⁶⁴Cu-gelabelde AGuIX nanoprobes: PET-gegeleide radiotherapie en radiosensitisatie in HepG2 tumor-dragende muizen

Samenvatting

Stralingstherapie voor leverkanker wordt beperkt door de lage tolerantie van de lever voor ioniserende straling, wat radiosensitisatoren essentieel maakt om benodigde doses te verlagen. AGuIX nanodeeltjes—ultra-kleine, gadolinium-gebaseerde dragers— zijn uniek geschikt om radio-isotopen of fluoroforen te leveren voor SPECT, PET, fluorescente imaging, en multimodaliteit imaging, terwijl hun hoge atoomnummer ook tumor-sensitiseringseigenschappen verleiht. Het begrijpen van hun biodistributie en farmacokinetiek is daarom cruciaal om tumorretentie tijdens radiotherapie te kwantificeren. In deze studie labelden we AGuIX efficiënt met ⁶⁴Cu via de intrinsische DOTA-chelaat. Biodistributiedata onthulden duidelijke accumulatie van ⁶⁴Cu-AGuIX in HepG2-xenografts in naakte muizen, wat de belofte aantoont als theranostische probe voor beeld-gegeleide radiotherapie in hepato-cellulair carcinoom (HCC). Transmissie-elektronenmicroscopie bevestigde nanodeeltje-opname in HepG2-cellen. Stralingsexperimenten toonden een significante reductie in ¹⁸F-FDG-opname in tumoren bestraald 1 uur na AGuIX-injectie, wat bewijs levert dat AGuIX functioneert als een PET-zichtbare radiosensitisator voor leverkanker-radiotherapie.

Achtergrond

Hepato-cellulair carcinoom (HCC) rangschikt onder de meest voorkwame maligniteiten ter wereld, met 782.500 nieuwe gevallen en 745.500 doden gerapporteerd in 2012, waarvan 70–90% HCC waren. Meeste patiënten presenterende in een gevorderd stadium, wat curatieve opties beperkt tot 20–25% van gevallen. Consequent is radiotherapie een sleutelcomponent van multidisciplinaire HCC-behandeling. Echter, normaal leverweefsel beperkt dose-escalatie, aangezien straling-geïnduceerde leverziekte (RILD) een ernstig risico vormt. Radiosensitisatoren die preferentieel in tumorweefsel accumuleren, kunnen tumorceldood verhogen bij lagere doses, waardoor normaal-weefsel-toxiciteit gemitigeerd wordt.

AGuIX, een nieuwe gadolinium-gebaseerde nanodeeltjes (~5 nm diameter) eerst beschreven in 2013, wordt snel nierlijk gecleard en kan worden gefunctionaliseerd met radioactieve of fluorescente labels voor SPECT, PET, MRI, of fluorescente imaging. De hoge gadolinium-inhoud voorziet AGuIX van tumor-sensitiseringcapaciteiten, gedemonstreerd in vitro over diverse cellijnen met sensitisatie-versterkingsratio's (SER) variërend van 1,1 tot 2,5. Omdat AGuIX lage lever-achtergrond toont maar hoge tumoropname—dankzij het enhanced permeability and retention (EPR) effect—is het een aantrekkelijke kandidaat voor HCC-radiosensitisatie.

Ondanks uitgebreid preklinisch werk op AGuIX voor MRI-gegeleide radiotherapie, blijft de farmacokinetiek onvolledig gekarakteriseerd. Precieze biodistributiedata zijn essentieel om doseringsschema's te optimaliseren en therapeutische vensters te voorspellen. De positron-emitter ⁶⁴Cu (T₁/₂ = 12,4 u) biedt de temporale flexibiliteit om zowel snelle als langzame-clearance agenten te imageren. Hier rapporteren we de eerste in vivo biodistributie en PET-imaging van ⁶⁴Cu-gelabelde AGuIX in HepG2-tumor-dragende naakte muizen, en evalueren de radiosensitisatie-effect met ¹⁸F-FDG PET/CT.

Methoden

Algemene Informatie

AGU-IX nanodeeltjes (sub-5 nm, gedroogd, sferisch) werden verkregen van Nano-H (Lyon, Frankrijk) en gerehydrateerd in steriel DEPC-behandeld water. Humane HCC HepG2-cellen (ATCC) werden gekweekt in MEM aangevuld met 10% FCS. Het ⁶⁴Cu-isotoop werd verkregen van Wisconsin University. Mannelijke BALB/c athymische naakte muizen (6 weken, 16–18 g) werden gebruikt, met alle protocollen goedgekeurd door de Institutionele Dierenzorg- en Gebruikscommissie van de Universiteit van Virginia.

Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM)

AGuIX (0,5 mM) werd geïncubeerd met HepG2-cellen gedurende 1 uur, gevolgd door wassen met 0,1 M PBS en centrifugatie. Celpellets werden vastgelegd in 4% formaldehyde en 1% glutaraldehyde voor TEM-imaging.

⁶⁴Cu Radiolabeling

AGuIX (10 µmol) werd gemengd met 100 µl 0,5 M NH₄OAc (pH 5,5) en 5 min geïncubeerd. 1–3 mCi ⁶⁴CuCl₂ (0,1 N HCl) werd toegevoegd, en de mengsel werd verwarmd bij 37 °C gedurende 1 uur. Het product werd gezuiverd door 3 kDa Amicon-filtratie. Radiochemische zuiverheid werd bevestigd door iTLC (20 mM citroenzuur) en overschreed consistent 98%. Specifieke activiteit varieerde van 3–10 MBq µmol⁻¹, met finale opbrengsten van 50–100 MBq per synthese.

Tumormodellen

HepG2-cellen (5 × 10⁶) werden geresuspendeerd in 0,1 ml HBSS en subcutaneus geïnjecteerd in de rechterflank van elke naakte muis. Tumoren werden tastbaar na ~2 weken.

Biodistributie van ⁶⁴Cu-AGuIX

Tien muizen (5 mannetjes, 4 vrouwtjes) kregen intraperitoneale injecties van ~0,9 MBq ⁶⁴Cu-AGuIX (0,2 ml). Op 9, 21, en 40 uur post-injectie werden muizen geëuthanaseerd, en organen (hart, spier, long, nier, milt, lever, tumor) geoogst, gewogen, en geteld in een γ-teller. Data werden uitgedrukt als % geïnjecteerde dosis per gram (% ID/g).

Micro-PET Imaging

Elke tumor-dragende muis ontving 22,2 MBq ⁶⁴Cu-AGuIX intraperitoneel. PET-scans werden verkregen op 9 u en 21 u onder isofluraan-anesthesie, met een SuperArgus-systeem (Sedecal, Spanje).

Bestraling en ¹⁸F-FDG PET/CT

Twaalf muizen werden verdeeld in drie groepen (n = 4). Baseline PET-imaging werd uitgevoerd 30 min na staartinjectie van 16,4 ± 4,7 MBq ¹⁸F-FDG. Groepen ontvingen ofwel zoutoplossing, 1 mg, of 10 mg AGuIX intraperitoneel 1 uur voor bestraling. Bestraling werd afgeleverd bij 250 kV, 8 mA, 2-mm Al-filter (1,2 Gy min⁻¹) voor een totaal van 6 Gy; het protocol werd de volgende dag herhaald. 24 uur na de tweede dosis werd een tweede ¹⁸F-FDG PET-scan (11,1 ± 1,0 MBq) uitgevoerd. Gestandaardiseerde opnamewaarden (SUVmax) werden gemeten in tumoren en genormaliseerd tot lever SUVave om T/L-ratio's te verkrijgen.

Statistische Analyse

Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd. Data worden gepresenteerd als gemiddelde ± SE. Significantie werd beoordeeld door twee-zijdige ongepaarde t-toetsen of eenrichtings ANOVA (p < 0,05 significant).

Resultaten en Discussie

Terwijl contrast-versterkte MRI AGuIX kan detecteren, biedt PET superieure gevoeligheid en kwantitatieve nauwkeurigheid, wat detectie van nanomolaire concentraties mogelijk maakt die onder MRI's drempel liggen. Hier tonen we aan dat ⁶⁴Cu-gelabelde AGuIX duidelijke tumor-delineatie en verlengde retentie in HepG2-xenografts biedt, wat het gebruik voor PET-gegeleide radiotherapie ondersteunt.

TEM-studie

Incubatie van HepG2-cellen met 0,5 mM AGuIX gedurende 1 uur resulteerde in cytoplasmatische opname, gevisualiseerd bij ×6 500 en ×52 000 vergroting (Figuur 1). De nanodeeltjes behielden een goed-gedispergeerde morfologie, wat cellulaire stabiliteit en compatibiliteit aangeeft.

Radiolabeling

Eén-staps chelatie van ⁶⁴Cu aan AGuIX via de ingebouwde DOTA bereikte >98% radiochemische opbrengst. De resulterende specifieke activiteit was 3–10 MBq µmol⁻¹, met finale productactiviteit van 50–100 MBq per synthese.

Biodistributie Studies

Na intraperitoneale injectie vertoonde ⁶⁴Cu-AGuIX robuuste tumoropname (7,82 ± 1,50, 8,43 ± 6,23, 6,84 ± 1,40 % ID/g op 9, 21, en 40 u, respectievelijk). Niet-doelorganen behielden <1% ID/g, wat snelle clearance bevestigt. Nieropname was notable lager (~5% ID/g) dan gerapporteerd voor intraveneuze toediening, waarschijnlijk door continue peritoneale absorptie. Deze data ondersteunen het gebruik van ⁶⁴Cu-AGuIX als kwantitatieve tool om radiosensitisator-dosering te sturen.

Micro-PET Imaging

Duidelijk tumorsignaal werd waargenomen op 9 u, met nog hogere contrast op 21 u naarmate achtergrondactiviteit daalde (Figuur 3). De data bevestigen de biodistributiebevindingen en demonstreren de praktische haalbaarheid van PET-gegeleide behandelplanning.

¹⁸F-FDG PET/CT Evaluatie van Bestraalde Xenografts

Alle bestraalde muizen vertoonden verminderde tumor ¹⁸F-FDG-opname. SUVmax ratio's (B/A) waren 1,03 ± 0,03 (zoutoplossing), 1,04 ± 0,04 (1 mg AGuIX), en 1,24 ± 0,02 (10 mg AGuIX). De 10 mg groep toonde een statistisch significante toename in tumor-tot-lever opnameverhouding vergeleken met de 1 mg en zoutoplossingsgroepen (p < 0,001), wat dosis-afhankelijke radiosensitisatie bevestigt. Geen verschil werd waargenomen tussen 1 mg AGuIX en zoutoplossing, wat aangeeft dat hogere doses vereist zijn voor klinisch voordeel.

Terwijl nieropname van geradiolabelde AGuIX hoog kan zijn na intraveneuze injectie, vermindert intraperitoneale afgifte deze blootstelling, wat resulteert in duurzame tumorretentie met minimale nierblootstelling. Toekomstige dosimetriestudies zullen orgaan-specifieke stralingstolerantie verduidelijken en klinische vertaling ondersteunen.

Conclusies

We hebben met succes AGuIX geradiolabeld met ⁶⁴Cu, met >98% zuiverheid en substantiële tumoropname die >40 u persisteert in HepG2-xenografts. PET-imaging toont duidelijke tumor-delineatie en biedt een kwantitatieve uitlezing voor behandelplanning. Radiosensitisatiestudies met ¹⁸F-FDG PET bevestigen dat een 10 mg intraperitonele dosis AGuIX het therapeutische effect van 6 Gy radiotherapie in HCC-modellen versterkt. Deze bevindingen valideren AGuIX als een dubbele-functie theranostische nanoprobe voor beeld-gegeleide radiotherapie en benadrukken de noodzaak voor uitgebreide dosimetrie voor klinische toepassing.