Het herstellen van microRNA-499-5p beschermt door sepsis veroorzaakte longletselmuizen via targeting op Sox6

Abstract

Achtergrond

Van microRNA's (miR's) is bekend dat ze deelnemen aan sepsis; daarom willen we het beschermende effect bespreken van miR-499-5p gericht op geslachtsbepalende regio Y-gerelateerde hoge-mobiliteitsgroepbox 6 (Sox6) op sepsis-geïnduceerde longbeschadiging bij muizen.

Methoden

Het door sepsis geïnduceerde longletselmodel werd vastgesteld door cecale ligatie en punctie. De verhouding nat/droog gewicht (W/D), miR-499-5p, Sox6, Caspase-3 en Caspase-9-expressie in longweefsels van muizen werden getest. Longschadescore, collageenvezels en de mate van longfibrose in longweefsel werden bepaald. Verder werd de celapoptose in longweefsel gemeten. De inhoud van ontstekingsfactoren en oxidatieve stress-indices in bronchoalveolaire lavagevloeistof (BALF) en longweefsels werden gedetecteerd via loss- en gain-of-function-assays. De targetingrelatie tussen miR-499-5p en Sox6 is geverifieerd.

Resultaten

W / D-ratio en Sox6 waren verhoogd, terwijl miR-499-5p was verlaagd in longweefsels van door sepsis geïnduceerde longbeschadigingsmuizen. Herstelde miR-499-5p of uitgeputte Sox6 verlichtte longweefselpathologie, verminderde longschadescore, collageenvezels, de mate van longfibrose, TUNEL-positieve cellen, Caspase-3- en Caspase-9-eiwitexpressie en ontstekingsfactoren in BALF en longweefsel evenals oxidatieve stressrespons in longweefsels van door sepsis geïnduceerde longbeschadigingsmuizen. miR-499-5p gericht op Sox6.

Conclusie

Hoge expressie van miR-499-5p kan celapoptose in longweefsels verzwakken en ontsteking van door sepsis geïnduceerde longbeschadigingsmuizen remmen via uitputting van Sox6, en het is een potentiële kandidaat-marker en therapeutisch doelwit voor sepsis-geïnduceerde longbeschadiging.

Inleiding

Sepsis is een systemische ontsteking die ontstaat als gevolg van een infectie en meerdere orgaandisfuncties veroorzaakt, waaronder het acute respiratory distress syndrome [1]. Het wordt gekenmerkt door ernstige hypotensie, progressieve hypoxemie, weefselbeschadiging en ontstekingsveranderingen [2]. De long is het meest kritieke en kwetsbare orgaan bij sepsis, en acuut longletsel (ALI) is een frequente sepsis-geïnduceerde ontstekingsziekte [3]. De ernst van sepsis-geïnduceerde ALI kan worden toegeschreven aan een verminderde doorlaatbaarheid van het alveocapillaire netwerk, wat resulteert in verminderde zuurstoftoevoer [4]. Longcelapoptose is een kritische factor bij longbeschadiging veroorzaakt door sepsis [5]. De pathofysiologie van sepsis-geïnduceerde ALI is onbekend, ondersteunende maatregelen en antibiotica zijn de enige beschikbare behandelingen bij sepsis- en ALI-patiënten, en hun impact op de hoge sterftecijfers door sepsis is beperkt [6].

MicroRNA's (miRNA's) zijn kleine niet-coderende segmenten van endogeen tot expressie gebrachte RNA's, bestaande uit ongeveer 18-24 nucleotiden, die een breed scala aan cellulaire functies kunnen regelen en kunnen binden aan doelgebieden van een bepaald gen om hun expressie te regelen door middel van remming of activering van mRNA vertaling/transcriptie [7]. MiR-499-5p is een recent ontdekt lid van myosine-gecodeerde miRNA's [8]. Een studie heeft gemeld dat de serumspiegels van miR-499-5p kunnen worden gebruikt voor het aangeven van orgaanfalen bij patiënten met sepsis [9]. Een andere studie heeft aangetoond dat miR-499-5p-expressie betrokken is bij sepsis-geïnduceerde cardiale apoptose [10]. De geslachtsbepalende regio Y (SRY)-gerelateerde high-mobility box (HMG) (SOX) -familie wordt gedefinieerd door een reeks genen, waaronder een HMG-klasse DNA-bindend domein, waarvan de sequentie-identiteit met SRY groter is dan 50% [11] . De Sox6-transcriptiefactor maakt deel uit van de SRY-gerelateerde HMG-box-familie en wordt tijdens de progressie in meerdere weefsels tot expressie gebracht, waar het een cruciale rol speelt bij de overgang van prolifererende voorlopercellen naar functioneel rijpe cellen [12]. Er is een studie die meldt dat verhoogde Sox6 betrokken is bij sepsis-geïnduceerde cardiale apoptose [10]. Studies hebben aangetoond dat Sox2-expressie en Sox4-expressie verhoogd zijn bij menselijke kleincellige longkanker [13, 14]. Maar de relatie tussen Sox6 en sepsis-geïnduceerde longbeschadiging moet verder worden onderzocht. Onze studie was dus om het beschermende effect van miR-499-5p op door sepsis geïnduceerde longbeschadigingsmuizen te onderzoeken door zich te richten op Sox6.

Materialen en methoden

Naleving van ethische normen

Alle dierproeven waren in overeenstemming met de Gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health. Het protocol werd toegestaan door de Commissie voor de Ethiek van Dierproeven van het Weihai Gemeentelijk Ziekenhuis, Cheeloo College of Medicine, Shandong University.

Experimenteer dieren

Gezonde mannelijke specifieke pathogeenvrije klasse BABL / c-muizen (6-8 weken oud, 18-22 g gewogen) werden gekocht bij het proefdiercentrum van Shandong University (Shandong, China). De omgeving was ingesteld op 24 ± 2 °C met afwisselend 12 licht-donkercycli. Muizen werden behandeld met vrije toegang tot aseptisch voedsel en steriel water. Experimenten werden gestart na adaptieve voeding gedurende 7 dagen.

Vaststelling van sepsis-geïnduceerd longletselmodel door Cecal Ligation and Puncture (CLP) bij muizen

Muizen werden willekeurig verdeeld in 2 groepen:de schijngroep (n = 8) en de modelgroep. Muizen moesten 12 uur vasten vóór de operatie en vervolgens verdoofd met 1% pentobarbital-natrium (70 mg/kg) door middel van intraperitoneale injectie. Het effect van anesthesie werd waargenomen; de ademhaling en hartslag van muizen werden opgemerkt. De kop en ledematen van muizen werden in rugligging gefixeerd en de buikhuid werd geprepareerd en gedesinfecteerd met jodofoor-katoenballen. Muizen in de modelgroep werden behandeld met een longitudinale incisie (1,0 cm) in het middensegment van de abdominale mediane lijn, de buikholte werd geopend en de blindedarm werd uit de buikholte getrokken om te voorkomen dat mesenteriale vaten werden verwond. Het werd afgebonden met een 1-0 zijden draad op de helft van het uiteinde van de blindedarm en de blindedarm werd doorgeprikt aan de contralaterale rand van het mesenterium met een punctienaald nr. 16. Een juiste hoeveelheid darminhoud werd geëxtrudeerd, de blindedarm werd teruggeplaatst en de incisie werd gehecht. Na het openen van de buikholte werden muizen in de schijngroep alleen uit de blindedarm getrokken en daarna werd de blindedarm teruggeplaatst. Muizen werden na de operatie subcutaan geïnjecteerd met 1 ml 0,9% natriumchloride-oplossing, gescheiden in kooien en routinematig gevoerd.

In vivo transfectie

Vóór het modelleren werden muizen ingedeeld in 7 groepen (n = 8):de modelgroep, de miR-499-5p agomir-groep, de agomir negatieve controle (NC)-groep, de kleine interfererende RNA (si)-Sox6-groep, de si-NC-groep, de miR-499-5p agomir + overexpressie (oe)-Sox6-groep en de miR-499-5p agomir + oe-NC-groep. Een uur voor het modelleren werden muizen behandeld volgens de groepering. Muizen werden verdoofd met 1% pentobarbital-natrium door intraperitoneale injectie, vervolgens gefixeerd op een helling van 45° in rugligging en de tong van muizen werd naar de andere kant van de mond bewogen om ervoor te zorgen dat hun luchtwegen vrij waren. De voorste huid van de nek van muizen werd gedesinfecteerd en afgesneden om de luchtpijp bloot te leggen. Transfectiecomplex (50 L) werd geabsorbeerd door een microsampler (gedruppeld in overeenstemming met de groep, dezelfde hoeveelheid fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) werd in de modelgroep gedruppeld) en vervolgens langzaam in de luchtpijp gedruppeld. Na de transfectie werden de muizen verticaal geroteerd en werd het transfectiecomplex volledig in de longen verdeeld [15]. Tijdens het transfectieproces werden de ademhaling en hartslag van de muizen waargenomen. Als de ademhalings- en hartstilstand optrad, werd de transfectie onmiddellijk gestopt en was de luchtwegen vrij. De transfectie werd voortgezet wanneer de adem en hartslag van muizen stabiel waren. MiR-499-5p agomir en zijn NC evenals de overeenkomstige plasmiden van Sox6 werden gekocht van Shanghai GenePharma Co., Ltd. (Shanghai, China). Na transfectie werden muizen in kooien gescheiden en gedurende 1 dag gevoerd en vervolgens geëuthanaseerd. Muizen werden verdoofd met 1% pentobarbital-natrium door intraperitoneale injectie, in rugligging gefixeerd en vervolgens geëuthanaseerd door abdominale aorta-venesectie. De huid van muizen werd plaatselijk gedesinfecteerd, de borstholte werd geopend, de luchtpijp en de rechter hoofdbronchiaal werden afgebonden, de rechter hoofdbronchus werd losgekoppeld en de rechterlong werd verwijderd. De onderste lob van de rechterlong werd in 10% neutrale formaline geplaatst voor pathologisch onderzoek, de middelste lob werd snel gewogen om het natte gewicht (W) te berekenen en gebakken bij 56℃, en het droge gewicht (D) werd berekend na 72 uur, aldus werd de W/D-verhouding berekend. De rechter bovenkwab werd opgeslagen in vloeibare stikstof voor mRNA- en eiwitdetectie. De linkerlong werd driemaal gewassen met 0,4 ml normale zoutoplossing en ongeveer 1 ml bronchoalveolaire spoelvloeistof (BALF) werd verzameld, verplaatst naar een Eppendorf (EP)-buis van 1,5 ml en op ijs geplaatst. BALF werd gedurende 5 minuten bij 1500 rpm gecentrifugeerd en overgebracht naar een nieuwe EP-buis en vervolgens bewaard bij -80 voor detectie van ontstekingsfactoren.

Daarnaast werden de muizen verdeeld in 3 groepen (n = 10/groep):schijngroep, modelgroep en miR-499-5p agomir-groep (50 μL miR-499-5p agomir werd 1 uur voor de operatie in de luchtpijp gedruppeld). Het overlevingspercentage werd elke 12 uur gecontroleerd, in totaal 7 dagen. De overlevingsstatus van de muizen binnen 7 dagen werd waargenomen en de toxiciteit van miR-499-5p werd bepaald [16].

Hematoxyline-eosine (H&E)-kleuring en letselscore

Longweefsels werden bereid in paraffinecoupes, gekleurd met H&E en bekeken onder een optische microscoop. Longletsel werd gescoord (alveolaire congestie, bloeding, infiltratie of aggregatie van neutrofielen in de alveolaire holte of vaatwand, alveolaire wandverdikking en/of hyalinemembraanvorming) door het pathologische scoresysteem voor longletsel, uitgegeven door de American Thoracic Society. 0 punt duidde op geen of zeer milde laesies; 1 punt duidde op milde laesies; 2 punten duidden op matige laesies; 3 punten wezen op ernstige laesies; 4 punten wezen op zeer ernstige laesies. De totale score van de vier items vertegenwoordigde de totale score van longschade [17].

Massakleuring en score

Van longweefsels werden paraffinecoupes (4 µm) gemaakt en behandeld met Masson-kleuring [18]. Collageenvezels, slijm en kraakbeen waren blauw, cytoplasma, spier, cellulose en glia waren rood en celkernen waren blauwzwart. In het semi-kwantitatieve Ashcroft-scoresysteem [19] duidde 0 punt op een normale long; 1 punt duidde op een milde fibreuze verdikking van de alveolaire of bronchiale wand; 3 punten duidden op een matige verdikking van de alveolaire of bronchiolaire wand zonder schade aan de longstructuur; 5 punten duidden op verergering van fibrose vergezeld van schade aan de longstructuur, vorming van vezelbanden of massa's; 7 punten wezen op ernstige schade aan de longstructuur en grote gebieden van fibrose, die vezelbanden of klonten vormden; 8 punten gaven alle regionale vezelige pakkingen aan.

Terminal Deoxynucleotidyl Transerase-gemedieerde Deoxyuridine Trifosfaat-Biotine Nick End-Labeling (TUNEL) kleuring

De apoptose van longweefsel werd getest door TUNEL-kit (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Duitsland) en waargenomen door een optische microscoop. De apoptotische cellen waren bruin gekleurd in de kern. De apoptose-index gaf het percentage TUNEL-positieve cellen aan [20].

Immunohistochemie

De longweefselcoupes werden van paraffine ontdaan met xyleen, geïncubeerd met 3% waterstofperoxide en geblokkeerd met het geitenserum. Vervolgens werden Caspase-3 (ab13847, 1:500), Caspase-9 (ab32539, 1:250) en SOX6 (ab30455, 1:500, allemaal van Abcam, MA, VS) gebruikt als antilichamen tegen secties met immunokleuring. Een optische microscoop (Leica Microsystems, IL, VS) werd gebruikt om beelden vast te leggen die vervolgens werden geanalyseerd met Image Pro Plus 6.0-software (Media Cybernetics, Rockville, MA, VS) [21].

Kwantitatieve polymerasekettingreactie met omgekeerde transcriptie (RT-qPCR)

OMEGA-kit (Solarbio science &technology Co., Ltd., Beijing, China) werd goedgekeurd voor extractie van totaal RNA in longweefsel en bepaling van RNA-concentratie. Het complementaire DNA (cDNA) werd samengesteld door reverse transcriptie in overeenstemming met RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, VS). De primers zijn ontworpen door Invitrogen (Carlsbad, CA, VS), zoals weergegeven in tabel 1. PCR-reactie werd uitgevoerd in overeenstemming met FastStart Universal SYBR Green Master (Rox) kit (Roche). Het experiment werd kwantitatief geanalyseerd door 2^−△△Ct methode. U6 was de laadcontrole van miR-499-5p en GAPDH was de interne parameter van andere genen [22].

Western Blot-analyse

Totaal eiwit werd verzameld met behulp van lysisbuffer voor radio-immunoprecipitatietest om longweefsels te behandelen. De totale eiwitconcentratie werd gemeten met de bicinchoninezuurmethode. Het eiwitmonster (30 g) werd verwerkt door 10% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese, overgebracht naar het polyvinylideenfluoridemembraan, geblokkeerd met 5% magere melkpoeder en gereageerd met primaire antilichamen Sox6 (ab30455, 1:1000, Abcam), Caspase -3 (9661, 1:1000, Cell Signaling Technology, MA, VS), Caspase-9 (9502, 1:1000, Cell Signaling Technology), tumornecrosefactor-α (TNF-α, ab6671, 1:1000, Abcam ), interleukine-1β (IL-1β, 16806-1-AP, 1:500, Proteintech, VS), IL-6 (ab6672, 1:1000, Abcam) en GAPDH (sc-32233, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA, VS). Vervolgens werd het membraan geïncubeerd met het secundaire antilichaam (1:2000) en ontwikkeld door verbeterde chemiluminescentie [23].

Enzym-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

De niveaus van IL-1β, IL-6 en TNF-α in BALF werden bepaald door ELISA-kit (Boster, Hubei, China). Colorimetrische bepaling werd uitgevoerd bij 450 nm.

Detectie van oxidatieve stress-indices

De longweefsels in vloeibare stikstof werden gewogen en verdund in een bepaalde hoeveelheid zoutoplossing onder een lage temperatuur, vervolgens gehomogeniseerd en gecentrifugeerd bij 4 , 3000 t/min gedurende 20 minuten bij lage temperatuur, en het supernatant werd genomen voor bepaling. De activiteit van myeloperoxidase (MPO) werd getest door MPO-detectiekit (NanJing JianCheng Bioengineering Institute, Nanjing, China), en malondialdehyde (MDA), superoxide-dismutase (SOD), glutathionperoxidase (GSH-Px) en katalase (CAT) werden getest door kits geleverd door JianCheng Bioengineering Institute.

Dual Luciferase Reporter Gene Assay

Sox6 is mogelijk het doelwitgen van miR-499-5p dat werd voorspeld door een biologische website (//www.targetscan.org/vert_72/). Er waren vier bindingsplaatsen tussen miR-499-5p en Sox6 mRNA 3'untranslated region (UTR). De pmiR-RB-REPORT-Sox6 wildtype (WT) en pmiR-RB-REPORT-Sox6 mutant type (MUT) vectoren werden geconstrueerd door Guangzhou RiboBio Co., Ltd. (Guangdong, China), en de overeenkomstige luciferasereporterplasmiden werden gegenereerd. TC-1-cellen (pulmonale epitheelcellen van muizen, 1 × 10⁵ cellen / putje, Shanghai Yiyan biologische technologie Co., Ltd., Shanghai, China) werden gezaaid in een plaat met 24 putjes en getransfecteerd met miR-499-5p agomir of agomir-NC, pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT of pmiR-RB-REPORT-Sox6 MUT via Lipofectamine2000. Dubbel luciferase-reportergen-assaysysteem (Promega, WI, VS) werd toegepast om luciferase-activiteit te meten.

Statistische analyse

Alle gegevens werden geanalyseerd met SPSS 21.0 (IBM Corp. Armonk, NY, VS) software. De meetgegevens werden overgebracht door gemiddelde ± standaarddeviatie. Vergelijkingen tussen twee groepen werden uitgevoerd door t test werden vergelijkingen tussen meerdere groepen beoordeeld door eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA), en Tukey's post hoc-test werd gebruikt voor paarsgewijze vergelijking na ANOVA-analyse. Overlevingscurve werd gemaakt met de Kaplan-Meier-methode. P waarde < 0,05 was indicatief voor een statistisch significant verschil.

Resultaten

W/D-ratio en Sox6 zijn verhoogd, terwijl miR-499-5p is verlaagd in longweefsel van door sepsis veroorzaakte longbeschadigingsmuizen

De toxiciteit van miR-499-5p werd getest op muizen om de overlevingstijd van septische muizen te detecteren. De resultaten toonden aan (Fig. la) dat het overlevingspercentage binnen 7 dagen van muizen in de schijngroep 100% was en dat van septische muizen was verminderd. Het overlevingspercentage van septische muizen na behandeling met miR-499-5p was verbeterd. De resultaten van de W/D-verhouding van longweefsels toonden aan dat (Fig. 1b):versus de schijngroep, de W/D-verhouding was verhoogd in de modelgroep (P < 0.05). In vergelijking met de agomir NC-groep en de si-NC-groep was de W/D-ratio verlaagd in de miR-499-5p agomir-groep en de si-Sox6-groep (beide P < 0.05). W/D-ratio was aanzienlijk verhoogd in de miR-499-5p agomir + oe-Sox6-groep ten opzichte van de miR-499-5p agomir + oe-NC-groep (P < 0.05).

W / D-ratio en Sox6 zijn verhoogd, terwijl miR-499-5p is verlaagd in longweefsels van door sepsis geïnduceerde longbeschadigingsmuizen. een Overlevingscurve van muizen gemaakt door Kaplan-Meier. b W/D-verhouding van longweefsel in elke groep. c Expressie van miR-499-5p in longweefsels van muizen. d Expressie van Sox6-mRNA in longweefsels van muizen. e Eiwitband van Sox6 door western blot-analyse. v Eiwitexpressie van Sox6 in longweefsels van muizen. g Sox6 immunohistochemie van longweefsels van muizen. (a) P <-0,05 versus de schijngroep. (b) P <-0,05 versus de agomir NC-groep. (c) P < 0,05 versus de si-NC-groep. (d) P <-0,05 versus de miR-499-5p agomir + oe-NC-groep. Meetgegevens werden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie en gegevens werden beoordeeld door eenrichtings-ANOVA gevolgd door Tukey's post-hoctest

MiR-499-5p- en Sox6-expressie werden gedetecteerd en we vonden dat (Fig. 1c-f):in tegenstelling tot de schijngroep, miR-499-5p verminderd en Sox6 verhoogd in de modelgroep (beide P ik> < 0.05). Met betrekking tot de agomir NC-groep nam miR-499-5p toe en nam Sox6 af in de miR-499-5p agomir-groep (beide P < 0.05). Vergeleken met de si-NC-groep, Sox6 depressief in de si-Sox6-groep (P < 0.05). In vergelijking met de miR-499-5p agomir + oe-NC-groep, was Sox6 dramatisch verhoogd in de miR-499-5p agomir + oe-Sox6-groep (P < 0.05).

Het eiwitgehalte van Sox6 in longweefsels van septische muizen werd bepaald door immunohistochemie (Fig. 1g). Er werd waargenomen dat de Sox6-eiwitexpressie, vergeleken met de sham-groep, was verhoogd in de modelgroep (P < 0,05); vergeleken met de agomir NC-groep en si-NC-groep, werd lagere Sox6-eiwitexpressie onderzocht in de miR-499-5p agomir-groep en de si-Sox6-groep (beide P < 0,05); ten opzichte van de miR-499-5p agomir + oe-NC-groep, was de Sox6-eiwitexpressie verbeterd in de miR-499-5p agomir + oe-Sox6-groep (P < 0.05).

Hersteld miR-499-5p of uitgeputte Sox6 verlicht longweefselpathologie, vermindert longschadescore, collageenvezels en de mate van longfibrose bij sepsis-geïnduceerde longschade Muizen

HE-kleuringsresultaten lieten zien dat (Fig. 2a):in de schijngroep was de longweefselstructuur intact, het alveolaire septum was in wezen gemanifesteerd zonder oedeem of ontsteking en de alveolaire holte was helder. In het model, agomir NC, si-NC en miR-499-5p agomir + oe-Sox6-groepen, konden exsudatie, oedeem en bloeding worden gezien in de meeste alveolaire holte van longweefsel, en massale infiltratie van ontstekingscellen werd aangetoond in de pulmonale interstitiële. In de miR-499-5p agomir-, si-Sox6- en miR-499-5p agomir + oe-NC-groepen was de laesie van longweefsel verminderd ten opzichte van de modelgroep.

Herstelde miR-499-5p of uitgeputte Sox6 verlicht longweefselpathologie, vermindert de longschadescore, collageenvezels en de mate van longfibrose bij door sepsis geïnduceerde longbeschadigingsmuizen. een Resultaten van HE-kleuring in longweefsels van muizen. b De longweefselbeschadigingsscore van muizen in elke groep. c Masson-kleuring van longweefsel bij muizen. d De longfibrose scores van muizen in elke groep. (a) P <-0,05 versus de schijngroep. (b) P <-0,05 versus de agomir NC-groep. (c) P < 0,05 versus de si-NC-groep. (d) P <-0,05 versus de miR-499-5p agomir + oe-NC-groep. Meetgegevens werden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie en gegevens werden beoordeeld door eenrichtings-ANOVA gevolgd door Tukey's post-hoctest

Muizen longschadescore en semi-kwantitatieve Ashcroft-scoreresultaten toonden aan dat (Fig. 2b,d):in relatie tot de schijngroep, de longschadescore en de mate van longfibrose duidelijk verbeterd waren in de modelgroep (P < 0.05). Vergeleken met de agomir NC-groep en de si-NC-groep waren de longschadescore en de mate van longfibrose verlaagd in de miR-499-5p agomir- en de si-Sox6-groepen (beide P < 0.05). In tegenstelling tot de miR-499-5p agomir + oe-NC-groep, waren de longschadescore en de mate van pulmonaire fibrose duidelijk verhoogd in de miR-499-5p agomir + oe-Sox6-groep (P < 0.05).

De resultaten van Masson-kleuring onthulden dat (figuur 2c):in de schijngroep bevatten muizenlongweefsels een kleine hoeveelheid blauwe collageenvezels. In het model agomir NC, si-NC en miR-499-5p agomir + oe-Sox6 groepen, waren de collageenvezels verhoogd. In de miR-499-5p agomir-groep, si-Sox6-groep en miR-499-5p agomir + oe-NC-groep waren de collageenvezels verminderd ten opzichte van de modelgroep.

Hersteld miR-499-5p of uitgeputte Sox6 vermindert TUNEL-positieve cellen, caspase-3- en caspase-9-eiwitexpressie in longweefsel van door sepsis geïnduceerde longbeschadigingsmuizen

Western-blot-, TUNEL-kleuring en immunohistochemische resultaten gaven aan dat (Fig. 3a-f):de normale kern was blauw en de apoptotische kern was bruin in verschillende tinten. Vergeleken met de sham-groep waren TUNEL-positieve cellen, Caspase-3- en Caspase-9-eiwitexpressie verbeterd in de modelgroep (alle P < 0.05). Vergeleken met de agomir NC- en si-NC-groepen waren TUNEL-positieve cellen, Caspase-3- en Caspase-9-eiwitexpressie verminderd in de miR-499-5p agomir- en de si-Sox6-groepen (alle P < 0.05). Vergeleken met de miR-499-5p agomir + oe-NC-groep waren TUNEL-positieve cellen, Caspase-3 en Caspase-9-eiwitexpressie verhoogd in de miR-499-5p agomir + oe-Sox6-groep (alle P < 0.05).

Herstelde miR-499-5p of uitgeputte Sox6 vermindert TUNEL-positieve cellen, Caspase-3 en Caspase-9-eiwitexpressie in longweefsels van door sepsis geïnduceerde longbeschadigingsmuizen. een TUNEL-positieve cellen in longweefsels van muizen. b Aantal TUNEL-positieve cellen in longweefsels van muizen. c Immunohistochemie van Caspase-3 en Caspase-9 in longweefsel van muizen; d Gemiddelde OD-waarde van Caspase-3 en Caspase-9 in longweefsel van muizen. e Eiwitbanden van Caspase-3 en Caspase-9 in longweefsels van muizen. v Caspase-3 en Caspase-9 eiwitexpressie in longweefsels van muizen in elke groep. (a) P <-0,05 versus de schijngroep. (b) P <-0,05 versus de agomir NC-groep. (c) P < 0,05 versus de si-NC-groep. (d) P <-0,05 versus de miR-499-5p agomir + oe-NC-groep. Meetgegevens werden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie en gegevens werden beoordeeld door eenrichtings-ANOVA gevolgd door Tukey's post-hoctest

Hersteld miR-499-5p of uitgeputte Sox6 verlaagt TNF-α-, IL-1β- en IL-6-gehalte in BALF en longweefsel van sepsis-geïnduceerd longletsel Muizen

Door ELISA- en Western-blot-assayresultaten werd aangetoond dat (Fig. 4a-g):TNF-α, IL-1β en IL-6-gehaltes waren verhoogd in de modelgroep ten opzichte van de schijngroep (alle P ik> < 0.05). Vergeleken met de agomir NC- en de si-NC-groepen, was het TNF-α-, IL-1β- en IL-6-gehalte verlaagd in de miR-499-5p agomir- en de si-Sox6-groepen (alle P < 0.05). Vergeleken met de miR-499-5p agomir + oe-NC-groep, waren de TNF-α-, IL-1β- en IL-6-gehalten verhoogd in de miR-499-5p agomir + oe-Sox6-groep (alle P < 0.05).

Hersteld miR-499-5p of verarmd Sox6 vermindert de TNF-α-, IL-1β- en IL-6-inhoud in BALF- en longweefsels van door sepsis geïnduceerde longbeschadigingsmuizen. een TNF-a-gehalte in BALF van muizen in elke groep. b IL-1β-gehalte in BALF van muizen in elke groep. c IL-6-gehalte in BALF van muizen in elke groep. d eiwitbanden van TNF-α, IL-1β en IL-6 in longweefsels van muizen in elke groep. e eiwitexpressie van TNF-α in longweefsels van muizen in elke groep. v eiwitexpressie van IL-1β in longweefsels van muizen in elke groep. G eiwitexpressie van IL-6 in longweefsels van muizen in elke groep. (a) P <-0,05 versus de schijngroep. (b) P <-0,05 versus de agomir NC-groep. (c) P < 0,05 versus de si-NC-groep. (d) P <-0,05 versus de miR-499-5p agomir + oe-NC-groep. Meetgegevens werden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie en gegevens werden beoordeeld door eenrichtings-ANOVA gevolgd door Tukey's post-hoctest

Hersteld miR-499-5p of uitgeputte Sox6 verhoogt SOD-, CAT- en GSH-Px-activiteiten en vermindert MDA- en MPO-inhoud in longweefsels van sepsis-geïnduceerde Longletsel muizen

De resultaten van detectie van oxidatieve stress-indices toonden dat (Fig. 5a-e):versus de schijngroep, SOD-, CAT- en GSH-Px-activiteiten verminderden terwijl MDA- en MPO-gehalten verhoogden in de modelgroep (alle P < 0.05). Vergeleken met de agomir NC- en de si-NC-groepen, namen de SOD-, CAT- en GSH-Px-activiteiten toe, terwijl het MDA- en MPO-gehalte verminderde in de miR-499-5p agomir en de si-Sox6-groepen (alle P < 0.05). Vergeleken met de miR-499-5p agomir + oe-NC-groep onderdrukten SOD-, CAT- en GSH-Px-activiteiten terwijl de MDA- en MPO-inhoud verbeterde in de miR-499-5p agomir + oe-Sox6-groep (alle P ik> < 0.05).

Hersteld miR-499-5p of uitgeputte Sox6 verhoogt SOD-, CAT- en GSH-Px-activiteiten en vermindert MDA- en MPO-gehalten in longweefsels van door sepsis geïnduceerde longbeschadigingsmuizen. een SOD-activiteit in longweefsels van muizen. b MDA-gehalte in longweefsel van muizen. c GSH-Px-activiteit in longweefsels van muizen. d CAT-activiteit in longweefsels van elke groep muizen. e MPO-gehalte in longweefsels van muizen. (a) P <-0,05 versus de schijngroep. (b) P <-0,05 versus de agomir NC-groep. (c) P < 0,05 versus de si-NC-groep. (d) P <-0,05 versus de miR-499-5p agomir + oe-NC-groep. Meetgegevens werden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie en gegevens werden beoordeeld door eenrichtings-ANOVA gevolgd door Tukey's post-hoctest

miR-499-5p richt zich rechtstreeks op Sox6

We voorspelden via de bioinformatica-website TargetScan dat er gerichte bindingsplaatsen waren tussen miR-499-5p en SOX4/6. Met behulp van RT-qPCR werd gevonden dat in vergelijking met de sham-groep de SOX2/4/6-expressie in de modelgroep toenam en dat de SOX6-expressie het meest toenam (alle P < 0,05); versus de agomir NC-groep, vertoonde de miR-499-5p agomir-groep geen verandering in SOX2-expressie, terwijl verminderde SOX4-expressie, meestal verlaagde SOX6 (aanvullend bestand 1:Fig. S1a, b). Daarom hebben we uiteindelijk SOX6 geselecteerd als het doelgen van miR-499-5p. De biologische voorspellingswebsite (//www.targetscan.org/vert_72/) onthulde dat miR-499-5p zich op Sox6 zou kunnen richten (Fig. 6a). Dubbele luciferase-reportergentest toonde aan dat (Fig. 6b) versus de controlegroep, de luciferase-activiteit duidelijk werd vernietigd nadat pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT-vector en miR-499-5p agomir samen waren getransfecteerd in TC-1-cellen (P <-0,05), terwijl de luciferase-activiteit geen duidelijk verschil vertoonde na miR-499-5p agomir gecotransfecteerd met pmiR-RB-REPORT-Sox6 MUT-vector of agomir-NC gecotransfecteerd met pmiR-RB-REPORT-Sox6 WT-vector ( P> 0,05), wat suggereert dat miR-499-5p direct aan Sox6 3′UTR WT kan binden en vervolgens de luciferase-activiteit kan remmen.

miR-499-5p richt zich rechtstreeks op Sox6. een De doelrelatie tussen miR-499-5p en Sox6 bepaald door biologische website. b De verificatieresultaten van de dubbele luciferase-reportergentest. *P < 0,05 versus de mimische NC-groep. Meetgegevens werden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie en vergelijkingen tussen twee groepen werden uitgevoerd door t testen

Discussie

Sepsis is een kritieke oorzaak van shock en multi-orgaandisfunctiesyndroom, waarbij ALI de meest voorkomende en significante orgaancomplicatie is [24]. Door sepsis geïnduceerde ALI lijkt niet alleen de vroegste, de hoogste incidentie, maar vordert ook snel, het sterftecijfer is hoog en er is momenteel geen effectieve therapie [25]. Een eerdere studie heeft beweerd dat de opregulatie van miR-218 de afscheiding van ontstekingsfactoren verzwakte en sepsis-geïnduceerde longbeschadiging verhinderde [26]. Also, promoting the levels of miR-146a could reduce inflammation in ALI [27] and restoration of miR-125b improves the survival of mice with ALI and suppresses inflammation [28]. Though studies have highlighted the role of miRNAs in lung injury, the detailed mechanism of miR-499-5p in sepsis-induced lung injury has been scarcely investigated, thus we focused on miR-499-5p to discover its therapeutic potential in sepsis-induced ALI. Also, a study has provided a proof that increased Sox6 was involved in sepsis-induced cardiac apoptosis [10]. Efforts should be made to deeply understand sepsis-induced lung injury. We aim to discuss the protective effect of miR-499-5p targeting Sox6 on sepsis-induced lung injury mice.

The W/D ratio of lung tissues was calculated in our study, and the expression of Sox6 and miR-499-5p in mouse lung tissues was assessed. The results showed that W/D ratio and Sox6 were increased while miR-499-5p was decreased in lung tissues of sepsis-induced lung injury mice. A recent study has proposed that miR-499-5p expression in patients with mild sepsis, severe sepsis and septic shock was dramatically decreased relative that in normal controls [9]. Another study has presented that miR-499-5p expression was markedly declined in non-small cell lung cancer (NSCLC) tissues and linked to poor clinical outcomes [29]. It is reported that the Sox6 expression was raised in lung cancer tissues in comparison with normal tissues [30]. Similarly, a previous study has revealed that the expression of Sox6 was remarkably elevated in the kidney tissues of mice with diabetic kidney disease [31]. Our study also presented that miR-499-5p directly targeted to Sox6. An important finding was that Sox6 is a target gene of miR-499 [10]. Another study provided data of that Sox6 was a target gene of miR-499-5p, and restoration of miR-499-5p suppressed the expression of Sox6 [32]. However, the target relation of miR-499-5p and Sox6 in lung tissues of sepsis-induced mice has not been uncovered yet.

In addition, it was revealed that restored miR-499-5p or depleted Sox6 alleviated lung tissues pathology, reduced lung injury score, collagen fibers and the degree of pulmonary fibrosis, and reduced TUNEL positive cells, Caspase-3 and Caspase-9 protein expression in lung tissues of sepsis-induced lung injury mice. It has been previously suggested that up-regulating miR-499-5p suppresses cell proliferation and promotes apoptosis in vivo and in vitro of NSCLC [29]. Another study has verified that restoring miR-499-5p and depleting Sox6 attenuated hypoxia/re-oxygenation-induced cell apoptosis and reduced Caspase-3 expression [32]. It was presented that down-regulating Sox6 alleviates the pathological injury and represses neuronal apoptosis in hippocampal tissues of Alzheimer’s disease [33]. Moreover, a study revealed that depletion of Sox6 inhibited high glucose-induced cell apoptosis and renal interstitial fibrosis in mouse renal mesangial cells [31]. Another study demonstrated that low expression of Sox6 declined the activity of Caspase-3 and the percentage of apoptotic cells in mouse P19CL6 cells [34]. In addition, we verified that restored miR-499-5p or depleted Sox6 declined TNF-α, IL-1β and IL-6 contents in BALF and lung tissues of sepsis-induced lung injury mice. Xia et al. illuminated that TNF-α and IL-6 levels were dramatically raised in sepsis-induced lung injury mice [35]. A study has demonstrated that low expression of Sox6 declines the inflammatory reaction in hippocampal tissues of Alzheimer’s disease [33]. Another result in this study implied that restored miR-499-5p or depleted Sox6 raised SOD, CAT and GSH-Px activities as well as reduced MDA and MPO contents in lung tissues of sepsis-induced lung injury mice. It was presented that CLP-induced ALI was featured by inflammation in morphology, enhanced W/D ratio, raised protein concentration in BALF, higher level of MPO and MDA contents as well as lower level of SOD, GSH-Px and CAT activities in lungs after CLP [36]. It was suggested that the activity of SOD and CAT were decreased in sepsis-induced ALI in mice [37]. Furthermore, a study reported that the overexpressed miR-499-5p and low expressed Sox6 decreased the level of MDA [32].

Conclusion

In conclusion, we found that high expression of miR-499-5p can attenuate the apoptosis of lung tissues cells and inhibit inflammation of sepsis-induced lung injury mice via depleting Sox6, which may have important therapeutic implications in the treatment of sepsis-induced lung injury. Nevertheless, clinical researches are needed to detect the efficacy for the treatment of sepsis-induced lung injury.

Availability of data and material

Not applicable.

Afstandsafhankelijke plasmon-versterkte fluorescentie van submonolaag Rhodamine 6G door gouden nanodeeltjes Nanodeeltjes:een nieuwe benadering om de diagnose en behandeling van kanker te verbeteren

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal