Folaatreceptor-gerichte bioflavonoïde genisteïne-geladen chitosan-nanodeeltjes voor verbeterd antikankereffect bij baarmoederhalskanker

Resultaten en discussie

Baarmoederhalskanker bij de mens is een van de populaire vormen van kanker in de vruchtbare leeftijd van vrouwen wereldwijd, die voornamelijk wordt veroorzaakt door het humaan papillomavirus. Daarom worden regelmatig behandelingsopties zoals chemotherapie, chirurgie en radiotherapie gebruikt; geen enkele is echter effectief bij de behandeling van baarmoederhalskanker. Van chemotherapeutische middelen of andere kleine moleculen is gemeld dat ze de efficiëntie van de kankerbehandeling verbeteren als ze specifiek worden toegediend. Onlangs hebben natuurlijke verbindingen veel aandacht gekregen bij de behandeling van kanker, omdat bekend is dat ze minder toxisch zijn in vergelijking met die van chemotherapeutische geneesmiddelen. Genisteïne heeft meer aandacht gekregen vanwege zijn krachtige antikankereigenschap. Het klinische potentieel van GEN werd echter belemmerd vanwege de slechte oplosbaarheid (~ 1,43 μg/ml) en de lage biologische beschikbaarheid. In de huidige studie hebben we ons voornamelijk gericht op het verhogen van de antikankereigenschap van GEN naar door FR-α tot overexpressie gebrachte HeLa baarmoederhalskankercellen door inkapseling in FA-geconjugeerde chitosan-nanodeeltjes (Fig. 1).

Schematische illustratie van de bereiding van met genisteïne beladen foliumzuur-geconjugeerde chitosan-nanodeeltjes

Fysicochemische karakterisering van GEN-geladen nanodeeltjessysteem

De grootte en het zeta-potentieel van het deeltjessysteem speelt een cruciale rol bij cellulaire internalisatie en systemische prestaties van geneesmiddelen tegen kanker. Dynamische lichtverstrooiing (DLS) werd gebruikt om de deeltjesgrootte en grootteverdeling van de GEN-geladen nanodeeltjes te bepalen (Fig. 2). De gemiddelde deeltjesgrootte van GCN was ~140 nm, terwijl FGCN ~165 nm was met een uitstekende polydispersiteitsindex. De gemiddelde hydrodynamische diameter van de FGCN is minder dan 200 nm, wat voldoende is om de tumorweefsels te penetreren met behulp van verbeterde permeatie- en retentie-effecten. De kleine deeltjesgrootte zou weerstand kunnen bieden aan de snelle verwijdering van nanodeeltjes uit het lichaam (RES) [20]. De oppervlaktelading wordt beschouwd als een belangrijke indicator van de deeltjesstabiliteit in suspensievorm. De gemiddelde zeta-potentiaal van GCN was +26 mV, terwijl FGCN +21,5 mV was. Een lichte afname van de oppervlaktelading kan worden toegeschreven aan de substitutie van de aminegroep van chitosan. Bovendien vertoonden GCN en FGCN een hoge invangefficiëntie van meer dan> 95%, wat aangeeft dat het geschikt is voor systemische toepassingen. De deeltjesgrootte en het zeta-potentieel van FGCN bleven gedurende 3 maanden onveranderd tijdens opslag, wat wijst op de hoge opslagstabiliteit (Fig. 3).

Transmissie-elektronenmicroscoop van FGCN

In vitro afgifteprofiel van GCN en FGCN in fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH 7,4). De hoeveelheid vrijgekomen geneesmiddel werd gekwantificeerd met de HPLC-methode en het experiment werd in drievoud uitgevoerd

Oppervlaktemorfologieanalyse

De oppervlaktemorfologie van geoptimaliseerd FGCN werd gekarakteriseerd door TEM. De nanodeeltjes vertoonden een bolvormige morfologie en waren gelijkmatig verdeeld in het koperen rooster. De deeltjesgrootte die werd waargenomen bij TEM-analyse was consistent met de DLS-waarneming (Fig. 4).

Cellulaire opname-analyse van GCN en FGCN in HeLa-cervicale kankercellen. een Kwantitatieve analyse van cellulaire opname van nanodeeltjes door fluorescentiemethode. b Op confocale laser scanning microscoop (CLSM) gebaseerde analyse van cellulaire opname. Cumarine-6 ​​werd gebruikt als een fluorescerende sonde

In vitro kinetiek van geneesmiddelafgifte

De afgifte van GEN uit GCN en FGCN werd uitgevoerd met behulp van de dialysemethode. PBS werd gebruikt om de afgiftestudie uit te voeren om fysiologische omstandigheden te simuleren. Zoals verwacht was het releaseprofiel van GCN en FGCN bijna gelijk. Beide formuleringen vertoonden een profiel van gecontroleerde afgifte voor GEN en vertoonden monofasische afgiftekinetiek. Ongeveer 35-40% van het medicijn kwam aan het einde van 24 uur vrij uit beide nanodeeltjessysteem. De trend van GEN-afgiftesnelheid zette zich voort tot het einde van de onderzoeksperiode en uiteindelijk werd ~ 90% van het medicijn vrijgegeven. De folaatconjugatie op het oppervlak beïnvloedt de lage afgifte van het geneesmiddel, wat wijst op de invloed van de aanwezigheid van geconjugeerd materiaal. Er is gemeld dat een gecontroleerde afgifte van geneesmiddel uit NP werd toegeschreven aan de verlenging van de padlengte van het geneesmiddel naar de buitenste afgiftemedia. Over het algemeen suggereert een gecontroleerde afgifte van het medicijn onder pH 7,4 omstandigheden dat een groot deel van het medicijn intact zal zijn en zich na verloop van tijd in de tumorweefsels zal ophopen.

In vitro onderzoek naar cellulaire opname

De intracellulaire concentratie van GEN is erg belangrijk om de cytotoxische werking ervan in de kankercellen op te wekken. Daarom is het cellulaire opnamepotentieel van het NP-systeem erg belangrijk vanuit het perspectief van de therapeutische werkzaamheid. De met cumarine-6 ​​geladen GCN en FGCN werden op verschillende tijdstippen in kankercellen geïncubeerd. Beide NP-systemen vertoonden een tijdsafhankelijke cellulaire opname met maximale cellulaire opname na 4 uur. Zoals verwacht vertoonde foliumzuurreceptorgerichte FGCN een statistisch (p <0,05) hogere cellulaire opname in HeLa-kankercellen. Nogmaals, de overheersende opname van FGCN zal in de meeste gevallen te wijten zijn aan de beschikbaarheid van FA op het deeltjesoppervlak die de interactie van ligand met de overeenkomstige receptoren zou kunnen vergemakkelijken en die in grote aantallen aanwezig is in HeLa-cellen [21].

De cellulaire opname wordt verder bevestigd door microscopische beeldvorming. De cellen werden geïncubeerd met gerespecteerde formuleringen en gedurende 2 uur geïncubeerd. Zoals te zien was, werd een hoge fluorescentie-intensiteit waargenomen voor aan FGCN blootgestelde kankercellen in vergelijking met die van met GCN behandelde cellen. Deze resultaten gaven aan dat foliumzuur-geconjugeerd FGCN een specifieke affiniteit had voor de kankerachtige HeLa-cellen dankzij ligand-receptor (FA-FR-α) herkenning.

In vitro cytotoxiciteit

De in vitro cytotoxische activiteit van GEN, GCN en FGCN op HeLa-kankercellen werd bestudeerd door het MTT-assayprotocol. Zoals te zien was, waren nanoformuleringen van GEN effectiever in het doden van de kankercellen in vergelijking met die van vrij GEN. Alle formuleringen vertoonden echter een typisch dosisafhankelijk cytotoxisch effect in de kankercellen. Zoals verwacht vertoonden foliumzuur-gelabelde nanoformuleringen een statistisch (p <0,05) hoger cytotoxisch effect in vergelijking met niet-gerichte formuleringen. Het superieure antikankereffect van FGCN werd toegeschreven aan de specifieke receptor-gemedieerde internalisatie van nanodeeltjes in de kankercellen die de concentratie van het geneesmiddel in de intracellulaire omgeving zou kunnen verhogen. Verder droeg het vermogen van nanodeeltjes om de afgifte van ingekapselde verbindingen te regelen ook bij aan de hoge cytotoxiciteit van FGCN. De IC50-waarde werd gebruikt om het werkelijke cytotoxische effect van formuleringen op de kankercellen te evalueren. Over het algemeen is het de concentratie die nodig is om de helft van de oorspronkelijke cellen te doden. De resultaten toonden aan dat de IC50-waarde van GEN daalde van 33,8 naar 26,5 μg/ml bij behandeling met GCN. Belangrijk is dat de IC50-waarde afnam tot 14,6 μg/ml bij behandeling met FGCN na 24 uur incubatie. Van nanodeeltjes is gemeld dat ze het MDR-effect verminderen en daardoor wordt verwacht dat ze de werkzaamheid tegen kanker van GEN verhogen door de efflux ervan uit cellen die worden gemedieerd door het P-glycoproteïne te verminderen. Het superieure antikankereffect van FGCN was consistent met de hoge cellulaire opname in HeLa-kankercellen [22].

Microscopische analyse

Morfologische analyse van kankercellen werd uitgevoerd na behandeling met geneesmiddelen tegen kanker. De formuleringen werden blootgesteld aan kankercellen en gedurende 24 uur geïncubeerd. De controlecellen waren normaal en verspreid over het dekglaasje van de putjesplaat, terwijl de cellen in de met formuleringen behandelde groep kromp. In overeenstemming met de cytotoxiciteitstest was de morfologie van kankercellen verschillend voor verschillende formuleringen. Zoals getoond, waren met FGCN behandelde cellen kleiner in aantal en ronde morfologie, wat wijst op de hogere cytotoxiciteit van de formuleringen. De GCN veroorzaakte ook opmerkelijke veranderingen in de kankercellen vanwege de redelijk hogere opname in kankercellen. De resultaten laten duidelijk zien dat met chitosan gecoate nanodeeltjes gunstig zullen zijn voor de behandelingen van baarmoederhalskanker (Fig. 5).

In vitro cytotoxiciteitsanalyse van GEN, GCN en FGCN in HeLa-kankercellen. De cellen werden behandeld met de respectievelijke formuleringen en 24 uur geïncubeerd. **p < 0.01 is het statistische verschil tussen FGCN en GEN.A

Live/Dead Assay

Het cytotoxische potentieel van individuele formuleringen werd verder onderzocht door middel van een levend/dood-assay. De hoeveelheid levende en dode cellen na de medicamenteuze behandeling (gedurende 24 uur) werd gevisualiseerd aan de hand van de groene fluorescentie-intensiteit. Calceïne AM en ethidiumbromide-kleurstof zijn representatieve markers voor levende en dode cellen die worden aangebracht op cellen die zijn behandeld met formuleringen. De resterende levende cellen die aanwezig zijn na medicamenteuze behandeling, nemen calceïne op en zenden groen fluorescerend licht uit (488 nm). Zoals getoond, vertoonden onbehandelde cellen een hoge fluorescentie-intensiteit (groene fluorescentie), en behandeling van vrij GEN verminderde ook niet de groeiende cellen. Aan de andere kant vertoonde FGCN minder levende cellen en hogere dode cellen (lage fluorescentie-intensiteit), wat wijst op het krachtige effect. Het hoge celsterftecijfer van de met FGCN behandelde groep werd toegeschreven aan de hogere internalisatie van nanodeeltjes in kankercellen. Het resultaat komt overeen met de cytotoxiciteitstest (Fig. 6).

Morfologische analyse van HeLa-kankercellen na behandeling met GEN, GCN en FGCN

Apoptose-analyse

In deze studie hebben we een uniek op foliumzuurreceptoren gericht toedieningssysteem ontworpen dat de intracellulaire concentratie van GEN zou kunnen verhogen en het antikankereffect in baarmoederhalskankercellen zou kunnen verbeteren. Om de apoptotische inductie-eigenschap van vrij GEN, GCN en FGCN NP te analyseren, werden daarom cellen beoordeeld met flowcytometrie na annexine V/PI dubbele kleuring. Figuur 7 laat zien dat cellen behandeld met vrij GEN geen merkbare apoptose van kankercellen induceerden, terwijl GCN (~22%) effectief was in het induceren van de apoptose in deze kankercellen. Zoals verwacht vertoonde FGCN een opmerkelijke apoptose van kankercellen (~ 55%), wat wijst op zijn superieure antikankereffect. Het hogere antikankereffect van formuleringen was te wijten aan de specifieke affiniteit van ligand voor de overeenkomstige receptoren, wat op zijn beurt de geneesmiddelconcentratie in de kankercellen verhoogde. De resultaten laten duidelijk zien dat met chitosan gecoate nanodeeltjes gunstig zullen zijn voor de behandelingen van baarmoederhalskanker. Het nanotechnologieplatform voor de geneesmiddelen tegen kanker verhoogde de toxiciteit in de kankercellen en verhoogde de therapeutische werkzaamheid van antitumormiddelen (Fig. 8).

Levende/dood-test van HeLa-kankercellen na behandeling met GEN, GCN en FGCN. De groene fluorescentie geeft de levende cellen aan

Apoptose-analyse van HeLa-kankercellen na behandeling met GEN, GCN en FGCN. Flowcytometer werd gebruikt om het aandeel van celapoptose te analyseren. **p < 0.01 is het statistische verschil tussen FGCN en GEN