Impact van silica-nanodeeltjes op genexpressie en DNA-methylatie in long- en testisweefsels

Samenvatting

Nanotechnologie heeft zich snel ontwikkeld en wordt nu gebruikt in veel avant-garde medische therapeutica. Er is echter toenemende zorgen dat blootstelling aan nanodeeltjes (NPs) verschillende systemische ziekten kan induceren, aangezien epigenetische mechanismen met steeds meer ziekten geassocieerd zijn. De rol van NP-epigenomische modificatie is belangrijk voor ziekte-etiologie. Onze studie had als doel de epigenetische mechanismen van schade in long- en testiscellen te bepalen door cellen te blootstellen aan SiO₂ NPs. We gebruikten mannelijke C57BL/6 muizen om het schadelijke effect van SiO₂ NPs op long- en testiscellen te karakteriseren alsook de resulterende methylatiestoestand op het geprinte Dlk1/Dio3 domeinregio. De A549-cellen blootgesteld aan SiO₂ NPs hadden celdood (apoptose), en mannelijke muizen blootgesteld aan SiO₂ NPs hadden veranderde long- en testisweefsels. De genen in de geprinte domeinen Dlk1/Dio3 regio veranderden in beide weefsels; Dlk1, Rtl1, en Dio3 zijn upregulierd in testis terwijl Dlk1 en Dio3 ook upregulierd zijn in longweefsels. Bisulfit-sequencing PCR van volwassen mannelijke long en testis was grotendeels hypomethylatie, met een paar hypergemethyleerde CpGs. Deze bevindingen wijzen erop dat nanodeeltjes een belangrijke rol spelen in DNA-methylatie van geprinte genen.

Achtergrond

Siliciumdioxide is een oxide van silicium met de chemische formule SiO₂, het meest voorkomend in de natuur als kwarts en in diverse organische omgevingen [1]. Technisch ontworpen nanodeeltjes zijn wijdverspreid in de snelle groei en toepassing van nanotechnologie in high-tech industrieën. Deze specifieke nanodeeltjes worden breed gebruikt in een reeks consumentenproducten waaronder elektronica, kunststofproducten, medische, cosmetische, en coatingmaterialen vanwege hun fysisch-wetenschappelijke eigenschappen zoals grote specifieke oppervlakte, veelvuldige reactieve sites, hoge oppervlakte-energie, onverzadigde chemische bindingen, sterke adsorptiecapaciteit, en een sterke neiging om te interacteren met metalen en organische stoffen, waardoor verontreinigingen en hun transport in de omgeving worden gewijzigd [2]. De aanwezigheid van SiO₂ nanodeeltjes (NPs) in een wijd scala aan consumentenproducten verhoogt de kans dat ze in de omgeving vrijkomen en in contact komen met de menselijke populatie.

Eerdere experimentele studies hebben aangetoond dat een enkele dosis intratracheale instillatie of meervoudige intraperitoneale injecties van een metaal- en metaal-oxide nanodeeltjesoort toxische effecten veroorzaken van cellulaire tot systemische en organisme-niveaus [3]. Behandeling met SiO₂ NPs onderdrukt de groei van borstkankercellijnen door apoptose te verhogen en celmotiliteit te verminderen. Bovendien verstoort blootstelling aan SiO₂ NPs de epidermale groeifactorreceptor (EGFR) aanzienlijk [4]. Toen ratmodellen behandeld werden met drie verschillende groottes van TiO₂ NPs en vergeleken met controles, induceerde bronchoalveolaire lavagevloeistof (BALF) behandeling met grote agglomeraten (> 100 nm) aerosolen een acute inflammatoire reactie, terwijl kleine agglomeraten (< 100 nm) aerosolen significante oxidatieve stressschade en cytotoxiciteit produceerden [5].

De studie van nanodeeltjestoxiciteit op reproductie is een groeiend veld. Eén studie heeft aangetoond dat onder dezelfde behandelingsdosis, Ni NPs hogere reproductietoxiciteit induceerden in C. elegans dan Ni MPs (microdeeltjes). Deze reproductietoxiciteiten waargenomen in C. elegans omvatten verminderde nestgrootte, bevruchte eieren, en spermatide-activatie [6]. Er is groeiend bewijs dat bepaalde milieu-effecten doorgegeven kunnen worden aan nakomelingen via paternale paden zonder veranderingen in het spermageenoom [7, 8]. Paternale informatie bestaat niet alleen in het genoom, maar ook in gerelateerde specifieke epigenetische markers, mRNA-inhoud, en non-coderende RNA.

Oxidatieve stress is een belangrijk mechanisme in nanodeeltjestoxiciteit, wat DNA-schade, inflammatie, proteïndenaturatie, en lipidperoxidatie kan triggeren [9]. Deze biologische effecten worden beïnvloed door de fysico-chemische eigenschappen van nanodeeltjes, inclusief hun grootte, oppervlakte, vorm, oppervlaktechemie, functionalisatie, en oplosbaarheid [10, 11]. Er is groeiend bewijs dat duidelijk aantoont dat blootstelling aan nanodeeltjes epigenetische alteraties in weefsels en cellen kan triggeren zelfs bij lage, niet-cytotoxische doses [12, 13]. Epigenetica is de bestudeer van erfelijke veranderingen in genfunctie die geen veranderingen in de DNA-sequentie omvatten, inclusief methylatie van DNA, gen-imprinting, histonmodificaties, en regulatie door non-coderende RNAs [14]. Dergelijke epigenetische alteraties zijn geassocieerd met de ontwikkeling en progressie van talloze pathologische toestanden en ziekten [15]. Daarom zijn epigenetische effecten een cruciaal deel van patiënt-risico-evaluatiescreening op cellulaire niveau.

Het Dlk1/Dio3 geprinte domein bevat drie bekende differentieel gemethyleerde regio's (DMRs) die paternaal gemethyleerd zijn: intergenische DMR (IG-DMR), maternaal geëxprimeerde 3-DMR (Gtl2-DMR), en Dlk1-DMR [16]. Eerdere studies suggereren dat de IG-DMR de allelische methylatiestatus van de Gtl2 promotor DMR dicteert, wat dan de genexpressie over het hele cluster controleert [17]. Het muisgenoom heeft een groot aantal geprinte genen op het Dlk1/Dio3 domein in het distale gebied van chroomsoom 12. De IG-DMR gelegen tussen geprinte gen Dlk1 en Gtl2 is specifiek gemethyleerd in de mannelijke germline en reguleert de ouderalleel-specifieke expressie van het geprinte gengebied [18]. De IG-DMR methylatiestatus is vastgelegd vóór de geboorte en wordt dus gehandhaafd gedurende een mans leven in de mannelijke germline tijdens mannelijke germceldifferentiatie, wat betekent dat IG-DMR methylatie gehandhaafd wordt in spermatogonia en spermatocyten van volwassen testis.

Ons doel was om de veranderingen in mannelijke germline genexpressie tijdens spermatogenese vóór transcriptionele en translationele silencing te vinden om de paternale invloed op nakomelingen door milieuveranderingen te verklaren. Milieufactoren kunnen spermatische transcriptionele modificaties wijzigen, wat kan leiden tot alteraties in nakomelingsontwikkeling. Om dit onderzoek uit te voeren in ons werk, gebruikten we cellijnen en muizen als modellen voor screening van de toxische effecten van SiO₂ NPs. Voor zover we weten, is dit de eerste studie die de epigenetische mechanismen van de Dlk1/Dio3 geprinte regio's demonstreert die nanodeeltjes schade veroorzaken in zowel long- als testisweefsel.

Methoden

Experimentele Dieren

Dierenbehandeling werd uitgevoerd in overeenstemming met de Richtlijn voor de Zorg en Gebruik van Laboratoriumdieren onder het corresponderende diergebruiksprotocol bij de Nanjing Medische Universiteit. Muizen werden verkregen van Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Alle dieren werden gehuisvest bij 23 °C met een 12-uurs lichtcyclus. Gesteriliseerd water en knaagdierenvoer werden door de muizen naar believen geconsumeerd. Muizenactiviteit en gedrag werden dagelijks gemonitord. Na 2 weken werden muizen geïnjecteerd met nano-grootte SiO₂ 12,5 mg/kg.

Chemicaliën

Nano-grootte SiO₂ (99,5% trace metal basis, deeltjesgrootte 10–20 nm) werden verkregen van Sigma-Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, VS). Nanodeeltjes werden opgelost in RPMI 1640 Medium om een voorraadoplossing te creëren, gedispergeerd door ultrasonische trilling gedurende 20 min, gedilueerd tot passende concentraties, en nogmaals 20 min gedispergeerd.

Karakteristieken van SiO₂ NPs

De grootte en zeta-potentiaal werden vastgelegd met een Malvern Zetasizer Nano ZSP.

RNA-extractie en qRT-PCR

De long- en testis-monsters werden vloeistofstikstof-vriesd en vervolgens opgeslagen bij -80 °C na ongeveer 4 uur. We deden de monsters ontdooien voordat we de monsters extraheerden.

De totale RNA werd geïsoleerd van de monsters met behulp van 1 mL TRIzol Reagent (Invitrogen Life Technologies Co, VS). Het mengsel werd geultrasoniceerd bij 80% vermogen gedurende 5 min, 0,2 mL chlorofoom toegevoegd, en vervolgens gecentrifugeerd bij 12.000g/min bij 4 °C gedurende 15 min. Vervolgens werden drie stappen fenol/chlorofoom zuivering toegevoegd om proteïnen te verwijderen. Vervolgens maakten we UV-absorptie om RNA-inhoud en kwaliteit van elk monster te meten bij 260 en 280 nm. De primer-sequenties van mRNAs worden getoond in Aanvullend bestand 1: Tabel S1 en S2. qRT-PCR werd uitgevoerd volgens de instructies van de fabrikant, zoals eerder beschreven [19]. Real-time PCR werd uitgevoerd met SYBR Green (Vazyme). De PCR-cyclus was als volgt: initiële denaturering bij 95 °C gedurende 30 s, gevolgd door 40 cycli van denaturering bij 95 °C gedurende 15 s, annering bij 60 °C gedurende 15 s, en extensie bij 72 °C gedurende 30 s. Het hoeveelheid doelen genen werd geanalyseerd met de 2^-ΔCt methode na normalisatie met β-actine.

DNA-extractie, Bisulfitbehandeling, en Bisulfit-sequencing PCR

DNA werd geïsoleerd uit testiculair en longweefsel met een DNA-kit (QIAamp DNA Mini Kit; Qiagen. Nr.51304; VS) volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Bisulfitconversie van 500 ng van alle genomische DNA werd bereikt met een kit (EpiTect® Bisulfitkit; Qiagen. Nr. 59104; VS) volgens de aanbevelingen van de fabrikant. Verschillende CpG-methylatie-oligonucleotide werden ontworpen met Methyl Primer Express v1.0 software en de sequenties zijn P1-F 5′-TTGGGTTTTGAGGAGT AGTA-3′, P1-R 5′-ACATCCTATTCCCTAATAAAAATT-3′; P2-F 5′-TATTGGTTTGGTATATATGGATGTA-3′, P2-R 5′-ATAAAACACTTAACTCRTACCRTA-3′; P3-F 5′- TTTGTGTAGTTGTGTTATGGTATATTT-3′, P3-R 5′- ACCCATAACAAACCACAACA-3′; P4-F 5′-TTGTGGTTTGTTATGGGTAAGTT-3′, P4-R 5′-TCAAAACATTCTCCATTAACAAAA-3′.

Elk DNA-monster werd geampliceerd door PCR als volgt: 2,5 μl 10 × PCR-buffer PCR-reactiemengsel met 500 ng het bisulfit-behandelde DNA, 0,5 μl elk van forward en reverse primers, 0,5 μl dNTP-mengsel, 0,5 μl rTaq (500 U, dNTP, Mg²⁺) (Takara Bio, Tokyo, Japan), toevoeging van ddH₂O tot een volume van 25 μl. Na activatie van polymerase bij 94 °C gedurende 10 min, werd het gevolgd door 40 cycli van de volgende reeks: 30 s bij 94 °C, 30 s bij 58 °C, 1 min bij 72 °C, en finale extensie bij 72 °C gedurende 10 min.

Celcultuur en Behandeling

A549-cellen werden gekocht van ATCC (Manassas, VA, VS) en gekweekt in 1640 aangevuld met 10% foetaal kalvesserum (FBS) bij 37 °C en 5% CO₂ in een vochtige incubator. De cellen werden geplateerd op 96-putplaten, geïncludeerd met verschillende concentraties SiO₂ NPs: 62,5, 125, 250, 500, 1000, en 2000 μg/ml gedurende 24 uur.

Cellevensvatbaarheidsassay

Cellulaire levensvatbaarheid werd geëvalueerd door de CCK8-proliferatieassay. Cellen werden geplateerd met een dichtheid van 1,5 × 10⁴ per put in een 96-putplaat en overnacht geïncludeerd. Na blootstelling aan SiO₂ NPs bij verschillende concentraties, werd 100 μl CCK8 aan elke put toegevoegd, en de cellen werden geïncludeerd gedurende 30 min bij 37 °C om CCK8-metabolisme toe te staan. Ten slotte werd absorbantie bepaald bij 450 nm. De cel-remmingspercentages werden berekend en getransformeerd in de IC₅₀ met SPSS 15.0.

Statistische Analyse

Alle berekeningen werden uitgevoerd met SPSS 15.0 software. Vergelijkingen tussen groepen werden gemaakt met ongerelateerde t-toetsen en een Pearson chi-kwadraattoets voor BSP. De gegevens worden gepresenteerd als het gemiddelde ± SD. In alle gevallen werd een waarde van p < 0,05 als statistisch significant beschouwd.

Resultaten

Karakterisering van SiO₂ NPs

We karakteriseerden SiO₂ NPs onder experimentele condities. De gemiddelde hydrodynamische straal en zeta-potentiaal van SiO₂ NPs in cultuurmedium waren 371,77 ± 18,46 nm en 18,83 ± 2,12 mV, respectievelijk (Fig. 1).

Effect van SiO₂ NPs op de A549-cellijnen

Om de toxiciteit van SiO₂ NPs te bepalen, voerden we een proliferatietest uit met A549-cellen, om de IC₅₀ van SiO₂ NPs op A549-cellen te bepalen. Zoals geïllustreerd in Fig. 1c, verminderen SiO₂ NPs de A549-cellevensvatbaarheid op een concentratie-afhankelijke manier. De reductie in cellevensvatbaarheid is significant bij SiO₂ NP-concentratie hoger dan 62,5 μg/ml (p < 0,001). De IC₅₀ 24 u van een chemisch is gedefinieerd als een concentratie die 50% van de cel na 24 u blootstelling beïnvloedt. De IC₅₀ 24 u bepaald voor SiO₂ NPs was 4942 μg/ml.

Effecten van SiO₂ NPs op muur long en testis

We bepaalden of blootstelling aan SiO₂ NPs bij een dosis van 12,5 mg/kg lichaamsgewicht zou leiden tot longmembraanschade en zelfs testisschade in ons muismodel. Zoals getoond in figuren, leidde SiO₂ NP-blootstelling tot verstoorde lamellaire lichamen in histologische coupes van de long (Fig. 2a, b) en een mitochondriale cristae-schade in vergelijking met de controlegroep in testis (Fig. 2c, d). We onderzochten vervolgens de long- en testis-effecten van SiO₂ NPs op de activatie van imprinting op het Dlk1/Dio3 geprinte gebied.

Expressie van de geprinte genen op de muur long en testis

Om de veranderingen in long en testis te illustreren, detecteerden we de geprinte genen in deze weefsels. We kozen de 24 geprinte genen; ze waren Dio3, Ddc, Dlk1, Gpr1, Gtl2, H19, Igf2, Igf2as, Igf2r, Inpp5f, Magel2, Magi2, Mest, Mir296, Mir298, Ndn, Nnat, Peg10, Plagl1, Pwcr1, Rasgrf1, Rtl1, Snrpn, en Snurf. Dertien van deze genen zijn geëxprimeerd in zowel long als testis: Dio3, Dlk1, Gpr1, Gtl2, Igf2r, Igf2, Inpp5f, Peg10, Ndn, Nnat, Rasgrf1, Rtl1, en Snrpn (Fig. 3a, b). De differentieel geëxprimeerde genen van primaire focus waren op het Dlk1/Dio3 geprinte gebied, wat Dlk1, Gtl2, Rtl1, en Dio3 bevat.

Expressie van het Dlk1/Dio3 geprinte gebied

Het geprinte Dlk1/Dio3 gebied bevat drie proteïne-coderende genen (Dlk1, Gtl2, Rtl1, en Dio3) op het overerfde alleel [20] (Fig. 4c). Om de rol van het Dlk1/Dio3 gebied in long- en testisweefselrespons op SiO₂ NP-behandeling te verhelderen, analyseerden we het methylatiepatroon van DMR vergeleken met de controles. Verschillende genen zijn gemethyleerd in de long en de testis. De expressie van de Dlk1 en Dio3 waren upregulierd in zowel de longen als testis, terwijl Rtl1 alleen upregulierd was in testis (Fig. 4a, b).

De methylatie van Dlk1/Dio3 DMR regio's

Om verder te onderzoeken of de expressie van genen verandert in reactie op DNA-methylatie, hebben we de methylatiestatus van dit gebied in de muis long en testis aangepakt. In DNA-methylatieanalyse hebben we de sequenties van de drie secties van CpG-eilanden bepaald. In de testis zijn ze hypomethylatie; echter, in CpG-eiland 1, zijn ze significant hypermethylatie (Fig. 5). In de long is de hele methylatie hetzelfde als in de testis, terwijl CpG-eiland 2 hypermethylatie vertoonde (Fig. 6).

Discussie

Het toenemende gebruik van nanomaterialen heeft zorgen gewekt over potentiële impacten op de menselijke gezondheid en milieu-impacten. Eerdere studies hebben aangetoond dat SiO₂ NPs long- en cardiovasculaire schade kunnen veroorzaken, zoals longinflammatie en myocardiale ischemische schade in oude ratten [21]. Bovendien kunnen nanodeeltjes een effect hebben op germlijnen, aangezien dergelijke cellen gevoeliger leken te zijn voor de toxische effecten van Ag NPs en nadelige effecten vertoonden na blootstelling aan lagere doses. Ag NP-blootstelling verhoogde het aantal afwijkingen waargenomen in rat-spermatische cellen en verminderde de integriteit van zowel de acrosome als plasmamembraan naast het verminderen van mitochondriale activiteit [22]. Ons onderzoek is onderdeel van een reeks studies die een experimenteel platform gebruiken om het potentieel van nanodeeltjes te evalueren om mannelijke organismen en zelfs hun ongeblootte nakomelingen te targeten.

In onze eerdere in vitro-stude rapporteerden we dat korte-termijn blootstelling aan sommige nanodeeltjes resulteert in celdood en aberrante expressie van geprinte genen in TM-4 Sertoli-cellen. Deze bevindingen tonen aan dat abnormale expressie van geprinte genen een onderliggend mechanisme kan zijn voor nanodeeltjes om reproductietoxiciteit te induceren [23]. Bovendien, in onze eerdere in vivo-studie, promoten sommige milieufactoren, zoals endocriene disruptoren, een fenotype of ziektestatus niet alleen in de blootgestelde individu maar ook in opeenvolgende generaties van nakomelingen. Epimutaties in de germline die permanent geprogrammeerd raken, kunnen transmissie van epigenetische transgenerationele fenotypen toestaan [19]. Het doel van deze studie was om veranderingen in de epigenetische toestand door SiO₂ NP-behandeling in een muurmodel te onderzoeken om de mechanistische fundering van mannelijke transgenerationele effecten te leggen.

Epigenetische toestand is een term die gebruikt wordt om chemische modificaties te definiëren die plaatsvinden binnen een genoom zonder de DNA-sequentie te veranderen [24]. Epigenetische mechanismen, inclusief DNA-methylatie, geprinte genen, histonmodificaties, en non-coderende RNA-expressie, kunnen genoomfunctie beïnvloeden in een exogeen milieu [25]. Voor zover we weten, is onze studie de eerste die SiO₂ NPs induceren van long- en testis-toxiciteit op epigenetisch niveau onderzoekt.

We onderzochten eerst de acute toxiciteit van de SiO₂ NPs in A549-cellen, een humane longepitheele cellijn. Echter, onze bevindingen in experimentele muizen onthulden schade in laminaire long type II epitheele cellen en testiculaire mitochondriale kamschade na contact met SiO₂ NPs bij milieuconcentraties [26]. Om het mechanisme van de long- en testispathologie beter te begrijpen, exprimeerden we geprinte genen. Genomische imprinting verwijst naar het dempen van één ouderen alleel in zigoten van gameten afhankelijk van de ouder van herkomst; deze demping gebeurt via epigenetische processen zoals DNA-methylatie en/of histonmodificatie [27]. Eerdere studies hebben aangetoond dat geprinte genexpressie op het Dlk1/Dio3 domein belangrijk is voor foetale groei [28], de timing van de menselijke puberteit [29], en vatbaarheid voor metabole ziekten [30]. Studies hebben gesuggereerd dat de IG-DMR de allelische methylatiestatus van de Gtl2-promotor DMR dicteert, wat dan de genexpressie over het gehele Dlk1/Dio3 gebied controleert [17]. De hoofd functie van dit geprinte controlegebied is om germcel-gedreven DNA-methylatie te overerven als een gametisch signaal, en later om de daaropvolgende alleel-specifieke DNA-methylatiepatronen binnen somatische cellen te handhaven [31]. Onze studie toonde aan dat SiO₂ NPs veranderingen induceren in de expressie van het Dlk1/Dio3 gebied zowel in long- als testisweefsels. In het Dlk1/Dio3 gebied zijn de paternaal geëxprimeerde genen (Dlk1, Rtl1, en Dio3) met name abnormaal vergeleken met de controles na NP-behandeling. Bisulfit-sequencing resultaten tonen verschillende niveaus van hypomethylatie in de long en testis. De methylatiestatus van IG-DMR is doorgaans lager in behandelde weefsels, en deze hypomethylatie kan het mechanisme vertegenwoordigen van differentiele expressie van geprinte genen.

Conclusies

Concluderend, onze resultaten wijzen erop dat SiO₂ NP-blootstelling belangrijke DNA-methylatieveranderingen kan induceren die cellulaire schade triggeren en dat deze veranderingen zeer belangrijk zijn voor de expressie van het Dlk1/Dio3 geprinte gencluster. Belangrijk is dat de veranderingen in DNA-methylatie zowel de long- als testisweefsels beïnvloeden. Deze resultaten spelen een belangrijke rol in ons toekomstige onderzoek dat de epigenomische effecten van de nanodeeltjes overerfd door nakomelingen van blootgestelde modellen en de verduidelijking van de moleculaire mechanismen die dergelijke epigenetische alteraties mediëren.

Afkortingen

BALF:

Bronchoalveolaire lavagevloeistoffen

CCK-8:

Cel-tel-kit-8

DMRs:

Differentieel gemethyleerde regio's

EGFR:

Epidermale groeifactorreceptor

IG-DMR:

Intergenische DMR

MPs:

Microdeeltjes

NPs:

Nanodeeltjes