacte mechanisme van intracellulaire opname onduidelijk. We stellen voor dat de internalisatie van de PBNP's in C3H10T1/2-cellen kan plaatsvinden via een soortgelijk mechanisme als de vorige studie heeft aangetoond, die had gemeld dat verschillende anorganische nanodeeltjes, waaronder Pruisisch blauw-Poly (l-lysine), goud, zilver en metaaloxiden kunnen gemakkelijk door cellen worden opgenomen via endocytose [15, 22, 23].

SEM- en TEM-beelden van de C3H10T1/2-cellen na 48 uur incubatie met verschillende concentraties PBNP's. een SEM-afbeeldingen. b TEM-afbeeldingen. , intracellulair gedistribueerde PBNP's

Om de cytotoxiciteit en de cellevensvatbaarheidstest in MSC's te evalueren, werd de MTT-methode uitgevoerd. De cellen werden 1 tot 3 dagen geïncubeerd bij 37 °C onder 5% CO₂ met verschillende concentraties PBNP's gesuspendeerd in DMEM. Er werden drie onafhankelijke onderzoeken uitgevoerd en de gemiddelden en standaarddeviaties werden gerapporteerd. Figuur 3 laat zien dat de levensvatbaarheid van MSC's behandeld met PBNP's (5, 10, 20, 40, 80 μg/ml) relatief was ten opzichte van de controlecellen na respectievelijk 24 tot 72 uur. De resultaten gaven aan dat de PBNP's niet-toxisch waren voor cellen die waren behandeld met dezelfde hoeveelheid PBNP's als MTT. Bovendien werd een realtime proliferatietest met behulp van het xCELLigence-instrument gebruikt voor het onderzoeken van de groeicurven van MSC's. De resultaten toonden aan dat de groeicurven van MSC's niet significant werden beïnvloed door deze concentraties van PBNP's (Fig. 4a), en de levensvatbaarheid van de cellen werd geteld en getoond in Fig. 4b na behandeling in 24, 48, 72 en 96 uur. Deze resultaten suggereren dat PBNP's geen effect hebben op de proliferatie van MSC's.

De levensvatbaarheid van C3H10T1/2-cellen in aanwezigheid van verschillende hoeveelheden PBNP's zoals bepaald met de MTT-methode

De proliferatie van C3H10T1/2-cellen in aanwezigheid van verschillende hoeveelheden PBNP's zoals bepaald met RT-CIM-assay. een De groeicurven van C3H10T1/2-cellen. b De cellevensvatbaarheid van C3H10T1/2-cellen na behandeling in 24, 48, 72 en 96 h

Mogelijkheid tot celmigratie

Migratie van MSC's behandeld met verschillende concentraties PBNP's werd getest met behulp van Transwell-assay en een nieuwe techniek, RT-CIM-assaysysteem. Uit de Transwell-assay vertoonden de gelabelde cellen geen duidelijke veranderingen in migratie. Door gebruik te maken van het RT-CIM-assaysysteem werd celmigratie in realtime gevolgd, wat nauwkeurigere gegevens weerspiegelde en het celmigratievermogen nauwkeuriger kon voorspellen. Van het RT-CIM-assaysysteem migreerden, hoewel aan het begin van de labeling, de gelabelde cellen langzaam dan de niet-gelabelde cellen. Maar na 72 en 96 uur was er geen significant verschil in celmigratie tussen gelabelde cellen en niet-gelabelde cellen, wat aangeeft dat hoge concentraties PBNP's de MSC-motiliteit niet beïnvloedden (Fig. 5).

De migratie van C3H10T1/2-cellen in aanwezigheid van verschillende hoeveelheden PBNP's. een De migratie van C3H10T1/2-cellen bepaald met RT-CIM-assay. b De celindex van C3H10T1/2-cellen na behandeling in 12, 24, 48, 72 en 96 uur. c De migratie van C3H10T1/2-cellen bepaald door Transwell-assay (vergroting × 200)

In vitro celdifferentiatie

De pluripotentie van gelabelde en ongelabelde MSC's werd onderzocht met Alizarine Red en Oil Red O-kleuring. Afbeelding 6 laat zien dat gelabelde MSC's met succes kunnen worden gedifferentieerd in adipocyten en osteocyten, net als de niet-gelabelde MSC's. Deze resultaten suggereren dat de PBNP's de differentiatiecapaciteit van de cellen niet verstoorden, waardoor de pluripotentie van gelabelde MSC's behouden bleef.

In vitro celdifferentiatie van cellen met of zonder PBNP's. Oil Red O-kleuring voor adipocyten en Alizarin Red-kleuring voor osteocyten. Afbeeldingen werden 3 weken na labeling verkregen (vergroting × 200)

Invloed van de labeling van PBNP's op het cytoskelet

Om het effect van PBNP's op het cytoskelet van MSC's te onderzoeken, werd een immunofluorescentietest van F-actine gebruikt. De phalloidin-kleuring vertoont geen verandering van de rode actinefilamenten van het cytoskelet na 48 uur labelen in vergelijking met niet-gelabelde MSC's. Een vergelijking van de integriteit en distributie van actinefilamenten in de gelabelde en ongelabelde cellen gedurende 48 uur bracht geen veranderingen aan het licht (Fig. 7).

Immunofluorescentie van C3H10T1/2-cellen in aanwezigheid van verschillende hoeveelheden PBNP's gedurende 48 uur (vergroting × -400). , cytoskelet

Western Blot-analyse

Wnt-signaleringsroutes spelen een belangrijke rol bij de regulatie van celproliferatie, differentiatie, apoptose, weefselvorming en het lot van de stamcel [24]. Dus β-catenine is het functionele eiwit van MSC's. Bovendien is de vimentine de mesenchymale biomarker en ook het functionele eiwit van MSC's [25]. Deze twee eiwitten houden verband met de biologische functie van MSC's. De expressies van β-catenine en vimentine werden geëvalueerd door middel van Western-blot-analyse. Figuur 8 laat zien dat de expressie van β-catenine en vimentine van MSC's die gedurende 48 uur met verschillende concentraties PBNP's waren behandeld, geen significante veranderingen vertoonden in vergelijking met de expressie van MSC's die zonder PBNP's waren behandeld. Deze resultaten gaven aan dat PBNP's de expressie van β-catenine en vimentine van MSC's niet kunnen veranderen, wat de stabiliteit van de biologische functie van MSC's na behandeling met PBNP's aantoonde.

Western-blot toont de expressie van β-catenine en vimentine van MSC's die 48 uur met en zonder PBNP's zijn behandeld. Het niveau van β-catenine en vimentine werd gekwantificeerd door software ImageJ

In vitro MRI

MSC's hebben, net als andere stamcellen, het potentieel om bot-, kraakbeen-, vet-, spier- en hartcellen te differentiëren, die een belangrijke bron zijn geworden voor regeneratieve geneeskunde. En het volgen van de migratie en het resultaat van MSC's is zo belangrijk om de rol en het resultaat van exogene MSC's bij het repareren van defecten te evalueren. Magnetische resonantie beeldvorming (MRI) hielp bij het observeren van MSC's na klinische toediening, en MRI-contrastmiddel is noodzakelijk. Het potentieel van PBNP's die worden gebruikt als een effectief T2-gewogen cellulair MRI-contrastmiddel is aangetoond [14], en enkele andere onderzoeken hebben ook aangetoond dat de oppervlaktemodificatie van PBNP's de prestaties ervan in MRI verbetert [17, 26]. Momenteel is PBNP-labeling in een verscheidenheid aan cellen gebruikt. Dumont et al. beschreef PBNP's als middelen voor MRI en op fluorescentie gebaseerde beeldvorming van hersentumoren bij kinderen [27]; Perera et al. ontwikkelde de met gadolinium opgenomen PBNP's voor de vroege detectie van tumoren in het maagdarmkanaal [28]; en Cano-Mejia et al. gecombineerde op Pruisische blauwe nanodeeltjes (PBNP) gebaseerde fotothermische therapie (PTT) met anti-CTLA-4 checkpoint-remming om neuroblastoom te behandelen [29]. Er zijn echter zelden gerelateerde rapporten over PBNP-gelabelde MSC's. Bovendien blijft het onduidelijk of er een negatieve invloed is op de celfunctie en levensvatbaarheid van MSC's na het labelen van PBNP's

Om te onderzoeken of de PBNP's het vermogen hebben om het T2-gewogen MRI-contrast van cellen te verbeteren, hebben we de MSC's met of zonder PBNP's geïncubeerd en het MRI-signaaleffect onderzocht. Om de temporele stabiliteit van labeling te controleren en om te onderzoeken of de PBNP's hun beeldvormingscapaciteit zouden verliezen wanneer de MSC's differentiëren, hebben we de MSC's geïncubeerd met PBNP's en de MSC's gedurende 14 dagen tot osteogene differentiatie geïnduceerd en vervolgens het MRI-signaaleffect onderzocht. Zoals getoond in Fig. 9 vertoonden de pellets van de MSC's die waren geïncubeerd met PBNP's een duidelijk MRI-signaalverduisterend effect en de SI-waarde van de gelabelde MSC's had een duidelijk verschil met niet-gelabelde MSC's. Met name de gelabelde MSC's vertoonden ook een duidelijk MRI-signaalverduisterend effect wanneer differentiatie wordt geïnduceerd. Deze resultaten toonden aan dat PBNP's het potentieel hadden om te worden gebruikt als een effectief T2-contrastmiddel voor cellulaire beeldvorming van MSC's en dat het contrastmiddel op lange termijn kan worden behouden, zelfs na de celdifferentiatie.

T2-gewogen MRI-fantomen van MSC's. een Dwarsdoorsnede. b Kwantitatieve analyse van SI-waarde. **P < 0,001 vs controle

Er zijn veel gepubliceerde gegevens van MSC's die zijn gelabeld met magnetische nanodeeltjes (MNP's), maar de toepassing van MNP's werd beperkt door hun cytotoxiciteit. Bij het afleveren van MNP's aan doelweefsel, verspreiden de meeste MNP's zich vaak in de lever en milt, dus de toxiciteit van MNP's kan niet worden verwaarloosd [30]. Costa C ontdekte bijvoorbeeld dat SPION's cytotoxiciteit zouden kunnen produceren voor neuronale cellen en gliacellen [31]. Zoals we hierboven vermeldden, vertoonden de PBNP's geen detecteerbare cytotoxiciteit en hadden ze geen effecten op de celkenmerken van MSC's, waaronder cytoskelet, cellulaire morfologie en functioneel eiwit. De kracht van het gebruik van PBNP's als een effectief T2-gewogen cellulair MRI-contrastmiddel zou dus worden aangetoond in termen van de cytotoxiciteit.

Conclusies

Samenvattend hebben we de PBNP's geïntroduceerd in het volgen van mesenchymale stamcellen en de overleving, het migratiepotentieel en celkenmerken van MSC's bestudeerd nadat ze waren gelabeld met de PBNP's. Verder hebben we ook het potentieel van PBNP's als een effectief T2-gewogen MRI-contrastmiddel voor de cellulaire MRI van MSC's aangetoond. PBNP's kunnen effectief worden gebruikt voor de etikettering van MSC's en zullen de biologische kenmerken van MSC's niet beïnvloeden. Deze conclusie baande een nieuwe weg voor het label van MSC's.

Afkortingen

DMEM:

Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium

DMSO:

Dimethylsulfoxide

FBS:

Foetaal runderserum

MRI:

Magnetische resonantie beeldvorming

MSC:

Mesenchymale stamcel

NIR:

Nabij infrarood

OD:

Optische dichtheid

PBNP:

Pruisisch blauw nanodeeltje

TEM:

Transmissie-elektronenmicroscopie

VSM:

Vibrerende monstermagnetometer