MicroRNA-499-5p herstelt longfunctie bij sepsis-geïnduceerde letsel door Sox6 te targeten

Samenvatting

Achtergrond

MicroRNAs (miRs) zijn bekend om hun betrokkenheid bij sepsis; daarom onderzoeken we het beschermende effect van miR-499-5p dat sex-determining region Y-related high-mobility-group box 6 (Sox6) target op sepsis-geïnduceerde longschade in muizen.

Methoden

Het sepsis-geïnduceerde longschademodel werd gevestigd door caecale ligatuur en punctie. De nat/droog gewichtsratio (W/D), miR-499-5p, Sox6, Caspase-3 en Caspase-9 expressie in longweefsel van muizen werden getest. Longschadescore, kollagenvezel en de mate van longfibrose in longweefsel werden bepaald. Verder werd celdood in longweefsel gemeten. De inhoud van inflammatoire factoren en oxidatieve stressindices in bronchoalveolaire lavagevloeistof (BALF) en longweefsel werden gedetecteerd via loss-of-function en gain-of-function assays. De targetrelatie tussen miR-499-5p en Sox6 werd geverifieerd.

Resultaten

W/D ratio en Sox6 waren verhoogd terwijl miR-499-5p verlaagd was in longweefsel van muizen met sepsis-geïnduceerde longschade. Herstelde miR-499-5p of uitgedund Sox6 verlichtte de longweefselpathologie, verlaagde de longschadescore, kollagenvezel, de mate van longfibrose, TUNEL-positieve cellen, Caspase-3 en Caspase-9 proteïnexpressie en inflammatoire factoren in BALF en longweefsel alsook de oxidatieve stressrespons in longweefsel van muizen met sepsis-geïnduceerde longschade. MiR-499-5p targette Sox6.

Conclusie

Hoge expressie van miR-499-5p kan celdood in longweefsel atenueren en inflammatie van sepsis-geïnduceerde longschade in muizen inhiberen via uitschakeling van Sox6, en is een potentiële kandidaat-biomarker en therapeutisch target voor sepsis-geïnduceerde longschade.

Inleiding

Sepsis is een systemische inflammatie die ontstaat als gevolg van infectie en meerdere orgaanfunctiestoornissen veroorzaakt, waaronder het acute respiratoir distress syndroom. Het wordt gekenmerkt door diepe hypotensie, progressieve hypoxemie, weefselschade en inflammatoire veranderingen. De long is het meest kritieke en kwetsbare orgaan bij sepsis, en acute longschade (ALI) is een frequente sepsis-geïnduceerde inflammatoire ziekte. De ernst van sepsis-geïnduceerde ALI kan worden toegeschreven aan verminderde permeabiliteit van het alveocapillaire netwerk, wat resulteert in verminderde zuurstoftoevoer. Longceldood is een kritieke factor bij sepsis-geïnduceerde longschade. De pathophysiologie van sepsis-geïnduceerde ALI is onbekend; ondersteunende maatregelen en antibiotica zijn de enige beschikbare behandelingen voor sepsis- en ALI-patiënten, en hun impact op de hoge sterfte door sepsis is beperkt.

MicroRNAs (miRNAs) zijn kleine niet-coderende segmenten van endogeen geëxprimeerde RNAs, bestaande uit ongeveer 18–24 nucleotiden, die een breed scala aan cellulaire functies kunnen controleren en binden aan targetregio's van een specifiek gen om hun expressie te regelleren door mRNA-vertaling/transcriptie te inhiberen of activeren. MiR-499-5p is een recent ontdekt lid van de myosine-gecodeerde miRNAs. Een studie rapporteerde dat de serumspiegels van miR-499-5p gebruikt kunnen worden om orgaanfalen aan te duiden bij patiënten met sepsis. Een andere studie onthulde dat miR-499-5p-expressie betrokken is bij sepsis-geïnduceerde cardiale apoptose. De sex-determining region Y (SRY)-gerelateerde high-mobility box (HMG) (SOX)-familie wordt gedefinieerd door een set genen met een HMG-klasse DNA-bindend domein, wiens sequentie-identiteit met SRY groter is dan 50%. De Sox6-transcriptiefactor is onderdeel van de SRY-gerelateerde HMG-box-familie en wordt geëxprimeerd in meerdere weefsels tijdens de ontwikkeling, waar het een cruciale rol speelt in de overgang van prolifererende voorlopercellen naar functioneel volwassen cellen. Er is een studie die rapporteert dat verhoogde Sox6 geïmpliceerd is in sepsis-geïnduceerde cardiale apoptose. Studies hebben aangetoond dat Sox2- en Sox4-expressie verhoogd is in humaan klein-cellig longkanker. Maar de relatie tussen Sox6 en sepsis-geïnduceerde longschade vereist verder onderzoek. Dus ons doel was om het beschermende effect van miR-499-5p op sepsis-geïnduceerde longschade in muizen door Sox6 te targeten te verkennen.

Materialen en Methodes

Naleving van Ethische Standaarden

Alle dierproeven waren in lijn met de Richtlijnen voor de Zorg en Gebruik van Laboratoriumdieren van de National Institutes of Health. Het protocol was goedgekeurd door de Commissie voor de Ethiek van Dierproeven van het Weihai Municipal Hospital, Cheeloo College of Medicine, Shandong Universiteit.

Proefdieren

Gezonde mannelijke specifieke pathogen-vrije graad BABL/c muizen (6–8 weken oud, 18–22 g) werden gekocht van het proefdierencentrum van Shandong Universiteit (Shandong, China). De omgeving was ingesteld op 24 ± 2 °C met een 12-uurs licht/donker cyclus. Muizen hadden vrije toegang tot steriel voer en water. Experimenten startten na 7 dagen adaptieve voeding.

Vestiging van Sepsis-geïnduceerd Longschade Model door Caecale Ligatuur en Punctie (CLP) in Muizen

Muizen werden willekeurig verdeeld in 2 groepen: de sham-groep (n = 8) en de modelgroep. Muizen werden 12 uur voor de operatie gevasteerd en vervolgens geanesthetiseerd met 1% pentobarbitaalnatrium (70 mg/kg) via intraperitoneale injectie. De anesthesie-effect werd waargenomen; de ademhaling en hartslag van de muizen werden opgemerkt. Het hoofd en de ledematen van de muizen werden in rugliggende positie vastgezet, en de buikhuid werd voorbereid en gedesinfecteerd met jodophor-kogelwatten. Muizen in de modelgroep werden behandeld met een longitudinale incisie (1,0 cm) in het middensegment van de buikmiddellijn, de buikholte werd geopend, en de caecum werd uit de buikholte getrokken zonder de mesenteriale vaten te beschadigen. Het werd geligatured met een 1-0 zijden draad op 1/2 van het einde van de caecum, en de caecum werd gepunctureerd aan de controlaterale rand van het mesenterium met een punctienaald nr. 16. Een passende hoeveelheid darmgehachte werd uitgeperst, de caecum werd teruggeplaatst, en de incisie werd gehecht. Na openen van de buikholte werd bij muizen in de sham-groep alleen de caecum uitgehaald en vervolgens teruggeplaatst. Muizen werden subcutaan geïnjecteerd met 1 mL 0,9% natriumchloride-oplossing post-operatief, in kooien gescheiden en routinegewijs gevoederd.

In Vivo Transfectie

Voorafgaand aan modellering werden muizen toegewezen aan 7 groepen (n = 8): de modelgroep, de miR-499-5p agomir groep, de agomir negatieve controle (NC) groep, de small interfering RNA (si)-Sox6 groep, de si-NC groep, de miR-499-5p agomir + overexpressie (oe)-Sox6 groep en de miR-499-5p agomir + oe-NC groep. Een uur voor modellering werden muizen behandeld volgens de groepsindeling. Muizen werden geanesthetiseerd met 1% pentobarbitaalnatrium via intraperitoneale injectie, vervolgens in een 45° hellende rugliggende positie vastgezet, en de tong van de muizen werd naar de andere kant van de mond verplaatst om de luchtwegafgaan te waarborgen. De voorste halshuid van de muizen werd gedesinfecteerd en geïnsideerd om de trachea te blootleggen. Transfectiecomplex (50 μL) werd opgenomen door een microsampler (gedropt volgens de groep, dezelfde hoeveelheid fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) werd in de modelgroep gedropt) en vervolgens langzaam in de trachea gedropt. Na de transfectie werden de muizen verticaal gedraaid en het transfectiecomplex volledig in de longen verdeeld. Tijdens het transfectieproces werden de ademhaling en hartslag van de muizen waargenomen. Als ademhalings- en hartstilstand optrad, werd de transfectie onmiddellijk gestopt, en de luchtweg ontstop. De transfectie werd voortgezet toen de ademhaling en hartslag van de muizen stabiel waren. MiR-499-5p agomir en zijn NC alsook de bijbehorende plasmiden van Sox6 werden gekocht van Shanghai GenePharma Co., Ltd. (Shanghai, China). Na transfectie werden muizen in kooien gescheiden en 1 dag gevoederd, en vervolgens geëuthanaseerd. Muizen werden geanesthetiseerd met 1% pentobarbitaalnatrium via intraperitoneale injectie, in rugliggende positie vastgezet en vervolgens geëuthanaseerd door abdominale aorta-venesectie. De muizenhuid werd lokaal gedesinfecteerd, de borstholte geopend, de trachea en rechter hoofdbronchus afgebonden, de rechter hoofdbronchus doorgehakt, en de rechter long verwijderd. De onderste loof van de rechter long werd in 10% neutraal formalin geplaatst voor pathologisch onderzoek, de middenloof snel gewogen om het natte gewicht (W) te berekenen en gebakken bij 56°C, en het droge gewicht (D) berekend na 72 uur, waaruit de W/D ratio werd berekend. De bovenste loof werd in vloeibare stikstof opgeslagen voor mRNA- en proteïnedetectie. De linkerlong werd driemaal gewassen met 0,4 mL fysiologische zoutoplossing, en ongeveer 1 mL bronchoalveolaire lavagevloeistof (BALF) werd verzameld, overgebracht naar een 1,5-mL Eppendorf (EP) buisje en op ijs geplaatst. BALF werd gecentrifugeerd met 1500 rpm gedurende 5 min en overgebracht naar een nieuw EP-buizje, vervolgens opgeslagen bij -80°C voor detectie van inflammatoire factoren.

Daarnaast werden de muizen verdeeld in 3 groepen (n = 10/groep): sham-groep, modelgroep en miR-499-5p agomir groep (50 μL miR-499-5p agomir werd 1 uur voor de operatie in de trachea geïnstillerd). De overlevingscijfers werden elke 12 uur gemonitord, in totaal 7 dagen. De overlevingsstatus van de muizen binnen 7 dagen werd waargenomen, en de toxiciteit van miR-499-5p bepaald.

Hematoxyline-Eosine (H&E) Kleuring en Schade-Score

Longweefsel werd verwerkt tot paraffine coupes, gekleurd met H&E en bekeken onder een optische microscoop. Longschade werd gescoord (alveolaire congestie, bloeding, neutrofiele infiltratie of aggregatie in de alveolaire holte of vatenwand, alveolaire wandverdikking en/of hyaline membraamvorming) volgens het pathologische scorenstelsel voor longschade uitgegeven door de American Thoracic Society. 0 punten duidde op geen of zeer milde letsels; 1 punt op milde letsels; 2 punten op matige letsels; 3 punten op ernstige letsels; 4 punten op zeer ernstige letsels. De totaalscore van de vier items vertegenwoordigde de totaalscore van longschade.

Masson Kleuring en Score

Longweefsel werd verwerkt tot paraffine coupes (4 µm) en behandeld met Masson-kleuring. Kollagenvezel, slijm en kraakbeen waren blauw, cytoplasma, spier, cellulose en glia rood, en celkernen blauw-zwart. In het halfkwantitatieve Ashcroft-scorensysteem duidde 0 punten op normale long; 1 punt op milde vezelmatige verdikking van alveolaire of bronchiale wand; 3 punten op matige verdikking van alveolaire of bronchiolaire wand zonder schade aan de longstructuur; 5 punten op verergerende fibrose vergezeld van schade aan de longstructuur, vezelbanden of massa's vormend; 7 punten op ernstige longstructuurschade en grote fibrosegebieden, vezelbanden of klonters vormend; 8 punten op alle regionale vezelmatige packing.

Terminal Deoxynucleotidyl Transferase-gemedieerde Deoxyuridine Trifosfaat-Biotine Nick End-Labeling (TUNEL) Kleuring

De apoptose van longweefsel werd getest met TUNEL-kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Duitsland) en bekeken met een optische microscoop. De apoptotische cellen werden bruin gekleurd in de kern. De apoptose-index gaf het percentage TUNEL-positieve cellen aan.

Immunohistochemie

De longweefselcoupes werden gedeparaffineerd met xyleen, geïnculeerd met 3% waterstofperoxide en geblokkeerd met geiten-serum. Vervolgens werden Caspase-3 (ab13847, 1:500), Caspase-9 (ab32539, 1:250) en SOX6 (ab30455, 1:500, alle van Abcam, MA, VS) als antistoffen gebruikt om coupes te immuun-kleuren. Een optische microscoop (Leica Microsystems, IL, VS) werd gebruikt om beelden vast te leggen die vervolgens geanalyseerd werden met Image Pro Plus 6.0 software (Media Cybernetics, Rockville, MA, VS).

Reverse Transcriptie Kwantitatieve Polymerase Kettingreactie (RT-qPCR)

OMEGA kit (Solarbio science & technology Co., Ltd., Beijing, China) werd gebruikt voor extractie van totaal RNA in longweefsel en bepaling van RNA-concentratie. Het complementaire DNA (cDNA) werd gesynthetiseerd door reverse transcriptie volgens RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, VS). De primers werden ontworpen door Invitrogen (Carlsbad, CA, VS), zoals weergegeven in Tabel 1. PCR-reactie werd uitgevoerd volgens FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) kit (Roche). Het experiment werd kwantitatief geanalyseerd door de 2^−ΔΔCt methode. U6 was de laadcontrole van miR-499-5p, en GAPDH was de interne parameter voor andere genen.

Western Blot Analyse

Totaal proteïne werd verzameld door longweefsel te behandelen met radio-immunoprecipitatie-assay lyseringsbuffer. De totale proteïneconcentratie werd bepaald door de bicinchoninezuurmethode. Het proteïnemonster (30 μg) werd verwerkt door 10% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidgelektroforese, overgebracht naar polyvinylidenefluoride-membraan, geblokkeerd met 5% magere melkpoeder en geïnculeerd met primaire antistoffen Sox6 (ab30455, 1:1000, Abcam), Caspase-3 (9661, 1:1000, Cell Signaling Technology, MA, VS), Caspase-9 (9502, 1:1000, Cell Signaling Technology), tumornecrosefactor-α (TNF-α, ab6671, 1:1000, Abcam), interleukine-1β (IL-1β, 16806-1-AP, 1:500, Proteintech, VS), IL-6 (ab6672, 1:1000, Abcam) en GAPDH (sc-32233, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, VS). Vervolgens werd het membraan geïnculeerd met het secundaire antistof (1:2000) en ontwikkeld door versterkte chemiluminescentie.

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

De niveaus van IL-1β, IL-6 en TNF-α in BALF werden bepaald door ELISA-kit (Boster, Hubei, China). Kleurmetrische bepaling werd uitgevoerd bij 450 nm.

Detectie van Oxidatieve Stress Indices

De longweefsels in vloeibare stikstof werden gewogen en in een bepaalde verhouding fysiologische zoutoplossing gedilueerd onder lage temperatuur, vervolgens gehomogeniseerd en gecentrifugeerd bij 4°C, 3000 r/min gedurende 20 min bij lage temperatuur, en het supernataan genomen voor bepaling. De activiteit van myeloperoxidase (MPO) werd getest door MPO-detectiekit (NanJing JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, China), en malondialdehyde (MDA), superoxidedismutase (SOD), glutathionperoxidase (GSH-Px) en catalase (CAT) werden getest door kits geleverd door JianCheng Bioengineering Institute.

Dubbele Luciferase Reporter Gen Assay

Sox6 kan het targetgen zijn van miR-499-5p, voorspeld door een biologische website (https://www.targetscan.org/vert_72/). Er waren vier bindingsplaatsen tussen miR-499-5p en Sox6 mRNA 3'onverteerde regio (UTR). De pmiR-RB-REPORT-Sox6 wild type (WT) en pmiR-RB-REPORT-Sox6 mutante type (MUT) vectoren werden geconstrueerd door Guangzhou RiboBio Co., Ltd. (Guangdong, China), en de bijbehorende luciferase reporter plasmiden gegenereerd. TC-1 cellen (muizen longepithelecellen, 1 × 10⁵ cellen/put, Shanghai Yiyan biologische technologie Co., Ltd., Shanghai, China) wurden gezaaid in een 24-puttenplaat, en getransfecteerd met miR-499-5p agomir of agomir-NC, pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT of pmiR-RB-REPORT-Sox6 MUT via Lipofectamine2000. Dubbele luciferase reporter gen assay systeem (Promega, WI, VS) werd toegepast om luciferaseactiviteit te meten.

Statistische Analyse

Alle data werden geanalyseerd met SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, VS) software. De meetdata werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie. Vergelijkingen tussen twee groepen werden uitgevoerd met t-toets, vergelijkingen tussen meerdere groepen werden beoordeeld met eensidige variantieanalyse (ANOVA), en Tukey's post-hoc toets werd gebruikt voor pairwise vergelijking na ANOVA-analyse. Overlevingscurve werd gemaakt door Kaplan-Meier methode. P-waarde < 0,05 was indicatief voor statistisch significant verschil.

Resultaten

W/D Ratio en Sox6 zijn Verhoogd Terwijl miR-499-5p is Verminderd in Longweefsel van Sepsis-geïnduceerde Longschade Muizen

De toxiciteit van miR-499-5p werd getest op muizen om de overlevingstijd van septische muizen te detecteren. De resultaten toonden (Fig. 1a) de overlevingscijfers binnen 7 dagen van muizen in de sham-groep was 100%, en die van septische muizen was verlaagd. De overlevingscijfers van septische muizen na miR-499-5p-behandeling was verbeterd. De resultaten van W/D ratio van longweefsel toonden dat (Fig. 1b): versus de sham-groep, was W/D ratio verhoogd in de modelgroep (P < 0,05). In vergelijking met de agomir NC groep en de si-NC groep, was W/D ratio verlaagd in de miR-499-5p agomir groep en de si-Sox6 groep (beide P < 0,05). W/D ratio was duidelijk verhoogd in de miR-499-5p agomir + oe-Sox6 groep ten opzichte van de miR-499-5p agomir + oe-NC groep (P < 0,05).

MiR-499-5p en Sox6 expressie werden gedetecteerd en we vonden dat (Fig. 1c–f): in contrast met de sham-groep, miR-499-5p verlaagd en Sox6 verhoogd in de modelgroep (beide P < 0,05). Ten opzichte van de agomir NC groep, miR-499-5p verhoogd en Sox6 verlaagd in de miR-499-5p agomir groep (beide P < 0,05). Versus de si-NC groep, Sox6 verlaagd in de si-Sox6 groep (P < 0,05). In vergelijking met de miR-499-5p agomir + oe-NC groep, Sox6 dramatisch verhoogd in de miR-499-5p agomir + oe-Sox6 groep (P < 0,05).

Het proteïnegehalte van Sox6 in longweefsel van septische muizen werd bepaald door immunohistochemie (Fig. 1g). Er werd waargenomen dat versus de sham-groep, Sox6 proteïnexpressie verhoogd was in de modelgroep (P < 0,05); vergeleken met de agomir NC groep en si-NC groep, lagere Sox6 proteïnexpressie werd onderzocht in de miR-499-5p agomir groep en de si-Sox6 groep (beide P < 0,05); ten opzichte van de miR-499-5p agomir + oe-NC groep, was Sox6 proteïnexpressie verhoogd in miR-499-5p agomir + oe-Sox6 groep (P < 0,05).

Herstelde miR-499-5p of Uitgedund Sox6 Verlicht Longweefselpathologie, Verlaagt Longschadescore, Kollagenvezel en de Mate van Longfibrose in Sepsis-geïnduceerde Longschade Muizen

HE-kleuringsresultaten toonden aan dat (Fig. 2a): in de sham-groep was de longweefselstructuur intact, het alveolaire septum was vrijwel zichtbaar zonder oedeem of inflammatie, en de alveolaire holte was helder. In de model-, agomir NC-, si-NC- en miR-499-5p agomir + oe-Sox6-groepen, kon exsudatie, oedeem en bloeding worden gezien in de meeste alveolaire holtes van longweefsel, en massive infiltratie van inflammatoire cellen werd getoond in pulmonale interstitium. In de miR-499-5p agomir-, si-Sox6- en miR-499-5p agomir + oe-NC-groepen was de letsel van longweefsel verminderd versus de modelgroep.

Muis longschadescore en halfkwantitatieve Ashcroft-score resultaten toonden aan dat (Fig. 2b,d): ten opzichte van de sham-groep, waren longschadescore en de mate van longfibrose duidelijk verhoogd in de modelgroep (P < 0,05). Versus de agomir NC groep en si-NC groep, waren longschadescore en de mate van longfibrose verlaagd in de miR-499-5p agomir en de si-Sox6 groepen (beide P < 0,05). In contrast met de miR-499-5p agomir + oe-NC groep, waren longschadescore en de mate van longfibrose duidelijk verhoogd in de miR-499-5p agomir + oe-Sox6 groep (P < 0,05).

De resultaten van Masson-kleuring onthulden dat (Fig. 2c): in de sham-groep, bevatten muizen longweefsels een kleine hoeveelheid blauwe kollagenvezel. In de model-, agomir NC-, si-NC- en miR-499-5p agomir + oe-Sox6-groepen, waren de kollagenvezels verhoogd. In de miR-499-5p agomir groep, si-Sox6 groep en miR-499-5p agomir + oe-NC groep, waren de kollagenvezels verminderd versus de modelgroep.

Herstelde miR-499-5p of Uitgedund Sox6 Vermindert TUNEL-Positieve Cellen, Caspase-3 en Caspase-9 Proteïnexpressie in Longweefsel van Sepsis-geïnduceerde Longschade Muizen

Western blot, TUNEL-kleuring en immunohistochemie resultaten gaven aan dat (Fig. 3a–f): normale kern was blauw en apoptotische kern bruin in verschillende schaduwen. Versus de sham-groep, waren TUNEL-positieve cellen, Caspase-3 en Caspase-9 proteïnexpressie verhoogd in de modelgroep (alle P < 0,05). Versus de agomir NC en si-NC groepen, waren TUNEL-positieve cellen, Caspase-3 en Caspase-9 proteïnexpressie verlaagd in de miR-499-5p agomir en de si-Sox6 groepen (alle P < 0,05). Versus de miR-499-5p agomir + oe-NC groep, waren TUNEL-positieve cellen, Caspase-3 en Caspase-9 proteïnexpressie verhoogd in de miR-499-5p agomir + oe-Sox6 groep (alle P < 0,05).

Herstelde miR-499-5p of Uitgedund Sox6 Vermindert TNF-α, IL-1β en IL-6 Inhoud in BALF en Longweefsel van Sepsis-geïnduceerde Longschade Muizen

Het werd weergegeven door ELISA en Western blot assay resultaten dat (Fig. 4a–g): TNF-α, IL-1β en IL-6 inhoud waren verhoogd in de modelgroep ten opzichte van de sham-groep (alle P < 0,05). Versus de agomir NC en de si-NC groepen, waren TNF-α, IL-1β en IL-6 inhoud verlaagd in de miR-499-5p agomir en de si-Sox6 groepen (alle P < 0,05). Versus de miR-499-5p agomir + oe-NC groep, waren TNF-α, IL-1β en IL-6 inhoud verhoogd in de miR-499-5p agomir + oe-Sox6 groep (alle P < 0,05).

Herstelde miR-499-5p of Uitgedund Sox6 Verhoogt SOD, CAT en GSH-Px Activiteiten alsook Vermindert MDA en MPO Inhoud in Longweefsel van Sepsis-geïnduceerde Longschade Muizen

De resultaten van oxidatieve stress indices detectie presenteerden dat (Fig. 5a–e): versus de sham-groep, SOD, CAT en GSH-Px activiteiten verslechterd terwijl MDA en MPO inhoud verhoogd in de modelgroep (alle P < 0,05). Versus de agomir NC en de si-NC groepen, SOD, CAT en GSH-Px activiteiten verhoogd terwijl MDA en MPO inhoud verlaagd in de miR-499-5p agomir en de si-Sox6 groepen (alle P < 0,05). Versus de miR-499-5p agomir + oe-NC groep, SOD, CAT en GSH-Px activiteiten onderdrukt terwijl MDA en MPO inhoud verhoogd in de miR-499-5p agomir + oe-Sox6 groep (alle P < 0,05).

MiR-499-5p Targette Direct Sox6

We voorspelden via de bio-informatica website TargetScan dat er getargete bindingsplaatsen waren tussen miR-499-5p en SOX4/6. Met RT-qPCR werd gevonden dat vergeleken met de sham-groep, SOX2/4/6 expressie verhoogd was in de modelgroep, en SOX6 expressie het meest verhoogd was (alle P < 0,05); versus de agomir NC groep, toonde de miR-499-5p agomir groep geen verandering in SOX2 expressie terwijl verlaagde SOX4 expressie, meest verlaagde SOX6 (Aanvullend bestand 1: Fig. S1a, b). Daarom selecteerden we uiteindelijk SOX6 als het targetgen van miR-499-5p. De biologische voorspellingswebsite (https://www.targetscan.org/vert_72/) onthulde dat miR-499-5p Sox6 kan targetten (Fig. 6a). Dubbele luciferase reporter gen assay toonde aan dat (Fig. 6b) versus de controle groep, de luciferaseactiviteit duidelijk vernietigd werd na co-transfectie van pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT vector en miR-499-5p agomir in TC-1 cellen (P < 0,05), terwijl de luciferaseactiviteit geen duidelijk verschil toonde na co-transfectie van miR-499-5p agomir met pmiR-RB-REPORT-Sox6 MUT vector of agomir-NC co-getransfecteerd met pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT vector (P > 0,05), wat suggereert dat miR-499-5p direct kan binden aan Sox6 3'UTR WT, en dan de luciferaseactiviteit inhibeert.

Discussie

Sepsis is een kritieke oorzaak van shock en multiple orgaan dysfunctie syndroom, waaronder ALI de meest frequente en significante orgaancomplicatie is. Sepsis-geïnduceerde ALI verschijnt niet alleen het vroegst, met de hoogste incidentie, maar progresseert ook snel, de sterfte is hoog, en er is op dit moment geen effectieve therapie. Een eerdere studie heeft bewerd dat de up-regulatie van miR-218 de secretie van inflammatoire factoren atenueerde en sepsis-geïnduceerde longschade voorkwam. Ook kon het verhogen van de niveaus van miR-146a inflammatie in ALI verminderen en herstel van miR-125b verbetert de overleving van muizen met ALI en onderdrukt inflammatie. Hoewel studies de rol van miRNAs in longschade hebben benadrukt, is het gedetailleerde mechanisme van miR-499-5p in sepsis-geïnduceerde longschade nauwelijks onderzocht, dus we focuseren op miR-499-5p om zijn therapeutisch potentieel in sepsis-geïnduceerde ALI te ontdekken. Ook heeft een studie bewijs geleverd dat verhoogde Sox6 betrokken was bij sepsis-geïnduceerde cardiale apoptose. Inspanningen moeten worden gedaan om sepsis-geïnduceerde longschade dieper te begrijpen. We willen het beschermende effect van miR-499-5p dat Sox6 target op sepsis-geïnduceerde longschade in muizen bespreken.

De W/D ratio van longweefsel werd berekend in onze studie, en de expressie van Sox6 en miR-499-5p in muizen longweefsel beoordeeld. De resultaten toonden aan dat W/D ratio en Sox6 verhoogd waren terwijl miR-499-5p verlaagd was in longweefsel van sepsis-geïnduceerde longschade muizen. Een recente studie heeft voorgesteld dat miR-499-5p expressie in patiënten met milde sepsis, ernstige sepsis en septische schok dramatisch verlaagd was ten opzichte van normale controles. Een andere studie presenteerde dat miR-499-5p expressie duidelijk afnam in niet-klein-cellig longkanker (NSCLC) weefsels en gekoppeld was aan slechte klinische uitkomsten. Het wordt gerapporteerd dat de Sox6 expressie verhoogd was in longkankerweefsels in vergelijking met normale weefsels. Op dezelfde manier heeft een eerdere studie onthuld dat de expressie van Sox6 opmerkelijk verhoogd was in de nierweefsels van muizen met diabetische niersiekte. Onze studie presenteerde ook dat miR-499-5p direct Sox6 targette. Een belangrijke bevinding was dat Sox6 een targetgen is van miR-499. Een andere studie leverde data dat Sox6 een targetgen was van miR-499-5p, en herstel van miR-499-5p de expressie van Sox6 onderdrukte. Echter, de targetrelatie van miR-499-5p en Sox6 in longweefsel van sepsis-geïnduceerde muizen is nog niet onthuld.

Daarnaast werd onthuld dat herstelde miR-499-5p of uitgedund Sox6 longweefselpathologie verlichtte, longschadescore, kollagenvezel en de mate van longfibrose verminderde, en TUNEL-positieve cellen, Caspase-3 en Caspase-9 proteïnexpressie in longweefsel van sepsis-geïnduceerde longschade muizen verminderde. Er is eerder voorgesteld dat up-reguleren van miR-499-5p celdeling onderdrukt en apoptose bevordert in vivo en in vitro van NSCLC. Een andere studie heeft geverifieerd dat herstel van miR-499-5p en uitschakeling van Sox6 hypoxie/heroxigenatie-geïnduceerde celdood atenueerde en Caspase-3 expressie verminderde. Het werd gepresenteerd dat down-reguleren van Sox6 de pathologische letsel verlicht en neuronale apoptose in hippocampusweefsel van Alzheimer ziekte onderdrukt. Bovendien onthulde een studie dat uitschakeling van Sox6 hoog-glucose-geïnduceerde celdood en renale interstitiële fibrose in muizen niermesangiale cellen inhibeerde. Een andere studie toonde aan dat lage expressie van Sox6 de activiteit van Caspase-3 en het percentage apoptotische cellen in muizen P19CL6 cellen verlaagde. Bovendien verifieerden we dat herstelde miR-499-5p of uitgedund Sox6 TNF-α, IL-1β en IL-6 inhoud in BALF en longweefsel van sepsis-geïnduceerde longschade muizen verlaagde. Xia et al. verduidelijkte dat TNF-α en IL-6 niveaus dramatisch verhoogd waren in sepsis-geïnduceerde longschade muizen. Een studie heeft aangetoond dat lage expressie van Sox6 de inflammatoire reactie in hippocampusweefsel van Alzheimer ziekte verlaagt. Een ander resultaat in deze studie impliceerde dat herstelde miR-499-5p of uitgedund Sox6 SOD, CAT en GSH-Px activiteiten verhoogde alsook MDA en MPO inhoud in longweefsel van sepsis-geïnduceerde longschade muizen verminderde. Het werd gepresenteerd dat CLP-geïnduceerde ALI gekenmerkt werd door inflammatie in morfologie, verhoogde W/D ratio, verhoogde proteïneconcentratie in BALF, hogere MPO en MDA inhoud alsook lagere SOD, GSH-Px en CAT activiteiten in longen na CLP. Er werd voorgesteld dat de activiteit van SOD en CAT verlaagd was in sepsis-geïnduceerde ALI in muizen. Verder rapporteerde een studie dat overexprimeerde miR-499-5p en lage expressie van Sox6 het niveau van MDA verlaagde.

Conclusie

Samengevonden vonden we dat hoge expressie van miR-499-5p de apoptose van longweefselcellen kan atenueren en inflammatie van sepsis-geïnduceerde longschade in muizen kan inhiberen via uitschakeling van Sox6, wat belangrijke therapeutische implicaties kan hebben in de behandeling van sepsis-geïnduceerde longschade. Niettemin zijn klinische studies nodig om de effectiviteit voor de behandeling van sepsis-geïnduceerde longschade te detecteren.