Biocompatibel 5-aminolevulinezuur/Au met nanodeeltjes geladen ethosomale blaasjes voor in vitro transdermale synergetische fotodynamische/fotothermische therapie van hypertrofische littekens

Resultaten en discussies

De karakterisering van A/A-ES

Ultrasone trillingen waren om twee redenen de belangrijkste parameter bij het bereiden van A/A-ES:(a) AuNP's konden worden gevormd via ultrasone trillingen zonder enig toxisch middel, waardoor A/A-ES biocompatibiliteit kreeg; (b) ultrasone trillingen zouden de lipidedubbellagen kunnen herschikken om meer blaasjes te vormen met kleine afmetingen en relatief grotere interne kernen, die meer ALA en AuNP's zouden kunnen laden. In dit werk werden AuNP's gevormd zoals beschreven in de volgende schema's:(a) zeer reactieve H•- en OH•-radicalen werden gegenereerd in de bellen door de homolyse van H₂ O (Vgl. 1), (b) de oxiderende radicalen H• zouden de alfa H van CH₃ kunnen abstraheren CH₂ OH en vormen een reducerend radicaal CH₂ •CH₂ OH (Vgl. 2), en (c) tijdens een pyrolyse in de bellen, het radicaal CH₂ •CH₂ OH kan Au ³⁺ . verminderen om AuNP's te vormen (Vgl. 3) [26].

In eerste instantie werd A/A-ES geverifieerd door UV-Vis (Fig. 1a). Het had een sterke absorptie in het bereik van 600-650 nm, als gevolg van de plasmonische koppeling tussen naburige AuNP's in dezelfde A/A-ES [20]. Daarom zou het 632-nm laserbestraling kunnen gebruiken om tegelijkertijd PDT en PTT voor HS te gebruiken. Verder vertoonde A / A-ES een relatief smalle grootteverdeling en de gemiddelde grootte was 166 ± 83 nm, volgens DLS-analyse in figuur 1b. Interessant is dat twee grootteverdelingen werden toegeschreven aan onbelaste AuNP's en A/A-ES. Ook suggereerde het grote verschil tussen twee distributies dat de hoeveelheid A/A-ES veel meer was dan die van ongeladen AuNP's. De PDT-efficiëntie was afhankelijk van de hoeveelheid ALA geladen in A/A-ES. Profiteren van de transmembraan pH-gradiënt actieve laadmethode, EE van ALA was 20%, wat hoger was dan die in gerapporteerde werken (minder dan 10%) [27]. De morfologie van A/A-ES werd ook bestudeerd. Op SEM-afbeeldingen (figuur 1c) verscheen A / A-ES als intacte bolvormige lamellaire blaasjes met een grootte van 200 nm, en AuNP's konden duidelijk worden waargenomen en geladen in ES. Naast de AuNP's strekten de lamellen zich uit tot het AuNP-oppervlak in Fig. 1d, wat het kenmerk was van ES [28, 29]. Bovendien had de voorbereide A/A-ES die verschillende aantallen AuNP's laadde de vergelijkbare grootte in Aanvullend bestand 1:Afbeelding S1. Daarom werd A/A-ES aangepast in de stabiele en vervormbare structuur onder ultrasone trillingen, waardoor A/A-ES door nauwe ruimte in HS kan worden geperst. Samenvattend werd A/A-ES met succes bereid met 20% EE van ALA en een sterke absorptie bij 600-650 nm. De morfologie ervan zou ook zeer bevorderlijk zijn voor de doordringbaarheid, wat in overeenstemming was met de in vitro PDT/PTT-studie die volgt.

een UV-Vis-spectra van ES, ALA en A/A-ES. b De grootteverdeling van geprepareerde A/A-ES. c , d De SEM- en TEM-beelden van A/A-ES

In vitro onderzoek naar transdermale penetratie van A/A-ES

De retentie van A/A-ES was belangrijke parameters voor het evalueren van de doordringbaarheid en behandelingsefficiëntie van A/A-ES. Daarom werd de retentiehoeveelheid van zowel ALA als AuNP's in HS met verschillende tijd onderzocht met behulp van Franz-diffusiecellen. Zoals getoond in Fig. 2a, bereikten zowel ALA als AuNP's snel de maximale retentie in de eerste 2 uur, vanwege de penetratieverbeteringsfunctie van ES. Na het bereiken van het maximum namen de retenties van zowel ALA als AuNP's voortdurend af omdat A / A-ES door het hele HS drong. De resultaten gaven aan dat de A/A-ES voldoende doordringbaarheid had. Vergeleken met de toegediende dosis ALA (2 mg), bevond 48% ALA zich in HS-weefsel, wat in het voordeel was van PDT van HS. Bovendien suggereerden dezelfde retentieveranderingen tussen ALA en AuNP's dat ALA en AuNP's beide in ES waren geladen als consistent met resultaten van microscopen. Volgens het resultaat was 2 uur een goede toedieningstijd voor lokaal gebruik met de maximale retentiehoeveelheid van A/A-ES. In onze eerdere werken werd ES beschouwd als een zeer efficiënte geneesmiddeldrager om de penetratie van geneesmiddelen in HS-weefsel te verbeteren [13]. Daarom werd de distributie en werking van A/A-ES in HS ook bestudeerd door TEM in dit werk te gebruiken. Zoals getoond in Fig. 2b, werd A/A-ES, als intacte structuur, gevonden in de dermis, wat aangeeft dat A/A-ES stabiel door de epidermis en in de HS-dermis zou kunnen penetreren. In de onderste dermis getoond in Fig. 2c werden de ES en AuNP's waargenomen als een scheidingstoestand, wat suggereert dat A / A-ES zowel ALA als AuNP's zou afgeven. Interessant is dat AuNP's aggregatief kunnen zijn in dermis, ook al waren ze niet geladen in ES. Bovendien bleken meer AuNP's zich op te hopen in de dermis in Fig. 2d, wat de plasmonische koppeling tussen naburige AuNP's zou kunnen bieden om lichtenergie te oogsten en warmte te genereren. In het kort, in vitro transdermale penetreerbaarheidsstudie toonde aan dat A/A-ES een zeer efficiënte geneesmiddeldrager was om zowel ALA- als AuNP-penetratie in HS-weefsel te verbeteren, en de aggregatieve AuNP's in dermis waren voorstander van het genereren van warmte [20]. Daarom vertoonde de A/A-ES een groot potentieel in synergetische PDT/PTT voor HS.

een het retentiebedrag van ALA en AuNP's. b De verdeling van A/A-ES in HS-weefsel. c De verdeling van ES en AuNP's in HS-weefsel. d AuNP's die zich ophopen in HS-weefsel

In vitro PDT/PTT van HSF

Biocompatibiliteitstest

Hoewel de biocompatibiliteit van AuNP's goed was bewezen in gerapporteerd werk, zou de biocompatibiliteit van A/A-ES met HSF ook in dit werk moeten worden bestudeerd [30, 31]. Verschillende concentraties van ALA-ES, Au-ES en A/A-ES (gebaseerd op ALA-concentraties van 0,1 tot 10 mM, Au-ES was dezelfde AuNP-concentratie als A/A-ES) werden gedurende 12 uur met HSF geïncubeerd. zonder bestraling. Het resultaat toonde aan dat er geen donkere cytotoxiciteit was in de concentraties van niet meer dan 2,0 mM met celoverlevingspercentages van meer dan 90%. Wanneer de concentraties hoger waren dan 2,0 mM, werd een lichte afname in celoverlevingspercentages gedetecteerd. De resultaten toonden aan dat A/A-ES de uitstekende biocompatibiliteit had en dat de PDT/PTT in de volgende onderzoeken moet worden uitgevoerd in een concentratie van 2,0 mm (ca. 14% A/A-ES in kweekmedia, v /v .) Afb. 3.

De levensvatbaarheid van HSF na behandeling met ALA-ES, Au-ES en A/A-ES in het donker gedurende 12 uur

PDT/PTT voor HSF

A/A-ES zou de permeabiliteitsbarrières van het oppervlak kunnen overwinnen door de fusie van A/A-ES met HSF-membraan en vervolgens de ALA en AuNP's rechtstreeks in het celcytoplasma vrijmaken [32]. Volgens het mechanisme van ALA-PDT zou ALA dat vrijkomt uit A/A-ES kunnen omzetten in PpIX in HSF-cytoplasma. Met laser produceerde PpIX cytotoxische ROS die leidde tot de celapoptose. Daarom werd CLSM gebruikt om de accumulatie van zowel PpIX als ROS in Fig. 4 [33, 34] te bestuderen. Vóór laserbestraling was de rode fluorescentie van PpIX voornamelijk verdeeld in het cytoplasma van HSF. PpIX in HSF behandeld met ALA-ES en A/A-ES waren veel meer dan de autologe PpIX in HSF behandeld met Au-ES. Bovendien werd ROS in alle HSF nauwelijks gevonden zonder laserbestraling, wat ook redelijk was. Na laserbestraling waren de PpIX-intensiteiten in HSF behandeld met ALA-ES en A/A-ES verminderd, en ROS in deze cellen kon gemakkelijk worden gevonden met een sterke intensiteit. Ondertussen had de met Au-ES behandelde HSF geen respons in PpIX en ROS omdat ze niet genoeg autologe PpIX hadden. Interessant is dat A / A-ES meer ROS-generatie zou kunnen bevorderen dan ALA-ES in een vergelijking van ROS-intensiteit, die werd toegeschreven aan de AuNP's. Verder leverde de celmorfologie ook meer informatie op. Het met ALA-ES behandelde HSF had het eumorfisme, terwijl het met Au-ES behandelde HSF ongezonde uitsteeksels van het plasmamembraan vertoonde. Daarentegen vertoonde de HSF die door A/A-ES werd behandeld, uitstekende en intrekkende "blebs", wat het kenmerk was van stervende cellen [35]. Deze verschillen in ROS-generatie en celmorfologie werden toegeschreven aan PTT op basis van AuNP's, die ook werd onderzocht door infraroodbeeldvorming in Fig. 5. Volgens het mechanisme van AuNPs-PTT konden AuNP's in HSF-cytoplasma 632 nm laser absorberen en voldoende warmte genereren om de cellen apoptose of necrose te maken onder bestraling. Daarom werden de fotothermische effecten van ALA-ES, Au-ES en A/A-ES gevolgd met behulp van een infrarood warmtebeeldcamera. In vergelijking hadden ALA-ES, Au-ES en A/A-ES duidelijk een hogere temperatuur (41,3 °C voor Au-ES en A/A-ES, 36,5 °C voor ALA-ES) bij bestraling. Nadat de laser was verwijderd, daalden de temperaturen van alle snel tot een normale waarde in 1 minuut, wat suggereert dat de laserbestralingsbehandeling veilig zou kunnen zijn [36]. Daarom zouden AuNP's geladen in ES een effectieve PTT kunnen bieden, die ook wordt geleverd door apoptose en necrose-assay. Samenvattend zou A/A-ES de kwantumopbrengsten van ROS kunnen verbeteren en het fotothermische effect kunnen bieden om een ​​uitstekende efficiëntie van PDT/PTT-synergetische behandeling voor HSF te bereiken.

Confocale beelden van HSF behandeld met ALA-ES, Au-ES en A/A-ES gedurende 6 uur en gevolgd zonder/met bestralingen. De schaalbalk is 100 μm

. Infrarood microscopische beeldvorming van HSF behandeld met ALA-ES, Au-ES en A/A-ES gedurende 6 uur onder (a ) en na bestraling (b )

Apoptose en necrose-assay

De efficiëntie van PDT/PTT werd verder bestudeerd door de apoptose en necrose van HSF behandeld met ALA-ES, Au-ES en A/A-ES onder laserbestraling. Een apoptose-assay werd uitgevoerd met behulp van de flowcytometrie-analyse van Annexine V-FITC en dubbele kleuring met propidiumjodide (PI) (Fig. 6). Een controleresultaat toonde aan dat laserbestraling de levensvatbaarheid van de cellen niet beïnvloedde (figuur 6a). Alvorens te bestralen vertoonden ALA-ES, Au-ES en A/A-ES de goede biocompatibiliteit. Na bestraling vertoonde het HSF dat werd behandeld met ALA-ES, Au-ES en A/A-ES het aandeel van zowel necrose als apoptose significante verschillen. In het kort was er de hoogste fractie van zowel necrose als apoptose van HSF behandeld met A/A-ES, wat in overeenstemming was met het resultaat van CLSM. In Fig. 6e onthulde de statistische analyse van experimenten dat necrotische celdood toenam tot 61,8% met de behandeling met A/A-ES, wat aangeeft dat de A/A-ES een betere synergetische PDT/PTT-efficiëntie had voor HSF dan de individuele PDT ( 47,7% necrotische celdood) en PTT (24,3% necrotische celdood). Interessant genoeg gaf het resultaat ook aan dat PDT een effectievere rol speelde bij HS-behandeling in vergelijking met PTT, en op AuNP gebaseerde PTT zou het PDT-effect kunnen helpen. Deze resultaten kunnen worden verklaard doordat A/A-ES de kwantumopbrengsten van ROS zou kunnen verbeteren en het fotothermische effect zou kunnen bieden om een ​​uitstekende efficiëntie van PDT/PTT-synergetische behandeling voor HSF te bereiken. Hoewel de EE van ALA in A/A-ES veel lager was dan die in ALA-ES (20 vs. 54%), was er vergelijkbare necrotische celdood van zowel A/A-ES als ALA-ES (61,8 vs. 78). %). Dit resultaat kan worden verklaard doordat A/A-ES de kwantumopbrengsten van ROS zou kunnen verbeteren door fotothermisch effect en LSPR van AuNP's.

Apoptose-assay van HSF behandeld met ALA-ES (b ), Au-ES (c ), en A/A-ES zonder/met laserbestraling (d ), en de statistische analyse van levende, vroege apoptotische en late apoptotische en necrose (e ). een was de controle. Laser (-) en (+) betekenen zonder/met laserbestraling

Visualisatie van A/A-ES in HSF

De detailveranderingen van HSF-morfologie en structuur veroorzaakt door PDT/PTT werden ook onderzocht door zowel lichtmicroscopie als TEM in Fig. 7. Voorafgaand aan bestraling werd HSF goed behandeld met A/A-ES-groei, eumorfisme stevige hechting, wat wijst op A/A- ES had een uitstekende biocompatibiliteit zoals verwacht (Fig. 7a). In hun TEM-beeld had behandeld HSF, naast verschillende organellen in normaal cytoplasma, veel AuNP-aggregatie in het celcytoplasma (de lege frames in Fig. 7c). Het zou kunnen worden verklaard dat de fusie van A/A-ES met celmembranen meer AuNP's en ALA in HSF zou kunnen afleveren. Daarom kunnen AuNP's fungeren als de effectievere fotothermische bron vanwege het sterkere plasmonische koppelingseffect en de kwantumopbrengsten van ROS door LSPR verbeteren. Interessant is dat, getoond in het onderbroken frame in Fig. 7c, sommige AuNP's uit HSF waren vanwege exocytose, wat nogmaals de uitstekende biocompatibiliteit van A / A-ES aantoonde. Na bestraling vertoonde HSF het kenmerk van stervende cellen, dat wil zeggen de uitsteeksels van het plasmamembraan (Fig. 7b) [37]. Vanwege ROS en fotothermisch effect werden de zwellende mitochondriën en het gescheurde buitenmembraan, als de andere indicatoren van HSF-dood, gevonden in HSF-cytoplasma (Fig. 7d) [35]. Verder werd ES ook gevonden met zijn karakteristieke membraanstructuur (rode frames in Fig. 7d). Samenvattend, A/A-ES zou het mogelijk kunnen maken dat ALA en AuNP's in HSF doordringen en HSF vernietigen door synergetische PDT/PTT.

De lichtmicroscopiebeelden van HSF behandeld met A/A-ES voor (a ) en na bestraling (b ). TEM-beelden van HSF behandeld met A/A-ES eerder (c ) en na bestraling (d )

Conclusies

Biocompatibel A/A-ES werd gemakkelijk bereid voor in vitro synergetische PDT/PTT van HS door in HS te doordringen en HSF te vernietigen. Met behulp van ultrasone trillingen werden AuNP's gelijktijdig gesynthetiseerd en geladen in afwezigheid van giftige stoffen. A / A-ES had een sterke absorptie in 600-650 nm als het plasmonische koppelingseffect tussen naburige AuNP's in de ES met een hoge EE voor ALA (ongeveer 20%). In vitro transdermale penetreerbaarheidsstudie toonde aan dat A/A-ES een zeer efficiënte geneesmiddeldrager was om zowel ALA- als AuNP-penetratie in HS-weefsel te verbeteren. In vitro PDT/PTT voor HSF gaf aan dat A/A-ES de kwantumopbrengsten van ROS zou kunnen verhogen door fotothermisch effect en LSPR van AuNP's, wat een hoog niveau van celapoptose of necrose veroorzaakt. Kortom, biocompatibele A/A-ES had een betere synergetische PDT/PTT-efficiëntie voor HSF dan de individuele PDT en PTT, wat het perspectief voor de behandeling van HS bemoedigt. Verder werk zal zich richten op de in vivo studie van synergetische PDT/PTT voor HS in littekenmodellen, en het relevante werk is aan de gang.

Experimenten en methoden

De voorbereiding van A/A-ES

Honderdtachtig milligram fosfatidylcholine (PC, 95,8% sojalecithine, Lipoid GmbH, Duitsland) opgelost in 1,8 ml CH₃ CH₂ OH, 0,6 ml HAuCl₄ (10 mM, Aladdin, Shanghai, China) en 3,6 ml ALA-citraatbufferoplossing (CBS, 0,01 M, 12 mg ALA, pH 4,0) werden op hun beurt druppelsgewijs toegevoegd aan de pc-oplossing. Het mengsel werd 10 minuten bij 700 rpm geroerd om een ​​precursoroplossing te bereiden. Zoals weergegeven in Schema 1 werd de voorloperoplossing gedurende 30 minuten in een ultrasone omgeving bij 200 W geplaatst totdat deze een schitterende wijnrode kleur had. Vervolgens werd de reactieoplossing uitgevoerd met een centrifuge (8000 tpm, 20 min) om het resterende HAuCl₄ te verwijderen. en pc. Als laatste werd de afzetting opnieuw gedispergeerd in 3 ml ALA hydroalcoholische oplossing (ALA-HA, 2 mg/ml ALA, 30% ethanol) en geïncubeerd met een transmembraan pH-gradiënt actieve laadmethode volgens ons eerdere werk [13]. Tijdens incubatie diffundeerde een overvloed aan uitwendig niet-geïoniseerd ALA door de ES-dubbellagen in de interne zure waterige kern van ES, en vervolgens werden ze geprotoneerd en ingesloten in ES. Na incubatie is A/A-ES bereid. In dit werk werd ALA-ES bereid volgens ons eerdere werk met dezelfde ALA-concentratie als A/A-ES. AuNP-geladen ES (Au-ES) werd bereid als A/A-ES zonder ALA met dezelfde AuNP-concentratie als A/A-ES.

Schematisch diagram van de voorbereiding van A/A-ES

De karakterisering van A/A-ES

A / A-ES werden negatief gekleurd met fosfowolfraamzuur (1,5 gew.%) en vervolgens waargenomen met een transmissie-elektronenmicroscoop (TEM, JEOL, Japan, versnellingsspanning van 120 kV). A / A-ES werd ook onderzocht met een scanning-elektronenmicroscopie (SEM, JEOL, Japan, versnellingsspanning van 10 kV). De A/A-ES-grootteverdeling werd bepaald door analyse van dynamische lichtverstrooiing (DLS) in een NiComp 380ZLS-inspectiesysteem (Nicomp, VS). ALA werd bepaald door een fluoresceamine-derivatiseringsbenadering en het detail werd getoond in aanvullend bestand 1. De invangefficiëntie (EE) van ALA bepaald door een ultrafiltratiemethode werd getoond in aanvullend bestand 1. Ten slotte werden UV-Vis-spectra uitgevoerd op een Varian Cary 50 UV-Vis-spectrofotometer (Perkin Elmer, VS).

In vitro penetratieonderzoek door Franz Diffusion Cells

De doordringbaarheidsstudie van A/A-ES werd uitgevoerd met behulp van Franz-diffusiecellen met 2,8 cm ² effectief permeatiegebied. De receptorcellen, inclusief donor- en receptorcompartimenten, werden door een circulerend waterbad op 37 ° C gehouden. HS-weefsels werden met geïnformeerde toestemming verzameld in het Shanghai Ninth People's Hospital en volgens de ethische richtlijnen van de Verklaring van Helsinki uit 1975, goedgekeurd door het Shanghai Ninth People's Hospital. Vers HS-weefsel zonder vetweefsel (minder dan 24 uur na excisie) werd op een receptorcompartiment gemonteerd met het stratum corneum omhoog naar het donorcompartiment. Een milliliter A/A-ES werd toegevoegd aan het donorcompartiment en vervolgens werd het donorcompartiment bedekt met parafilm om verdamping te voorkomen. Na penetratie met verschillende tijdsduur werden HS-weefsels onmiddellijk gewassen om resterende A/A-ES op het HS-oppervlak te verwijderen. Om de retentiehoeveelheid van ALA en AuNP's in HS te accumuleren, werden HS-weefsels in kleine stukjes gesneden en ALA in HS-weefsels werd 24 uur geëxtraheerd door dialyse in PBS. De extractoplossingen werden geanalyseerd op retentiehoeveelheid ALA in HS-weefsel. De HS-weefsels die in dialysezakken werden vastgehouden, werden ook geanalyseerd op de retentiehoeveelheid AuNP door middel van inductief gekoppelde plasma-massaspectrometrie (ICP-MS). Na 2 uur doordrenkt met ALA-ES, werd HS-weefsel gewassen, geprefixeerd, gedehydrateerd, geïnfiltreerd en gefixeerd. Nadat ze waren ingebed in epoxyharsen, werden ze gesneden als ultrasecties (50 nm dikte, loodrecht op de epidermis) en geobserveerd met behulp van TEM bij een versnellingsspanning van 120 kV.

In vitro PDT/PTT voor HSF

Celcultuur

HSF werd als volgt geïsoleerd en gekweekt met een gebruikelijke methode:De verse stukjes HS-weefsel (1 mm ³ , minder dan 6 uur na excisie) werden verteerd met behulp van collagenase type I (Invitrogen, VS) om eencellige suspensie te bereiken. De HSF groeide in Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Invitrogen, VS) met 10% foetaal runderserum (FBS, Gibco, VS) bij 37 ° C en 5% CO₂ . Het kweekmedium moet om de 3 dagen worden vervangen en cellen werden gepasseerd wanneer 80% confluent was. De passages van twee en drie cellen werden gebruikt in de volgende experimenten.

Biocompatibiliteitstest

Bij de evaluatie van de biocompatibiliteit van A/A-ES werden HSF uitgezaaid in platen met 96 putjes bij 2 × 10 ³ cellen/put. Het kweekmedium werd vervangen door respectievelijk FBS-vrij medium en vers bereide ALA-ES, Au-ES en A/A-ES in verschillende concentraties. Na 12 uur werd de levensvatbaarheid van de cellen gemeten met behulp van een celtelkit-8 (CCK-8, Dojindo, Japan) volgens de instructies van de fabrikant.

PDT/PTT-procedure

HSF werd gezaaid in platen met 12 putjes bij 4 × 10 ⁴ cellen/put. Na 12 uur respectievelijk kweekmedia met vers bereide ALA-ES, Au-ES en A/A-ES (14%, v /v ), werden gedurende 6 uur vervangen door het FBS-vrije medium. Na behandeling werd HSF gewassen met PBS en gedurende 1 uur in kweekmedium geïncubeerd. Vervolgens werden ze bestraald met He-Ne-laser (632 nm golflengte, 40 mW/cm ² , Shanghai Institute of Laser Technology, China) met 20 min. Then, culture medium was replaced with fresh DMEM containing 10% FBS for another 24 h in preparation for subsequent experiments. Furthermore, HSF treated with A/A-ES and irradiation was prefixed, dehydrated, and embedded to prepare ultrasections for TEM examination.

Intracellular PpIX and ROS Generation Assay

Intracellular PpIX accumulation and ROS generation in HSF were detected by using confocal laser scanning microscopy (CLSM, Leica TCS SP5, Germany). The ROS generation assay was performed using a DCFH-DA and followed the manufacturer’s instructions. The coverslip with cells was mounted on a glass slide and observed at 405 nm excitation/635 nm emission for PpIX and 488 nm excitation/560 nm emission for ROS. All data was analyzed by LAS AF software.

Apoptosis and Necrosis Assay

The apoptosis and necrosis of HSF were analyzed by flow cytometry after double staining Annexin V-FITC and propidium iodide (PI) double staining. The samples were prepared according to the protocol of Annexin V-FITC/PI apoptosis detection kit and then analyzed by BD FACSCalibur (BD Biosciences, Mountain View, USA). The data analysis was performed with FlowJo 7.6 software.

Statistical Analysis

Data were presented as mean ± SD unless otherwise stated. Statistical significance was determined using a two-tailed student’s test (P  < 0.05) unless otherwise stated.

Afkortingen

A/A-ES:

5-Aminolevulinic acid/Au nanoparticle-loaded ethosomal vesicle

ALA:

5-Aminolevulinic acid

ALA-ES:

ALA-loaded ES

ALA-PDT:

ALA-based PDT

Au-ES:

AuNP-loaded ES

AuNPs:

Au nanoparticles

CLSM:

Confocal laser scanning microscopy

DLS:

Dynamic light scattering

DMEM:

Dulbecco’s Modified Eagle Medium

EE:

Entrapment efficiency

ES:

Ethosomal vesicles

FBS:

Fetal bovine serum

HS:

Hypertrophic scar

HSF:

Hypertrophic scar fibroblasts

ICP-MS:

Inductively coupled plasma-mass spectrometry

LSPR:

Localized surface plasmon resonance

PDT:

Fotodynamische therapie

PDT/PTT:

Photodynamic/photothermal therapy

PpIX:

Protoporphyrin IX

PTT:

Photothermal therapy

ROS:

Reactieve zuurstofsoorten

SEM:

Scanning elektronenmicroscopie

TEM:

Transmissie-elektronenmicroscoop