DNA-tetraëderafgifte verbetert door doxorubicine geïnduceerde apoptose van HT-29 colonkankercellen

Methoden

Regenten en uitrusting

DNA-oligonucleotideketens werden gekocht bij TAKARA in Dalian, China. Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) en foetaal runderserum werden gekocht bij Gibco in NY, VS. Penicilline en streptomycine werden gekocht bij Beyotime biotechnology in Shanghai, China. Foliumzuur, doxorubicine, 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-difenyl-2-H -tetrazoliumbromide (MTT) en agarose werden gekocht bij Sigma-Aldrich in MO, VS. Alle antilichamen werden gekocht bij Abcam Company in Shanghai, China. Andere reagentia werden gekocht bij Sinopharm Chemical Regent Co., Ltd., in Shanghai, China.

UV-Vis-spectrofotometer (Thermo Evolution 201) en incubator met constante temperatuur werden gekocht bij Thermo Fisher in de VS; centrifugaalmachine (GT10-1) werd gekocht bij Beijing Era Beili Centrifuge Co., Ltd.; fluorescentiespectrofotometer (UV-1800) werd gekocht bij Shimadzu Corporation. Confocale laser scanning microscopie (Visitech) werd gekocht bij Leica-bedrijven; polymerasekettingreactie-instrument (PCR, T100), eiwitelektroforese en nucleïnezuurelektroforese-apparatuur werden gekocht bij Bio-Rad Company; dynamische lichtdeeltjesgrootte-analysator werd gekocht bij Beckman Company; celkweekplaten met 96 putjes of 24-putjes werden gekocht bij Dow Corning Corporation. High-performance vloeistofchromatografie (HPLC, Agilent 1200) met C18-kolom werd gekocht bij Agilent Technologies.

De humane colonkankercellijn HT-29 werd onderhouden in DMEM aangevuld met 10% foetaal runderserum, 100 E/ml penicilline en 100 μg/ml streptomycine in een bevochtigde atmosfeer met 95% lucht en 5% koolstofdioxide bij 37 °C .

Synthese en zuivering van DNA-tetraëder

In dit onderzoek volgde de synthese de schematische procedures in Fig. 1 en de enkelstrengs DNA (ssDNA) sequenties van DNA-tetraëder worden ook in Fig. 1 verschaft. In detail werd elk ssDNA opgelost in 0, 5 x TE-buffer en de overeenkomstige optische dichtheid (OD) -waarde van DNA werd bepaald met een UV-spectrofotometer bij 260 nm. Extra TE-buffer werd aangevuld om vier ketens met dezelfde concentratie te maken. De mengverhouding van vier ssDNA's was 1:1:1:1 bij 1 M in 100 μL. De reactie werd uitgevoerd in een polymerasekettingreactie (PCR)-machine met de cyclusomstandigheden:95 ° C, 10 min, natuurlijk afgekoeld tot 4 ° C. Al het enkelstrengs DNA werd gezuiverd door HPLC met 260 nm als karakteristieke absorptiepiek. In het HPLC-spectrum was de piektijd van DNA-tetra sneller dan die van een enkele streng, en het product werd op het overeenkomstige tijdstip verzameld.

Schematisch diagram van foliumzuur-DNA tetra-Dox, DNA tetra-Dox en foliumzuur-DNA tetra. De enkelstrengs DNA-sequenties van DNA-tetraëder werden verschaft. Het proces van het richten op tumorcellen, het doordringen door het celmembraan en het inbrengen van de DNA's werd afgebeeld

Synthese en karakterisering van foliumzuur-DNA tetra-Dox

Vrije waterstofgroepen van Dox en foliumzuur werden gemodificeerd met een azidegroep en vervolgens gekoppeld aan 3'-OH van ssDNA via klikchemie [21]. Wanneer een andere hoeveelheid ssDNA met functionele groep wordt toegevoegd, kan de verhouding van functionele groepen stoichiometrisch worden gecontroleerd via specifieke hybridisatie van zijketens. Voor de synthese van foliumzuur-DNA-tetra werd de molaire verhouding van foliumzuur en DNA-tetraëder ingesteld op 1:1. Voor de synthese van DNA-tetra-Dox werd de molaire verhouding van Dox en DNA-tetraëder ingesteld op 4:1. Voor de synthese van foliumzuur-DNA-tetra-Dox werd de molaire verhouding van foliumzuur, DNA-tetraëder en Dox respectievelijk ingesteld op 1:1:3. Alle synthese werd uitgevoerd op micromolair niveau bij 37 ° C en vervolgens bewaard bij 4 ° C [22].

In deze studie werd de reeks DNA-tetracomplexen gekarakteriseerd door polyacrylamidegelelektroforese (PAGE) met 8% scheidingsgel (39% Acr-Bis) om de zuiverheid en relatieve molecuulgroottes te controleren. De monsters bestonden uit de verschillende DNA-tetrastructuren en 6x laadbuffer met een mengverhouding van 2:1. De monsters werden gekleurd en geanalyseerd na gelelektroforese gedurende 90 minuten bij 110 V. Om de verschillen in deeltjesgrootte te achterhalen, werden DNA-tetra-monsters ook gescand door dynamische lichtverstrooiing (DLS) instrumenten met dynamisch licht.

DNA tetra-gefaciliteerde cellulaire opname

Voor de verschillende koppelingsstructuren die in dit onderzoek zijn ontworpen, werden de opnamesnelheden door HT-29-cellen vergeleken om de efficiëntie van de medicijnafgifte te bepalen. Cellulaire opname-efficiëntie werd geëvalueerd en gekwantificeerd met behulp van het karakteristieke fluorescentiespectrum van Dox, d.w.z. excitatielicht bij 470 nm en emissielicht bij 590 nm. De HT-29-cellen op 2 × 10 ⁵ / ml werden gezaaid in platen met 24 putjes en 24 uur gekweekt. Cellen werden nog 24 uur geïncubeerd met verschillende DNA-tetrastructuren bij 10 μM. Het medium werd vervolgens weggegooid en de cellen werden driemaal gespoeld met PBS. Voor celfixatie werd 4% paraformaldehyde onmiddellijk toegevoegd bij kamertemperatuur gedurende een co-incubatie van 30 minuten, en de cellen werden opnieuw driemaal gespoeld met PBS. Eindelijk werden de platen met 24 putjes waargenomen door een confocale lasermicroscoop om de cellulaire opname-efficiëntie te vergelijken op basis van de lichtintensiteit van emissielicht.

Cytotoxiciteit en efficiëntie tegen kanker

Cytotoxiciteit en efficiëntie tegen kanker werden geëvalueerd met behulp van MTT-assay, waarbij een redoxreactie optreedt tussen de MTT in DMSO en intracellulair succinaatdehydrogenase. HT-29-cellen werden gezaaid in kweekplaten met 96 putjes en 24 uur gekweekt.

Voor de cytotoxiciteit van DNA-tetra als geneesmiddeldrager werd medium met DNA-tetra-structuren in een concentratie van 0-100 μM toegevoegd voor nog een incubatie van 24 of 48 uur. Vervolgens werd 100 μL MTT-oplossing (5 mg / ml) aan elk putje toegevoegd en het mengsel werd gedurende 4 uur bij 37 ° C geïncubeerd. De vloeistof werd vervolgens verwijderd en de cellen werden gelyseerd en opgelost met 200 μL DMSO. De absorptie van supernatant werd gemeten bij 570 nm door Microreader. Het niet-behandelde HT-29-monster werd als controlegroep beschouwd.

Voor de DNA-tetraëder gekoppeld aan foliumzuur of Dox richtte het onderzoek zich enerzijds op de stabiliteit, bioveiligheid en remmingsefficiëntie; aan de andere kant werd ook onderzocht of de Dox van DNA-tetra-Dox vergelijkbare antitumoreigenschappen heeft als voorheen of niet. Daarom werden cytotoxiciteit en antitumorefficiëntie van DNA-tetracomplexen geëvalueerd. Complexen bij respectievelijk 100 M werden geïncubeerd met HT-29-cellen. Celmonsters werden elke 6 uur verzameld en vervolgens gedetecteerd met MTT-assay om het effect van de incubatieperiode te evalueren. Bijzondere aandacht werd besteed aan het verschil in efficiëntie tegen kanker als gevolg van de variaties van structuren. Bovendien werden concentratie-effecten op remming van HT-29 na behandeling met foliumzuur-DNA-tetra-Dox geëvalueerd bij 0-200 μM via MTT-assays.

Western Blot en flowcytometrie

Om de cellulaire apoptose te karakteriseren die wordt veroorzaakt door Dox, gefaciliteerd door DNA-tetra-afgifte, werden eiwitmonsters van behandelde cellen verwarmd en gekraakt met behulp van pyrolysevloeistof, geanalyseerd met 12% SDS-PAGE onder de conditie van 100 V bij constante stroom om monsters te scheiden, en vervolgens geblot tot 0,22-μm-diameter PVDF-membranen gedurende 1 uur. De monsters werden gedurende 1 uur geblokkeerd met magere melk. Na driemaal gewassen te zijn met PBST, werden de monsters een nacht geïncubeerd met anti-caspase-3 van konijnen. Vervolgens werden de monsters gedurende 1 uur onderzocht met een geit-anti-konijn IgG secundair antilichaam en vervolgens gewassen met PBST en afgebeeld via een Bio-Rad-eiwitbeeldvormingssysteem. Verder werd GAPDH gekozen als intern referentie-eiwit vanwege de stabiele expressie in cellen.

Flowcytometrie werd verder gebruikt om de niveaus van apoptose op de geselecteerde concentratie en tijdstip via MTT-assays te kwantificeren. HT-29-cellen werden gedurende een bepaalde tijd met remmers geïncubeerd en vervolgens gemeten via kwantitatieve flowcytometrie met behulp van de Annexin V-PI dubbele kleuringsmethode.

Kwantificering van celproliferatie

De celtelmethode werd gebruikt om de celproliferatie in de tijd te kwantificeren. In detail, na behandeling met foliumzuur-DNA tetra-Dox gedurende een tijdsperiode bij 100 μM, werden cellen gedurende 30 s verteerd met 0,25% trypsine en vervolgens werd het gelijke volume compleet medium toegevoegd om de reactie te beëindigen. Supernatant werd weggegooid na 3 minuten centrifugeren bij 1000 rpm en de cellen werden opnieuw gesuspendeerd met compleet medium. Het aantal cellen in elk detectiepunt werd opgenomen onder een optische microscoop met behulp van celtelplaten, om de cellulaire proliferatiecurve te tekenen.

Statistische analyse

In dit onderzoek werden significanties van verschillen bepaald met behulp van Student's t test (tweezijdig; twee steekproeven gelijke variantie). P < 0.05 betekent significante verschillen tussen verschillende groepen.

Resultaten

Bereiding van foliumzuur-DNA tetra-Dox

In een specifiek syntheseproces werd Dox gemengd met DNA-tetraëder in verschillende verhoudingen om het laden en assembleren van Dox te voltooien (w _m = 543.52) en foliumzuur (w _m = 441.4). Zoals getoond in Fig. 2a, vanwege het feit dat Dox en foliumzuur monomeren zijn met een relatief laag en vergelijkbaar molecuulgewicht, hadden DNA in een tetraëder en de conjugaten met één functioneel molecuul ongeveer equivalente molecuulgewichten. Dox- of foliumzuurassemblage met alle vier de DNA-hoekpunten van de tetraëder zorgde echter voor een duidelijke toename van de moleculaire grootte van DNA-tetra. Zoals getoond in figuur 2b, was de meeste DNA-tetraëdrische monomeergrootte minder dan 15 nm. Met de toename van koppelingsgroepen werd de symmetrische structuur van DNA-tetra vernietigd en nam het medium van deeltjesgroottes van verbindingen aanzienlijk toe. Met name de grootte-uitbreiding van foliumzuur-DNA tetra-Dox breidde het medium met een diameter uit tot 20 nm.

Karakterisering van DNA-tetra met verschillende bestanddelen. een Van links naar rechts:DNA-ladder, DNA-tetra, foliumzuur-DNA-tetra, foliumzuur-DNA tetra-Dox en DNA-tetra-Dox afgebeeld in 8% SDS-PAGE. b De grootteverdeling van DNA tetra, foliumzuur-DNA tetra, foliumzuur-DNA tetra-Dox en DNA tetra-Dox gedetecteerd via dynamische lichtverstrooiing

Efficiëntie van medicijnafgifte

Na 24 uur te zijn geïncubeerd met verschillende DNA-tetrastructuren, werd de intracellulaire efficiëntie van Dox geëvalueerd met fluorescentiebeeldvorming, waarbij de intracellulaire rode fluorescentie de karakteristieke fluorescentie van Dox is; daarom vertoonden cellen die waren geïncubeerd met DNA-tetra geen fluorescent signaal zoals getoond in Fig. 3a, en de rode signalen van cellen die waren geïncubeerd met foliumzuur-DNA tetra-Dox en DNA tetra-Dox-complexen waren duidelijk hoger dan die met Dox, wat betekent de aanzienlijk verbeterde cellulaire opname-efficiëntie van Dox als gevolg van de DNA-tetra vergemakkelijkte de penetratie door het membraan, evenals de intracellulaire stabiliteit van de conjugaten tussen Dox en DNA-tetra.

De opname-efficiëntie van HT-29-cellen na 24 uur te zijn geïncubeerd met verschillende complexen. een Confocale microscopiedetectie (rood is fluorescentie-excitatielicht van Dox, schaalbalk =10 μm). b Intensiteit van cellulaire fluorescentie. **P < 0,05 in vergelijking met de groep van DNA-tetra

De verdere kwantitatieve analyse van de fluorescentie-intensiteit (Fig. 3b) bewees de visuele bevindingen en er was geen significant verschil tussen foliumzuur-DNA tetra-Dox en DNA tetra-Dox-complexen (P <0,05). De methodologie van co-incubatie van medicijnen en cellen belemmert de volledige tentoonstelling van het doelgerichtheidsvermogen van foliumzuur. De relatief hoge concentratie bevestigde de specifieke herkenning van folaatreceptoren, wat theoretisch duidelijker is in de in vivo toepassingen met het complexe circulatiesysteem. Kortom, de levering van DNA-tetra garandeerde de efficiëntie tegen kanker van Dox.

Cytotoxiciteit en efficiëntie tegen kanker

Eerst werd de levensvatbaarheid van HT-29-cellen die samen waren geïncubeerd met verschillende concentraties DNA-tetra onderzocht met behulp van MTT-assay. Er was geen duidelijke cytotoxiciteit van DNA-tetra-behandeling in HT-29-cellen bij 0-100 μM gedurende 24 en 48 uur (figuur 4a). Vandaar dat de DNA-tetraëder van nanoformaat een bioveilig platform voor medicijndragers bood.

De cytotoxiciteit en antitumorefficiëntie van Dox-complexen en DNA-tetra voor HT-29-cellen. een De levensvatbaarheid van HT-29-cellen die 24 of 48 uur met DNA-tetra in verschillende concentraties zijn geïncubeerd. b De antitumorefficiëntie van Dox-complexen bij 100 M. c De levensvatbaarheid van HT-29-cellen die 24 of 48 uur zijn geïncubeerd met foliumzuur-DNA tetra-Dox in verschillende concentraties

Ten tweede vertoonden foliumzuur-DNA tetra-Dox en DNA tetra-Dox, als gevolg van het verschil in Dox-afgifte-efficiëntie, binnen 48 uur een significantere remmingsefficiëntie (figuur 4b). Door het ontbreken van effectieve antikankercomponenten, leidde DNA-tetra-foliumzuur tot een verwaarloosbare afname (< 10%) van de levensvatbaarheid tijdens de 48-uur durende co-incubatie. Omdat Dox niet objectief door het membraan kan dringen, was de door Dox geïnduceerde afname van de cellulaire levensvatbaarheid minder dan de andere groepen. Met name de foliumzuur-DNA-tetra-Dox vertoonde een meer eerdere en significante afname 6 uur na de incubatie, wat bewijst dat de foliumzuurtargeting de medicijnen helpt om zich op het membraan te lokaliseren en ervoor zorgt dat de Dox sneller van kracht wordt. Daarentegen begon DNA-tetra-Dox duidelijk 12 uur na de incubatie van kracht te worden, wat het belang aantoont van het targeten van groepen.

Verder werden HT-29-cellen behandeld met foliumzuur-DNA tetra-Dox bij 0-200 μM om de effectieve concentratie te detecteren (figuur 4c). Cellulaire levensvatbaarheid van HT-29-cellen nam snel af met toenemende concentratie (0-100 M) van het complex, maar er waren geen significante verschillen tussen de concentratie van 100 en 200 μM, wat wijst op een dosisafhankelijke manier van foliumzuur-DNA tetra- Dox, waarbij 100 μM kan worden beschouwd als een effectieve concentratie voor antitumoreffect. Bovendien veranderde de cellulaire levensvatbaarheid aanzienlijk van 24 tot 48 uur voor de groepen van 10, 20 en 50 μM, wat aangeeft dat de incubatietijd ook een factor was bij het beïnvloeden van de op foliumzuur-DNA tetra-Dox gebaseerde antikanker-efficiëntie.

Apoptose geïnduceerd door foliumzuur-DNA tetra-Dox

Dienovereenkomstig was er, op basis van de western-blot-assays (Fig. 5a), een significante toename van de expressie van caspase-3 geïnduceerd door foliumzuur-DNA-tetra-Dox en DNA-tetra-Dox, wat aantoont dat apoptose de belangrijkste manier was van Dox- geïnduceerde celdood.

De cellulaire expressie van apoptose-gerelateerde caspase-3 na behandeling met verschillende complexen (a ) en de flowcytometrie van HT-29-cellen na geïncubeerd te zijn met DNA tetra, Dox, DNA tetra-Dox en foliumzuur-DNA tetra-Dox (b –e )

De flowcytometrie (Fig. 5b-e) bewees verder dat 6-uur incubatie met foliumzuur-DNA tetra-Dox bij 100 μM 68,7% apoptose induceerde. Ondertussen waren de apoptose-niveaus geïnduceerd door Dox en DNA-tetra-Dox slechts 32,8 en 60,5% met dezelfde incubatieconditie.

Remming op celproliferatie

Op basis van de MTT-assays was 100 μM de effectieve concentratie voor apoptose-inductie en werd geselecteerd in het cellulaire proliferatie-experiment. Zoals blijkt uit de cellulaire proliferatiecurve (Fig. 6), werd de remming van celproliferatie niet volledig aangetoond tijdens het vroege stadium van co-incubatie, vanwege het tijdrovende proces van cellulaire opname. Een significant remmend effect werd gepresenteerd na meer dan 6 uur te zijn geïncubeerd met foliumzuur-DNA tetra-Dox, wat het bestaan ​​​​van DNA-tetra-versterkte endocytose aantoont. Ondertussen is 6 h een vergelijkende tijdsperiode met de effectieve tijdsperiode die is gedetecteerd in Fig. 4b.

Remming van celproliferatie geïnduceerd door de incubatie met foliumzuur-DNA tetra-Dox bij 100 μM gedurende verschillende tijdsperioden

Discussie

Als het gebruikelijke middel voor DNA-modificatie, had de klikchemiereactie voordelen van hoge reactie-efficiëntie, goed-controle en gemakkelijke werking [21]. Elektroforetogram weergegeven met een enkel merk (Fig. 2a), wat aangeeft dat de producten met hoge zuiverheid werden verkregen door covalente koppeling via klikchemiereactie. De fluorescerende eigenschap van Dox maakt het traceerbaar in vitro en in vivo; ondertussen bewees de fluorescentie in de tumorcellen indirect de stabiliteit van foliumzuur-DNA tetra-Dox tijdens het penetratieproces door het celmembraan. Daarom was de foliumzuur-DNA-tetra-Dox geschikt en stabiel voor biomedische toepassingen.

DNA tetra heeft het vermogen om medicijnen in cellen af ​​te leveren. Alle DNA-sequenties die in dit onderzoek zijn gebruikt, waren niet gecodeerd voor genetische informatie. Er werden dus geen bijwerkingen op zowel de genexpressie als het celmetabolisme gerapporteerd in alle onderzoeken. Ondertussen wordt foliumzuur, vanwege de hoge expressie van folaatreceptor op het oppervlak van tumorcellen, geselecteerd als specifieke targeting-moleculen van het medicijnafgiftesysteem om de opname-efficiëntie van DNA-tetra-complexen te verbeteren. Met de omstandigheden van DNA-tetra bij relatief hoge concentraties, werd het voordeel van foliumzuurreceptortargeting in vitro echter niet volledig weerspiegeld. Dienovereenkomstig was het foliumzuur voor in vivo toepassing mogelijk om de targeting-efficiëntie in het complexe circulatiesysteem te verbeteren.

Momenteel brengen geneesmiddelen tegen kanker vaak onverwachte bijwerkingen met zich mee, dus het onderzoek naar het verbeteren van het vermogen tot het richten van tumorcellen en de afgifte-efficiëntie is een hot topic [23,24,25]. Eerdere studies toonden aan dat de capaciteit van DNA-tetraëder voor het dragen van medicijnen was gebaseerd op de goede compatibiliteit ervan. DNA-tetraëder is een kunstmatige container met gunstige modificatie en goede biocompatibiliteit. In deze studie bereikte de succesvolle koppeling van Dox en foliumzuur met DNA-tetraëder een bevredigend remmend effect en leidde tot duidelijke apoptose van HT-29-cellen. Omdat DNA-tetra kan worden gemodificeerd en gekoppeld aan medicijnen en targeting-moleculen, werd de verrijking van de lokale medicijnconcentratie in tumorcellen gerealiseerd. De bovenstaande resultaten bewezen de goede herkenning van tumorcellen en het bijbehorende verbeterde remmende effect via DNA-tetra-afgifte, en dit medicijnafgiftesysteem van nanoformaat kan op grotere schaal worden gebruikt.

Conclusies

Als een nieuw ontwikkelde strategie voor het afleveren van geneesmiddelen zijn DNA-structuren van nanoformaat goedkoop, stabiel en gemakkelijk te synthetiseren; ondertussen is het biologisch veilig vanwege het ontbreken van exogene immuunactiviteit. DNA-tetraëderkoppelingsstrategie vergemakkelijkt de gerichte toediening van Dox, verbetert de antikanker-efficiëntie van Dox op darmkankercellen en biedt een veelbelovende inspiratie en idee voor medicijnontwerp.