Zwart fosfor-nanopartikelen stimuleren osteogene differentiatie van ectodermale mesenchymale stamcellen via TG2-upregulatie

Samenvatting

Zwart fosfor-nanopartikelen (BPs) op bio-veilige concentraties activeren transglutaminase 2 (TG2) en reguleren extracellulaire matrix (ECM) componenten op, waardoor de osteogene differentiatie van ectodermale mesenchymale stamcellen (EMSCs) versneld wordt. BPs vertonen uitstekende biocompatibiliteit en biologisch afbreekbaarheid, wat ze veelbelovende additieven maakt voor bot-weefseltechnische scaffolds. In vitro versterkten BPs (2–4 µg mL⁻¹) osteogene markers (RUNX2, ALP, COL-I, OCN, OPN, BMP-2) significant zonder proliferatie te beïnvloeden. TG2-inhibitie ongedaan deze effecten, wat een TG2-afhankelijk mechanisme bevestigt. Deze bevindingen ondersteunen het klinische potentieel van BPs in botregeneratiestrategieën.

Inleiding

Effectief botreparatie vereist materialen die osteoconductief, osteo-inductief en osteo-integratief zijn. Traditionele autogreffes en allogreffes hebben beperkte beschikbaarheid en dragen infectierisico's. Recente vooruitgang in biomaterialen – met name ion-vrijgevende keramische stoffen en bioactieve polymeren – hebben resultaten verbeterd, doch een materiaal dat van nature fosfaat levert en mineralisatie bevordert, blijft ontzaglijk.

Zwart fosfor (BP), een gelaagde tweedimensionale allotroop, heeft aandacht getrokken voor zijn afstemmbare bandkloof, hoge ladingsmobiliteit en snelle biologische afbraak tot onschadelijke fosfaationen. Eerder werk heeft aangetoond dat BP-nanolagen mineralisatie verbeteren door fosfaatdonoren te leveren, maar de cellulaire mechanismen blijven slecht begrepen. Ectodermale mesenchymale stamcellen (EMSCs), afkomstig van volwassen nasale slijmvliezen, bieden een gemakkelijk toegankelijke, non-invasieve bron van multipotente cellen capabel van osteogene differentiatie.

We onderzochten of BPs kunnen fungeren als osteo-inductieve signalen voor EMSCs en de onderliggende pathways gedetailleerd, met focus op TG2 – een sleutelenzym dat ECM-eiwitten crosslinkt en osteoblaastdifferentiatie reguleert.

Materialen en Methodes

Bereiding van zwart fosfor-nanopartikelen

Bulk BP (20 mg) werd gedispergeerd in verzadigde NaOH/NMP, mechanisch gemalen en geultrasondeerd (6 u) in een ijskelder. Na filtratie (100 µm) en hoge-snelheidcentrifugatie (13.000 rpm, 10 min, 4 °C) werd een stabiele BP-suspensie verkregen. Deeltjesgrootte (132 nm) en zeta-potentiaal (−23,7 mV) werden bevestigd door DLS; SEM bevestigde een 100–150 nm velmorfologie. Raman- en XRD-spectra verifieerden BP-fasezuiverheid.

EMSC-isolatie en -kweek

Volwassen Sprague-Dawley-ratten werden geanesthetiseerd, en nasale septale slijmvliezen geoogst. Weefsel werd gedigesteerd (0,25% trypsin, 37 °C, 25 min) en door een 100 µm zeef gegoten. Cellen werden uitgekweekt in DMEM/F12 + 10% FBS, 100 U mL⁻¹ penicilline, 100 µg mL⁻¹ streptomycine. Passage 3-cellen werden voor alle assays gebruikt; immunofluorescentie bevestigde >95% nestine en vimentine-expressie.

Osteogene differentiatie

EMSCs werden gezaaid bij 3.000 cellen cm⁻² en geïnduceerd met osteogeen medium (10% FBS, 0,1 mM dexamethason, 0,2 mM ascorbijnzuur) gedurende 14 dagen (geen β-glycerofosfaat om confounding te vermijden). Alkaline fosfatase (ALP) en Alizarine Rood S (ARS) kleuring beoordeelden respectievelijk vroege en late differentiatie. RT-qPCR meet RUNX2, ALP, COL-I, OCN, OPN, BMP-2 op dagen 7 en 14.

Celviabiliteit en -proliferatie

CCK-8-assays evalueerden BP-toxiciteit (0–512 µg mL⁻¹) na 24 u. Ki-67-immunokleuring kwantificeerde proliferatie. Concentraties ≤32 µg mL⁻¹ waren niet-cytotoxisch; 2 en 4 µg mL⁻¹ werden gekozen voor functionele studies.

Mechanistische studies

Western blotting kwantificeerde TG2, fibronectine (FN), laminine (LN), OCN, OPN, COL-I. TG2-neutraliserende antilichaam (10 µg mL⁻¹) werd toegepast om betrokkenheid van het pathway te bevestigen. Statistische analyse gebruikte Student's t-toets en ANOVA (p < 0,05). Alle experimenten werden in drievoud uitgevoerd.

Resultaten

Karakterisatie van BPs

DLS toonde een smalle grootteverdeling (100–200 nm, piek 132 nm). Zeta-potentiaal van −23,7 mV bevestigde colloïdale stabiliteit. SEM-afbeeldingen kwamen overeen met DLS-data. Raman-pieken bij 362,3, 438,5, 466,9 cm⁻¹ bevestigden BP-structuur; XRD gaf een gemiddelde kristallijngrootte van 102,7 nm aan.

EMSC-fenotype

Immunofluorescentie van nasale slijmvliezen onthulde nestine⁺ cellen in de lamina propria. Passage 3 EMSCs vertoonden fibroblastische morfologie en >95% nestine/vimentine-positiviteit. Onder osteogene inductie toonde ARS-kleuring minerale depositie op dag 28; adipogene inductie leverde Oil Red O-kleuring op dag 21.

Biocompatibiliteit

CCK-8-assays toonden geen significante viabiliteitsverlies tot 32 µg mL⁻¹. Ki-67-kleuring bevestigde onveranderde proliferatie bij 2 en 4 µg mL⁻¹.

Osteogene versterking door BPs

ARS-kleuring onthulde grotere, meer regelmatige calciumnoduli in 2 en 4 µg mL⁻¹ groepen vergeleken met controle (p < 0,05). ALP-activiteit nam toe op dag 7 in BP-behandelde cellen (p > 0,05 tussen 2 vs 4 µg mL⁻¹). RT-qPCR toonde significante upregulatie van RUNX2, ALP, COL-I, OCN, OPN, BMP-2 op dag 14 in BP-groepen (p < 0,01).

TG2-afhankelijk mechanisme

Western blotting demonstreerde een ~2-voudige toename in intracellulaire en extracellulaire TG2 in BP-behandelde cellen. FN- en LN-niveaus waren ook verhoogd. TG2-neutralisatie ongedaan BP-geïnduceerde ARS-depositie, ALP-activiteit en expressie van OCN, OPN, COL-I. Deze data bevestigen dat BPs osteogenese bevorderen door TG2-upregulatie en ECM-hermodellering.

Discussie

Onze studie demonstreert dat BPs veilig geïntegreerd worden in het osteogene milieu van EMSCs bij concentraties onder 32 µg mL⁻¹. De nanopartikelen leveren een snelle bron van fosfaat, wat mineralisatie vergemakkelijkt, terwijl ze tegelijkertijd TG2 activeren – een multifunctioneel enzym dat ECM-eiwitten crosslinkt en integrinesignalisering moduleert. De resulterende ECM-verrijking (FN, LN, COL-I) verbetert waarschijnlijk cel-matrix-interacties, wat de osteogene toewijding verder aandrijft. Deze bevindingen zijn in lijn met eerdere rapporten dat BP-nanomaterialen botreparatie versnellen door fosfaationen te leveren en osteoblaastactiviteit te stimuleren.

Hoewel BP's gevoeligheid voor oxidatie de stabiliteit kan beperken, vermindert de snelle biologische afbraak tot onschadelijke fosfaat de langetermijn-accumulatierisico's. Niettemin zijn in vivo-studies vereist om veiligheid en effectiviteit in diermodellen te bevestigen en scaffold-ontwerpen te optimaliseren voor klinische vertaling.

Conclusie

Zwart fosfor-nanopartikelen, geproduceerd via een schaalbaar malings-ultrasonicatieproces, versterken veilig TG2-gemedieerde osteogene differentiatie van EMSCs in vitro. Deze resultaten ondersteunen hun incorporatie in weefsel-geengineerde botscaffolds. Toekomstig preklinisch werk moet farmacokinetiek, biodistributie en therapeutische resultaten in botdefectmodellen adresseren.

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

Datasets zijn beschikbaar bij de corresponderende auteur op redelijk verzoek.