Grafeenoxide gehybridiseerde nHAC/PLGA-steigers vergemakkelijken de proliferatie van MC3T3-E1-cellen

Abstract

Biologisch afbreekbare poreuze steigers van biomateriaal spelen een cruciale rol bij botregeneratie. In deze studie werden de poreuze nano-hydroxyapatiet / collageen / poly (melk-co-glycolzuur) / grafeenoxide (nHAC / PLGA / GO) composietsteigers met verschillende hoeveelheden GO gefabriceerd door middel van een vriesdroogmethode. De resultaten laten zien dat de gesynthetiseerde steigers een driedimensionale poreuze structuur hebben. GO verbetert licht de hydrofiliciteit van de steigers en versterkt hun mechanische sterkte. Young's modulus van de 1, 5 gew.% GO-ingebouwde steiger is aanzienlijk verhoogd in vergelijking met het controlemonster. De in vitro-experimenten laten zien dat de nHAC/PLGA/GO (1,5 gew.%) de celadhesie en proliferatie van osteoblastcellen (MC3T3-E1) aanzienlijk bevordert. Deze huidige studie geeft aan dat de nHAC/PLGA/GO-steigers een uitstekende cytocompatibiliteit en botregeneratievermogen hebben, dus het heeft een groot potentieel om te worden gebruikt als steigers op het gebied van botweefselengineering.

Achtergrond

Botweefselmanipulatie waarbij driedimensionale poreuze scaffolds en botcellen worden gecombineerd, is op grote schaal onderzocht als een aantrekkelijke benadering bij de behandeling van slecht functionerend of verloren weefsel [1]. Biologisch afbreekbare steigers, die de aard van het bot nabootsen, spelen een belangrijke rol bij het accommoderen van cellen, het beheersen van celadhesie en -proliferatie en het vergemakkelijken van botregeneratie [2]. Tot nu toe zijn verschillende methoden toegepast, waaronder elektrospinning, integratie van computational topology design (CTD) en solid free-form fabricage (SFF), en vriesdrogen om verschillende driedimensionale (3D) poreuze structuren te fabriceren [3,4,5 ,6,7]. Electrospinning is in staat om nanovezelige of microvezelige steigers te maken met complexe structuren (uitgelijnde, veerachtige vezels) en samenstellingen [7]. De productie-efficiëntie ervan is echter een beetje laag. De integratie van CTD en SFF maakt het ontwerp van 3D anatomische steigers met poreuze architectuur en betere mechanische eigenschappen mogelijk. Maar deze methode vereist een sterke professionele kennis [4]. Vergeleken met deze twee methoden maakt de vriesdroogmethode het mogelijk om poreuze structuren te fabriceren met een veel eenvoudiger proces door sublimatie van de bevroren vloeibare fase onder vacuüm om een poreuze structuur te fabriceren [8].

Natuurbotten hebben een complexe hiërarchische architectuur met twee hoofdcomponenten, collageen en hydroxyapatiet [9,10,11]. Bij botweefselengineering is het nog steeds een uitdaging om een ideale biomimicry van de extracellulaire botmatrix te fabriceren die geschikt is voor celadhesie en proliferatie voor de behandeling van defecten [12]. Op nano-hydroxyapatiet/collageen (nHAC) gebaseerde biologisch afbreekbare steigers die het natuurlijke bot nabootsen, zouden een betere biocompatibiliteit, celaffiniteit en bioresorbeerbaarheid kunnen bieden [13]. De nadelen van collageen, waaronder de slechte mechanische en snel afbrekende eigenschappen, blijven echter een obstakel voor de toepassing ervan in botweefselmanipulatie [14]. Biologisch afbreekbare alifatische polymeren, zoals poly(melk-co-glycol)zuur (PLGA), met een hoge mechanische sterkte, uitstekende biocompatibiliteit, biologische afbreekbaarheid en goede oplosbaarheid in organische oplosmiddelen, zijn ideaal gecompenseerd materiaal voor de constructie van 3D-poreuze steigers voor botweefselengineering [15] , 16]. Een hybride poreuze steiger die collageen en synthetische polymeren bevat, combineert de voordelen van collageen en polymeren en overwint hun zwakheden, die op grote schaal wordt gebruikt voor botherstel en -regeneratie [17,18,19]. Zo hebben Liao et al. hebben een botskelet ontwikkeld dat is bereid door nHAC en poly(melkzuur) (PLA) om botregeneratie te bevorderen [17]. Niu et al. hebben nHAC/poly(L-melkzuur)/chitosan microsferen samengestelde steigers gefabriceerd voor het verbeteren van osteoblast proliferatie [19].

Onlangs heeft grafeenoxide (GO), een nieuwe koolstofplaat met een dikte van één atoom [20, 21], grote belangstelling gewekt in het biologische veld omdat het een goede biocompatibiliteit bezit. De GO-gehybridiseerde steigers zijn in staat om zowel de mechanische eigenschappen van de steiger als het cellulaire gedrag te verrijken, zoals celverspreiding en -proliferatie [22, 23]. Luo et al. rapporteerde dat de opname van GO in PLGA-nanovezelige proliferatie en osteogene differentiatie van mesenchymale stamcellen (MSC's) [20]. Jing et al. rapporteerde dat de toevoeging van 1,0 gew.% GO aan het thermoplastische polyurethaan de celproliferatie van Zwitserse muisfibroblasten zou kunnen vergemakkelijken [24]. Vergeleken met het toevoegen van de chemische verknopingsmiddelen (genipine, glutaaraldehyde, carbodiimide, enz.. ) [25, 26], die een zekere cytotoxiciteit hebben, om de mechanische eigenschappen van composietsteigers te verbeteren, vertoont de kleine hoeveelheid GO-gehybridiseerde steigers een goede biocompatibiliteit. Daarom zou de hybridisatie van de GO en de nHAC/PLGA een nieuwe kunstmatige basis voor botweefsels kunnen zijn.

In deze studie zijn de poreuze nano-hydroxyapatiet / collageen / poly (melk-co-glycolzuur) / grafeenoxide (nHAC / PLGA / GO) steigers, die een verschillende gewichtsverhouding van GO (0,0, 0,5, 1,0 en 1,5 gew. %) zijn vervaardigd en gekarakteriseerd. De hybridisatiesteigers vertonen poreuze structuren. De toevoeging van GO wijzigt de hydrofiele eigenschap en de mechanische eigenschap van de hybridisatiesteigers. Om het effect van de nHAC/PLGA/GO-steiger op botweefselmanipulatie te onderzoeken, werden de MC3T3-E1-cellen gekweekt op de poreuze hybridisatiesteigers. De resultaten laten zien dat de met GO gedoteerde hybridisatie-steigers van 1,5 gew.% celadhesie, groei en proliferatie vergemakkelijken, wat er verder op wijst dat nHAC/PLGA/GO-steiger kan worden beschouwd als een veelbelovende kandidaat in de engineering van botweefsel.

Resultaten en discussie

Structuur van nHAC/PLGA/GO composietsteigers

Afbeelding 1 illustreert het fabricageproces van nHAC/PLGA/GO-steigers. De details van het fabricageproces worden weergegeven in de experimentele sectie. De nHAC werd gesynthetiseerd voordat de nHAC / PLGA / GO-composietsteigers werden gefabriceerd. Het scanning elektronenmicroscoop (SEM) beeld van het nHAC-poeder toont zijn nanostructuur. De overeenkomstige energie-dispersieve röntgenspectroscopie (EDS) spectra van nHAC worden ook getoond (aanvullend bestand 1:figuur S1), dat de aanwezigheid van Ca, Cu, P, C en O onthult. Kopersignalen zouden bijdragen moeten zijn van de ondersteunende monsters. De nHAC is dus samengesteld uit Ca, P, C, O en de Ca:P-molverhouding van nHAC-poeder is 1,41, wat lager is dan die van hydroxyapatiet (HA) (1,66). Dit geeft aan dat het gesynthetiseerde HA van het type calciumdeficiëntie is [27], wat zal leiden tot vermindering van de hardheid, elasticiteitsmodulus en taaiheid in nHAC. Om de mechanische eigenschappen van de composietsteiger te vergroten, werden de PLGA en GO toegevoegd aan het nHAC-poeder. Het optische overzicht van de gefabriceerde nHAC / PLGA / GO-steigers met verschillende hoeveelheden GO wordt getoond in Fig. 2a. Het monster is een cilinder met een diameter van 14 mm. Het is duidelijk dat de composietsteigers zonder GO in de kleur wit zijn. Naarmate de GO toeneemt, worden de composietsteigers steeds donkerder. De gedetailleerde morfologieën van verschillende nHAC / PLGA / GO-steigers worden onthuld door SEM (Fig. 2b-e). Het laat duidelijk zien dat alle steigers poreuze structuren vormen en dat de oppervlakken van vier verschillende steigers behoorlijk ruw zijn. Om de informatie van deze gaten te karakteriseren, hebben we een automatische oppervlakte- en porositeitstester gebruikt om te evalueren. De resultaten van de gatenverdeling werden getoond in Fig. 2f. De grootte van de vier steigergaten ligt tussen 0 en 200 nm. En het aantal gaatjes waarvan tientallen nanometers meer zijn dan die met een paar honderd nanometer in vier steigers. Er is gemeld dat porositeit van biomateriaal-steigers niet triviaal is voor botvorming in vitro en in vivo [28]. Om de integratie in het omringende weefsel te optimaliseren, moeten scaffolds voor osteogenese botmorfologie, structuur en functie nabootsen [4]. De 3D-poreuze structuur van nHAC/PLGA/GO-composietsteigers is dus van cruciaal belang voor botregeneratie. De grootschalige SEM-afbeeldingen van de vier composietsteigers worden ook getoond (Aanvullend bestand 1:Afbeelding S2), dat de overzichtsstructuren van verschillende oppervlakken illustreert.

Schematisch diagram van het fabricageproces voor nHAC/PLGA/GO-steigers

een Optisch beeld van de gesynthetiseerde nHAC/PLGA/GO-steigers met verschillende hoeveelheden GO. b –e SEM-afbeeldingen van b nHAC/PLGA, c nHAC/PLGA/GO (0,5 wt%), d nHAC/PLGA/GO (1,0 gew.%) en e nHAC/PLGA/GO (1,5 gew.%) steigers. v Gatenverdeling van nHAC/PLGA/GO (0, 0,5, 1,0 en 1,5 gew.%)

Fysisch-chemische en mechanische karakteriseringen van nHAC/PLGA/GO composietsteigers

Het mechanisme van het syntheseproces kan worden onthuld door de röntgendiffractie (XRD) en Fourier-transformatie infraroodspectroscopie (FT-IR) spectra van verschillende afzonderlijke stoffen en composieten (Fig. 3). Zoals aangegeven in Fig. 3a, werd de anorganische fase bepaald als HA volgens het poederdiffractiebestand (PDF-kaart nr. 09-0432) omdat er geen pieken van andere Ca-P-materialen aanwezig waren in het XRD-patroon. Vergeleken met nHA impliceerden de verbrede diffractiepieken van nHAC een kleine korrelgrootte en lage kristalliniteit. Net als bij nHAC had het patroon van nHAC/PLGA/GO met verschillende hoeveelheden GO ook een lage kristalliniteit. De piek van GO verscheen echter niet in de nHAC/PLGA/GO-composieten, wat mogelijk te wijten is aan de geringe hoeveelheid GO in vergelijking met de bulk. Figuur 3b toont de FT-IR-spectra van verschillende afzonderlijke stoffen en composieten. Uit Fig. 3b kunnen de typische banden voor collageen worden waargenomen, zoals N–H-uitrekking bij 3336 cm⁻¹ voor amide A; C–H strekken op 3079 cm⁻¹ voor amide B; C=O uitgerekt op 1656 cm⁻¹ voor het amide I; N–H-vervorming bij 1548 cm⁻¹ voor de amide II en absorptiepiek bij 1238 cm⁻¹ voor amide III. Bij de vorming van nHAC beweegt de amide A van 3336 cm⁻¹ tot ongeveer 3411 cm⁻¹ , de amide B was verzwakt, de amide I, amide II, amide III verplaatst van 1656, 1548 en 1238 cm⁻¹ tot 1654, 1542 en 1240 cm⁻¹ , respectievelijk. Het bevestigt dus de chemische reactie tussen collageen en HA. Bovendien zijn de pieken bij 1033, 601 en 563 cm⁻¹ zijn de typische pieken voor (PO4)³⁻ groep, die de nieuwe vorming van HA op het collageen aangeeft, omdat het gecommercialiseerde HA alleen karakteristieke pieken van (PO4)³⁻ bezit op 1033, 603 en 565 cm⁻¹ . De gekarakteriseerde pieken van PLGA rond 2996 en 2944 cm⁻¹ werden toegewezen aan −CH₂ , 1752 cm⁻¹ is toegewezen aan C=O, 1183 en 1093 cm⁻¹ werden toegewezen aan C-O, zijn duidelijk te zien. Vergeleken met PLGA-steiger, verplaatsen de pieken van nHAC/PLGA-steiger zich van 1752 en 1183 cm⁻¹ tot 1760 en 1187 cm⁻¹ , die respectievelijk de chemische reactie tussen PLGA en nHAC-vermogen aantonen. Vergeleken met nHAC/PLGA-steigers zijn de pieken van met GO gedoteerde nHAC/PLGA-steigers verplaatst van 1760 naar 1762 cm⁻¹ ; er is een roodverschuiving opgetreden die de chemische reactie tussen GO en nHAC/PLGA aantoont.

een XRD en b FT-IR-spectra van verschillende componenten

De nanostructuur en mechanische eigenschappen van de nHAC/PLGA/GO-steigers met verschillende GO-hoeveelheden werden gekarakteriseerd door kwantitatieve nanomechanische atoomkrachtmicroscoop (QNM-AFM) [29,30,31,32,33,34], die in staat is om bieden spontaan de morfologie en de stijfheid en wordt veel gebruikt om de mechanische eigenschappen van verschillende materialen te detecteren, waaronder bot [30], tanden [35], hoornvlies [36], enz. Figuur 4a-d toont de tomografie van vier soorten composiet steigers. Vanwege de beperking van de scangebieden, tonen AFM-afbeeldingen alleen de lokale oppervlaktestructuur. De poreuze structuur is dus niet duidelijk. De AFM-afbeeldingen vertonen echter ook een ruwe oppervlaktemorfologie die vergelijkbaar is met de SEM-afbeeldingen. Ruwheid heeft een belangrijk effect op celproliferatie en differentiatie. Het oppervlak met een ruw oppervlak was gunstig voor de celproliferatie en differentiatie [37,38,39]. De lijnprofielen (Fig. 4e-h) afgeleid van de morfologie (Fig. 4a-d) tonen de maximale hoogteverschillen alleen verschillende lijnrichtingen. Het is duidelijk aangetoond dat de maximale hoogteverschillen variëren van ~ 200 tot ~ 600 nm. De overeenkomstige stijfheidsverdeling (Fig. 4i) toont dat de Young's modulus van vier verschillende steigers respectievelijk 7,53 ± 1,25, 8,34 ± 1,00, 9,15 ± 0,85 en 10,20 ±-1,28 GPa is. Om de stijfheidsverschillen duidelijk weer te geven, wordt ook het bijbehorende staafdiagram weergegeven (Fig. 4j). Hoewel de Young's modulus van de nHAC/PLGA/GO-steigers met een paar GO-hoeveelheidsverschillen niet significant verschillend zijn, is de nHAC/PLGA/GO bijvoorbeeld met de GO-hoeveelheid van 0,0 en 0,5 gew.% (7,53 ±-1,25 en 8,34 ±-1,00 GPa), van 0,5 en 1,0 gew.% (8,34 ±-1,00 en 9,15 ± 0,85 GPa), van 1,0 en 1,5 gew.% (9,15 ± 0,85 en 10,20 ±-1,28 GPa), de Young's modulus van de nHAC/PLGA/GO-steigers met een beetje groot verschil in GO-hoeveelheid (0,0 gew.% en 1,5 gew.%) zijn significant verschillend (7,53 ±-1,25 en 10,20 ±1,28 GPa). Dit geeft aan dat de mechanische eigenschap van de nHAC/PLGA/GO-steiger toeneemt met de toenemende GO-hoeveelheid.

AFM-beelden van a nHAC/PLGA, b nHAC/PLGA/GO (0,5 wt%), c nHAC/PLGA/GO (1,0 gew.%) en d nHAC/PLGA/GO (1,5 gew.%) steigers. e –u Lijnprofielen afgeleid van de morfologiebeelden. ik Stijfheidsverdeling van de vier verschillende steigers gemeten door QNM-AFM. j Het staafdiagram van Young's modulus versus het GO-bedrag. k De corresponderende contacthoeken van vier soorten steigers gemeten met de sessiele-dropmethode

De hydrofiliciteit van de steigers speelt een sleutelrol bij de interactie met cellen. De toevoeging van GO verhoogt niet alleen de mechanische eigenschappen van de composietsteigers, maar verandert ook de hydrofobiciteit van vier soorten steigers. Afbeelding 4f toont de contacthoeken van verschillende nHAC/PLGA/GO-steigers. De contacthoeken van de nHAC/PLGA-steigers waren ~-125,1° terwijl voor nHAC/PLGA/GO met een verschillende GO-hoeveelheid (0,5, 1,0 en 1,5 gew.%) respectievelijk ~-113,4°, ~-103,4° en ~-101.4° zijn. Naarmate de GO-hoeveelheid toeneemt, nemen de contacthoeken van de composietsteigers iets af vanwege zowel de hydroxylgroepen als de negatief geladen groepen, zoals carbonzuurgroepen op het GO-oppervlak [40]. GO kan dus opmerkelijke bioactiviteit leveren aan 3D nHAC/PLGA-steigers.

In het algemeen vereisen scaffolds voor tissue engineering niet alleen het tonen van biocompatibele morfologie en eigenschappen, maar ook poreuze structuur en fysieke sterkte [41]. De gevriesdroogde 3D nHAC/PLGA/GO-steigers hebben een poreuze structuur vanwege de sublimatie van oplosmiddel. De functionele groepen, waaronder hydroxyl (OH), epoxy (C-O-C) en carboxyl (COOH) soorten op steigeroppervlakken [40] induceren een goede hydrofiliciteit. De toevoeging van PLGA en GO zorgt voor voldoende fysieke kracht. De 3D nHAC/PLGA/GO-steigers kunnen dus een veelbelovende kandidaat zijn voor tissue engineering.

Celcultuur

Het is algemeen bekend dat de steigers die worden gebruikt voor botweefsel biocompatibel, celproliferatief en exclusief immuunrespons moeten zijn [21]. De nHAC/PLGA/GO, die de componenten van natuurlijk bot (collageen en HA) bevat en over geschikte mechanische eigenschappen en hydrofiliciteit beschikt, zou een ideale kandidaat moeten zijn voor botweefselmanipulatie. Om de celproliferatie van deze scaffolds te onderzoeken, werden de MC3T3-E1-osteoblastcellen in dit werk gekweekt. Figuur 5 toont de levensvatbaarheid van de cellen versus de kweektijd, geëvalueerd door de celtellingskit-8 (CCK-8)-assay. De proliferatie van cellen was consistent verhoogd gedurende de gehele kweekperiode voor alle groepen. Meer specifiek is de celproliferatie van MC3T3-E1 op nHAC/PLGA/GO (0,5 en 1,0 gew.%)-steigers significant verminderd op dag 1, terwijl die op nHAC/PLGA/GO (1,5 gew.%)-steigers vergelijkbaar is met die op nHAC/PLGA-steigers. Naarmate de tijd toeneemt, neemt de celproliferatie van MC3T3-E1 op nHAC/PLGA/GO (1,5 gew.%)-steigers significant toe op dag 3, 5 en 7. De celproliferatie van MC3T3-E1 op nHAC/PLGA/GO (0,5 en 1,0 gew.%) steigers is niet significant verschillend in vergelijking met die op nHAC/PLGA-steigers.

Vergelijking van de MC3T3-E1-cellen op verschillende steigeroppervlakken; dubbele sterretjes geven p . aan < 0.01, aantal monsters N = 4

Het bewijs van celgroei, proliferatie op verschillende steigers werd ook vastgelegd door SEM. Figuur 6 toont de oppervlaktemorfologie van osteoblastcellen op vier verschillende scaffolds na respectievelijk 1, 3, 5, 7 dagen gekweekt te zijn. Op dag 1 zijn alle cellen gelijkmatig en geïsoleerd verdeeld over vier verschillende steigers. Naarmate de tijd vordert (dag 3, 5 en 7), groeien alle groepen cellen, prolifereren en beginnen te integreren op verschillende steigers, waardoor een grote laag cellen wordt gevormd. Vergeleken met de celmorfologieën op verschillende steigers, waren de cellen op nHAC/PLGA/GO-steigeroppervlakken veel groter en uitgerekt dan die op het oppervlak van nHAC/PLGA-steigers. Er is geen significant verschil in de situatie van verspreiding van cellen, adhesie tussen de cellen op nHAC/PLGA/GO met verschillende hoeveelheden (0,5, 1,0 en 1,5 gew.%) volgens de SEM-afbeeldingen.

een –p SEM-afbeeldingen van MC3T3-E1-cellen gekweekt op vier verschillende steigers gedurende 1, 3, 5 en 7 dagen. Schaalbalken zijn 50 μm in alle afbeeldingen. Het witte sterretje vertegenwoordigt de MC3T3-E1 osteoblastcellen

Cytotoxiciteitstest

De cytotoxiciteit van GO is een essentiële zorg voor de toepassing ervan in de biologie. Dus we evalueren de cytotoxiciteit van de vier steigers in de tijd van 24 uur. De resultaten zijn weergegeven in Fig. 7. De celvitaliteit van fibroblastcellen (NIH-3T3) in nHAC/PLGA bevat 0,5,1 en 1,5% GO is 99,101,11, en 97,86% heeft betrekking op nHAC/PLGA, die geen significant verschil hebben dan nHAC/PLGA, wat aangeeft dat de toename van grafeenoxide veilig is bij 0-1,5%.

De relatieve activiteit van HIH-373-cellen in nHAC/PLGA (0,5, 1, 1,5 gew.%) heeft betrekking op nHAC/PLGA

Tabel 1 vat de mechanische eigenschappen en celcultuureigenschappen van vier soorten composietsteigers samen. Naarmate de GO toeneemt, neemt de Young's modulus van de steigers dienovereenkomstig toe. Alleen de mechanische eigenschappen van nHAC/PLGA en nHAC/PLGA/GO (1,5 gew.%) zijn echter duidelijk verschillend. De levensvatbaarheid van vier soorten steigers vertoont dezelfde trend met de mechanische eigenschap, dat wil zeggen dat de OD-waarden van alle groepen toenemen met de toenemende celkweektijd, maar alleen de nHAC/PLGA en nHAC/PLGA/GO (1,5 gew. %) groepen vertonen een significant verschil. Dit geeft aan dat de mechanische eigenschap van de steigers nauw verwant is aan de celcultuureigenschap. De resultaten kunnen zijn omdat weefselcellen de stijfheid van hun substraten kunnen voelen en erop reageren [42,43,44,45]. Het afstemmen van de mechanische eigenschappen van de substraten kan cellulaire reacties bevorderen die de celoppervlak-interacties beïnvloeden, samen met celgroei en levensvatbaarheid [46,47,48,49]. Haugh et al. ontdekte dat de stijfheid van de steigers de activiteit van MC3T3-E1-cellen verhoogde (celproliferatie en migratie) [50]. Engler et al. toonde aan dat substraatstijfheid een belangrijke fysieke factor in de respons van veel celtypen was [51]. Ze ontdekten dat gladde spiercellen afkomstig zijn van rattenaorta (A7R5-lijn), net als andere verankeringsafhankelijke cellen, zich meer verspreiden en hun cytoskelet en focale verklevingen veel meer organiseren op 'stijve' substraten dan op 'zachte' substraten. De mechanische eigenschap heeft niet alleen invloed op het celgedrag, maar ook op de weefselactiviteiten. Duncan et al. bestudeerde de mechanotransductie en de mechanische belasting van functionele respons op bot. Ze ontdekten dat mechanische belasting botresorptie kan remmen en botvorming in vivo kan verhogen [52]. Daarom zouden de stijfste nHAC/PLGA/GO-steigers (1,5 gew.%) de proliferatie van MC3T3-E1-cellen kunnen bevorderen.

De cytotoxiciteit van GO is een essentiële zorg voor de toepassing ervan in de biologie. Tot nu toe zijn er twee argumenten gerezen. Eén bewering dat de GO cytotoxiciteit zou induceren en het effect ervan is afhankelijk van de concentratie. Bijvoorbeeld Chatterjee, et al. rapporteerde de toxische respons met differentiële dosisafhankelijkheid voor GO [53]. Pinto, et al. rapporteerde dat alleen lage concentraties GO veilig in PLA kunnen worden opgenomen om celadhesie en proliferatie te vergemakkelijken [6]. De anderen stellen dat een nog grotere hoeveelheid GO een goede biocompatibiliteit zou hebben en zowel de mechanische eigenschappen van de substraten als het cellulaire gedrag zou verbeteren. Shin, et al. bestudeerde dat de C2C12-skeletmyoblasten waren verbeterd op PLGA-GO-collageen hybride matrices dan op PLGA, PLGA-collageen-matrices [54]. En Luo et al. rapporteerde dat de met GO gedoteerde PLGA-nanovezelsteigers de osteogene differentiatie van MSC's kunnen verbeteren [22]. In dit onderzoek is de GO gekozen op basis van het eerste argument. De beperkte hoeveelheid wordt toegevoegd aan de composietsteigers voor niet-cytotoxiciteit en verbeterde mechanische eigenschappen. De conjugatie van GO in nHAC/PLGA-steigers verbeterde de celgroei en proliferatie aanzienlijk. Hoewel het aantal cellen op zowel nHAC/PLGA als nHAC/PLGA met een kleine hoeveelheid GO, bijvoorbeeld nHAC/PLGA/GO (0,5 gew.%), min of meer hetzelfde is, is het aantal cellen op nHAC/PLGA/GO (1,5 gew.%) steiger was hoger dan die op de nHAC/PLGA-steigers. Deze resultaten geven aan dat de nHAC/PLGA/GO-steigers biofunctioneel zijn met het vermogen om de groei en proliferatie van MC3T3-E1-cellen te verbeteren. Daarom zorgt de uitstekende biocompatibiliteit en biofunctionaliteit ervoor dat nHAC/PLGA/GO kan worden gebruikt als effectieve ondersteuning voor botregeneratie.

De aard van het biomateriaal en het fabricageproces zijn erg belangrijk voor de eigenschappen van de steiger [28]. Tot nu toe zijn de biomaterialen uitgebreid bestudeerd, waaronder metalen [55], keramiek [56], glas [57], chemisch gesynthetiseerde polymeren [58], natuurlijke polymeren [59] en combinaties van deze materialen om composieten te vormen [60] . Het veranderen van componenten van composietsteigers zal de eigenschap van steigers induceren. Om bijvoorbeeld de biomimic scaffold van natuurlijk bot te fabriceren, is in deze studie het type I collageen gebruikt. Momenteel omvat de collageenfamilie meer dan 20 verschillende soorten collageen die voorkomen in de huid, botten, kraakbeen, enz. Door type I collageen te vervangen door andere soorten, is het mogelijk om verschillende samengestelde steigers voor verschillende doeleinden te fabriceren. Collageen type II is bijvoorbeeld een van de fibrilvormende collagenen en het overheersende type collageen in kraakbeen. Coördinatie van collageen type II in de scaffolds kan mogelijk de regeneratie van kraakbeenbot vergemakkelijken [61]. Bovendien kan het collageen met de juiste uitgloeiing de steigers verder versterken, wat een nieuw composietmateriaal met functionele structuren kan veroorzaken. Naast de aard van biomaterialen bepaalt de verwerking ook de functionaliteit van steigers, zoals verschillende verwerkingsmethoden. Materiaalchemie en -verwerking bepalen de maximale functionele eigenschappen en hoe cellen omgaan met de steiger. Steigers van eigenschappen en vereisten in botweefselengineering zijn uitgebreid onderzocht, waaronder afbraak [62], mechanische eigenschappen [63], cytokineafgifte [64] en combinaties van steigers en cellen [65].

Conclusies

Samenvattend werden nHAC/PLGA/GO-steigers met verschillende hoeveelheden GO (0,0, 0,5, 1,0 en 1,5 gew.%) vervaardigd door middel van een vriesdroogmethode. De gefabriceerde nHAC/PLGA/GO-steigers vertonen een poreuze structuur. Verder worden de mechanische eigenschappen en de hydrofiliciteit van de steigers verbeterd door de toevoeging van PLGA en GO. De in vitro studie toont aan dat de poreuze steigers de celadsorptie, groei en proliferatie vergemakkelijken. Deze nHAC/PLGA/GO-steigers kunnen een veelbelovende kandidaat zijn voor toepassingen in botweefsel.

Methoden

Materialen

Het gezuiverde gelyofiliseerde type 1 collageen werd verkregen van Tianjin Saining Biological Engineering Technology Co., Ltd. PLGA met een lactide:glycolideverhouding van 75:25 en een Mw van 95.000 g/mol werd gekocht bij Shandong Medical Appliance Factory (China). GO werd gekocht bij de biochemische Polytron Technologies Inc. uit Shanghai Aladdin. MC3T3-E1-osteoblastcellen werden geleverd door de celbank van de Shanghai Chinese Academy of Sciences. Foetaal runderserum (FBS), antibioticum-antimycoticum, CCK-8 en Dulbecco's gemodificeerde Eagle-media (DMEM) werden verkregen van Tianjin Nobuo Letter Technology Co., Ltd. 1,4-dioxaan, fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS, 0,1 M, PH 7.4), en alle andere chemicaliën waren van analytische kwaliteit en gebruikt zoals ontvangen zonder verdere zuivering.

Voorbereiding van de nHAC Power en nHAC/PLGA/GO composietsteigers

De methode voor het samenstellen van nHAC-poeder is eerder gerapporteerd [66,67,68]. In het kort werd collageen opgelost in azijnzuur (0,5 mol/L) en vormde een oplossing met een concentratie van 4 g/L. De CaCl₂ en H₃ PO₄ (Ca/P =-1,66) oplossingen werden vervolgens afzonderlijk druppelsgewijs toegevoegd. De druppelsnelheid is 100 druppels per minuut. De oplossing werd voorzichtig geroerd en getitreerd bij 37 ° C met ammoniakoplossing tot pH 9. Na 24 uur werd de nHAC-afzetting geoogst door centrifugeren en vriesdrogen. Voor de bereiding van nHAC/PLGA/GO-composietsteigers werd GO gelijkmatig gedispergeerd in dioxaan met behulp van een ultrasone celbreker, waarbij een eindconcentratie werd gevormd van respectievelijk 0,0, 0,5, 1,0 en 1,5 g/l. De PLGA werd vervolgens toegevoegd aan GO-oplossingen, waardoor een eindconcentratie van 10% (m/v) werd gevormd. De GO/PLGA-oplossingen werden vervolgens gedurende 12 uur zachtjes bij kamertemperatuur geroerd. De uiteindelijke oplossing werd gevormd door de nHAC-kracht toe te voegen aan de GO/PLGA-oplossing in een gewichtsverhouding van 1:1 nHAC:PLGA. De gevormde nHAC/PLGA/GO-oplossing werd vervolgens 4 uur geroerd en ultrasoon behandeld. Na een nacht bij -20 °C ingevroren te zijn, werden de nHAC/PLGA/GO-composietsteigers verkregen door vriesdrogen om dioxaan te verwijderen.

Karakteriseringen

De samengestelde steigers werden bedekt met goud en werden bekeken onder een SEM (JSM-7100F). We spuiten goud gedurende 20 s voor de voorbereiding van elektronenmicroscopiemonsters. De topografie en de mechanische eigenschappen van de matrices werden gekarakteriseerd door atomaire krachtmicroscopie (AFM, Multimode VIII, Bruker, Duitsland) in lucht. Beeldanalyse werd uitgevoerd met behulp van Gwyddion en Nanoscope Analysis Software. Samenstellingsanalyse van de nHAC / PLGA / GO-composietsteigers werd uitgevoerd door een FT-IR-spectrofotometer (VECTOR22, Bruker, Duitsland). Alle spectra zijn opgenomen in absorptiemodus in het golflengtebereik van 1000–2200 cm⁻¹ met een resolutie van 4,0 cm⁻¹ en 16 keer scannen. De contacthoeken van de monsters werden gemeten met behulp van een contacthoekmeetsysteem volgens de sessiele-druppelmethode (EasyDrop, model DAS30, kruss, Duitsland). De XRD-patronen werden gemeten met behulp van de röntgendiffractometer (D8 DISCOVER). De Cu-Kα-straling (λ = 0.154 nm) is 40 kV en 30 mA. De scansnelheid van de metingen is 8°min⁻¹ over het 2θ-bereik van 5-80 ° bij kamertemperatuur. De porositeit van de steigers werd gemeten met een automatische oppervlakte- en porositeitsanalysator (ASAP 2460, Micromeritics, GA, VS).

Celcultuur

MC3T3-E1-osteoblastcellen werden geïncubeerd in DMEM aangevuld met 10% FBS en 3% antibioticum-antimycotische oplossing bij 37 ° C en 5% CO₂ in een celincubator. De initiële hechting en proliferatie werden getest met CCK-8 volgens de instructies van de fabrikant, waarbij het aantal levensvatbare cellen recht evenredig was met de metabole reactieproducten die werden verkregen in de CCK-8-assay [69]. In het kort, de MC3T3-E1 osteoblastcellen werden gezaaid met een dichtheid van 2,5 × 10⁴ cellen per putje op de matrices nHAC/PLGA, nHAC/PLGA/GO (0,5 gew.%), nHAC/PLGA/GO (1,0 gew.%) en nHAC/PLGA/GO (1,5 gew.%) ingebed in celcultuur met 48 putjes bord. De cellen werden geïncubeerd met de CCK-8-oplossing in de laatste 2 uur van de kweekperioden (1, 3, 5 en 7 dagen) voor de proliferatie bij 37 ° C in het donker. De absorptie werd gemeten bij een golflengte van 450 nm met een ELISA-lezer (DNM-9602).

De celmonsters voor SEM-meting werden gefixeerd met formaldehyde en de monsters werden vervolgens gedurende 15 minuten bij elke concentratie gedehydrateerd door een gegradeerde reeks ethanol (30, 50, 75, 95 en 100%). Vervolgens werden de monsters gedroogd door middel van droging op het kritische punt met een kooldioxide-analysator (Hitachi, HCP-2). Finally, the samples with gold coating were observed by SEM.

Cytotoxicity Test

The fibroblasts cells concentration was adjusted to 1 × 10⁴ /ml and was inoculated into 96-well plates at 200 ul per well. Then, the well plates were incubated at 37 °C in a 5% CO₂ incubator for 24 h. The samples (nHAC/PLGA, nHAC/PLGA/GO (0.5 wt%), nHAC/PLGA/GO (1.0 wt%) and nHAC/PLGA/GO (1.5 wt%)) were powdered to make a 100 mg/ml suspension. The experiment group with 100 ul suspension and control group with equal volume of DMEM complete medium were incubated for 24 h and were further incubated for 4 h after the CCK-8 was added to the incubator. The cell viability was obtained by measuring the absorbance at the wavelength of 450 nm using an ELISA reader. The cell viability was calculated by using the following formula,

$$ \mathrm{Cell}\ \mathrm{viability}\ \left(\%\right)=\left[\mathrm{A}\ \left(\mathrm{experiment}\right)-\mathrm{A}\ \left(\mathrm{blank}\right)\right]/\left[\mathrm{A}\ \left(\mathrm{control}\right)-\mathrm{A}\ \left(\mathrm{blank}\right)\right]\times 100\% $$

Where A (experiment) represents absorbance of wells with cells, CCK-8 solution and power samples solution; A (blank) represents absorbance of wells with medium and CCK-8 solution without cells and A (control) represents absorbance of wells with cells, CCK-8 solution without power samples solution.

Statistische analyse

Quantitative results were expressed as the mean value from at least triplicate samples ± standard deviation (SD). Student’s t test was used to the statistical analysis. A value of p < 0.05 was considered statistically significant. Data are marked ** to indicate p < <0.01.

Afkortingen

3D:: Driedimensionaal
AFM:: Atoomkrachtmicroscopie
CCK-8:: Cell counting kit-8
CTD:: Computational topology design
DMEM:: Dulbecco’s modified Eagle media
EDS:: X-ray spectroscopy
FBS:: Foetaal runderserum
FT-IR:: Fourier-transformatie infraroodspectroscopie
GO:: Graphene oxide
HA:: Hydroxyapatite
MC3T3-E1:: Osteoblast cells
MSC's:: Mesenchymale stamcellen
nHAC:: Nano-hydroxyapatite/collagen
NIH-3T3:: Fibroblast cells
PBS:: Phosphate-buffered saline
PLA:: Poly(lactic acid)
PLGA:: poly(lactic-co-glycolic acid)
QNM-AFM:: Quantitative nano-mechanical atomic force microscope
SD:: Standard deviation
SEM:: Scanning elektronenmicroscoop
SFF:: Olid free-form fabrication
XRD:: Röntgendiffractie

Mesoporeuze nikkeloxide (NiO) nanopetals voor ultragevoelige glucosewaarneming Gemakkelijke synthese van wormgatachtig mesoporeus tinoxide via verdamping-geïnduceerde zelfassemblage en de verbeterde gasdetectie-eigenschappen

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal