Hyaluronzuur-gefunctionaliseerde Gd₂O₃ nanopartikels: Verbetering van MRI-geleide radiotherapie voor tumoren

Samenvatting

Onnauwkeurige lokalisatie en intrinsieke radioweerstand van solide tumoren hinderen de klinische implementatie van radiotherapie serieus. In deze studie fabriceren we hyaluronzuur-gefunctionaliseerde gadoliniumoxide nanopartikels (HA-Gd₂O₃ NPs) via een een-pot hydrothermaal proces voor effectieve magnetische resonantie (MR) imaging en radiosensitisatie van tumoren. Dankzij HA-gefunctionaliseerde, vertoonden de als-bereide HA-Gd₂O₃ NPs met een diameter van 105 nm gunstige disperseerbaarheid in water, lage cytotoxiciteit, en uitstekende biocompatibiliteit en gingen ze gemakkelijk de cytoplama van kankercellen binnen via HA-receptorgemediëerde endocytose. Belangrijk, HA-Gd₂O₃ NPs vertoonden hoge longitudinale relaxiviteit (r₁) 6,0 mM⁻¹s⁻¹ als MRI contrastmiddelen en radiosensitisatie-verhoging op een dosis-afhankelijke manier. Deze bevindingen demonstreerden dat als-gesynthetiseerde HA-Gd₂O₃ NPs als bifunctionele theranostische agenten grote potentieel hebben in tumorendiagnose en radiotherapie.

Inleiding

Radiotherapie is uitgebreid toegepast in kanker, wat betrekking heeft op hoge-energie Röntgenstraling en depositie van bestralingsdoses op tumorlocaties door het veroorzaken van vrije-radicaalschade of DNA-schade. Echter, slechte radiosensitiviteit, onnauwkeurigheid van tumorlokalisatie en slechte discriminatie tussen letsels en normale weefsels die bestralingseffecten veroorzaken, beperken de klinische implementatie van radiotherapie. Daarom is het belangrijk om methoden te ontwikkelen voor het verbeteren van tumorradiosensitiviteit terwijl systemische bijwerkingen geminimaliseerd worden. Een combinatie van nanotechnologie en radiotherapie is een goed gevestigde prioriteit voor radiosensitisatie.

In de laatste jaren is nanotechnologie beschouwd als een aantrekkelijke strategie voor kankerdiagnose en therapie. Een van de hoofd-functies van nanopartikels (NPs) is een nauwkeurige tumortargeting gebaseerd op de selectieve accumulatie van NPs in tumorweefsels via passieve targeting, het verhoogde permeabiliteits- en retentie-effect (EPR), actieve targeting, en de verlengde circulatie-tijd. Ons eerdere werk demonstreerde dat doping van koolstof NPs met heteroatomen hun intrinsieke eigenschappen effectief afstemt en gunstige kenmerken introduceert. Interessant, kunnen NPs gebruikt worden als radiosensitisers. Zware metaal (met hoge Z-elementen) NPs (bijv. Au, Bi, Gd) als veelbelovende radiosensitisers kunnen gebruikt worden in radiosensitisatie-therapie vanwege hun hoge Röntgen-foton-opvang-dwarsdoorsnede en Compton-verstrooiingseffect. Wanneer Röntgenstraling interacteert met hoge Z nanopartikels, Auger elektronen, en foto-elektronen, de vrijgave van secundaire elektronen beschadigt kankercellen, wat dosisverhoging tijdens radiotherapie oplevert. Tot nu toe zijn gadolinium-gebaseerde NPs (GdNPs) getoond als effectieve MRI contrastmiddelen (CMs) en differentiëren normaal weefsel van ziek weefsel en letsels op een non-invasieve manier en in real-time. Deze agenten verkorten longitudinale relaxatietijd om longitudinale relaxiviteit r₁ te beïnvloeden, en hun onnauwkeurige targeting resulteert frequent in bijwerkingen. Het is bekend dat hyaluronzuur (HA) een belangrijke ligant is en een medicijnleveringsdrager naar targetplaatsen met HA-receptoren zoals cluster determinant 44 (CD44).

Gebaseerd op de resultaten van eerdere studies, gebruikten we HA als targeterende ligant om Gd₂O₃ NPs te functionaliseren met dubbele functies: effectieve tumor-targeting MRI CMs en radiosensitisers om inherent radioweerstand en onnauwkeurigheid van tumorlokalisatie te overwinnen. Daarnaast vertonen HA-Gd₂O₃ NPs hoge longitudinale relaxiviteit (r₁) als veelbelovende MR imaging agenten met betere MR imaging kwaliteit. Vergeleken met momenteel beschikbare CMs, tonen de als-geproduceerde HA-Gd₂O₃ NPs drie significante voordelen: allereerst, de HA-Gd₂O₃ NPs vertonen gunstige biocompatibiliteit door het gebruik van de natuurlijke extracellulaire matrix als voorlopers. Tweedens, verbetert HA-gefunctionaliseerde aanzienlijk tumor-targeting en vermindert bijwerkingen. Ten slotte, bezitten de HA-Gd₂O₃ NPs bifunctionele capaciteit in diagnose en therapie. Om de effectiviteit te verifiëren en het mechanisme van radiosensitisatie-verhogingen te verkennen, evalueerden we het radiosensitisatie-effect van HA-Gd₂O₃ NPs op tumorcel-leefbaarheid, de celcyclus, en apoptose.

Resultaten en Discussie

Bereiding en Karakterisering van HA-Gd₂O₃ NPs

In deze studie werden HA-Gd₂O₃ NPs met succes bereid met een eenvoudig hydrothermaal proces zoals getoond in Schema 1. Deeltjesgroottes werden geanalyseerd door dynamische lichtverstrooiing, terwijl de morfologische onderzoek werd uitgevoerd door transmissie-elektronenmicroscopie. Zoals getoond in Fig. 1a, vertoonden HA-Gd₂O₃ NPs uniforme dispersie en discrete quasi-sferische vormen zonder duidelijke aggregatie. De gemiddelde diameters van de HA-Gd₂O₃ NPs waren 105 nm. Vergeleken met normale weefsels, was de capillaire endotheliale permeabiliteit van tumorweefsels verhoogd en de endotheliale gat was 100–600 nm. Daarom werden NPs met wenselijke groottes gemakkelijk in tumorweefsels geïmmersd, en ze kunnen de efficiëntie van passieve medicijnlevering dramatisch verhogen.

De fasestructuur van HA-Gd₂O₃ NPs werd onderzocht door XRD met behulp van grafietoxide (GO) poeder als controle. Zoals getoond in Fig. 1d, werd één hoofddiffractiepiek (2θ = 12,04°) en twee kleine pieken (2θ = 29,6°, 42,1°) waargenomen in het HA-Gd₂O₃ NP diffractiepatroon, wat correspondeerde met de karakteristieke pieken van GO (100 vlak) en grafiet (002 vlak), respectievelijk. De hoofdbroodstefafstand van HA-Gd₂O₃ NPs toonde kleinere afstand (0,73 nm berekend door de Bragg-formule) dan de GO-afstand van d₀₀₁ = 0,85 nm, waar de opwaartse verschuiving in de piekpositie toegeschreven kan worden aan de afname in afstand tussen de sp³ lagen. Alle brede diffractiepieken demonstreerden dat HA-Gd₂O₃ NPs een amorfe structuur hadden, wat toegeschreven kan worden aan de hoog ongerangschikte koolstof en afname in sp² (C–C) laagafstand tijdens het koolstofproces. Het resultaat gaf verder aan dat HA-Gd₂O₃ NPs met een slechte kristallijne natuur een heterogene meervoudig gelaagde structuur bezaten, wat consistent was met onze eerdere rapporten over koolstofdots.

Chemische Structuur en Oppervlaktesamenstelling van HA-Gd₂O₃ NPs

Oppervlaktefunctionele groepen en samenstelling van HA-Gd₂O₃ NPs werden onderzocht met behulp van Fourier transformatie infrarood spectrum en Röntgen-foto-elektron-spectroscopie. Zoals getoond in Fig. 2a, toonde het XPS-spectrum vier typische pieken bij 284,0, 400,0, 530,6, en 1188,5 eV, wat aangeeft dat HA-Gd₂O₃ NPs voornamelijk samengesteld waren uit gadolinium, koolstof, zuurstof, en waterstof elementen. Het hoge-resolutie spectrum van Gd₃d (Fig. 2b) onthulde de aanwezigheid van twee sterke pieken bij 1187,5 eV en 1221 eV, corresponderend met een spin-baan splitting van 32 eV, corresponderend respectievelijk met de 3d₅/₂ en 3d₃/₂ energieniveaus van Gd. Deze waarnemingen waren in goede overeenstemming met eerdere rapporten van HA-Gd₂O₃ NPs. Het O (1s) spectrum getoond in Fig. 2c werd gedomineerd door één grote piek gepositioneerd bij 531,4 eV, wat correspondeerde met de binding tussen O²⁻ en Gd³⁺. FTIR-spectroscopie werd uitgevoerd voor zowel naakte als HA-Gd₂O₃ NP monsters (Fig. 2d). Voor de naakte monsters, zoals getoond in Fig. 2a, onthulden de karakteristieke absorptiebanden van v_as O–C–O bij 1580 en 1380 cm⁻¹ de aanwezigheid van een carbonaatgroep. De brede pieken bij 3340 en 2900 cm⁻¹ werden toegeschreven aan de O–H en C–H rektrillingen, respectievelijk, wat correspondeerde met het op het oppervlak geadsorbeerde water. Voor HA-Gd₂O₃ NPs, werden de rektrillingen van COO⁻ bij 1580 en 1380 cm⁻¹ versterkt, wat de introductie van de carboxylgroep van hyaluronzuur aangeeft. Deze resultaten onthulden dat de functionele groepen van HA-Gd₂O₃ NPs voornamelijk talrijke carbonyl-, carboxyl-, en hydroxylgroepen bevatten. De aanwezigheid van deze functionele groepen op het oppervlak voorzagen HA-Gd₂O₃ NPs van uitstekende disperseerbaarheid in water. Belangrijk, de Gd-ion ingesloten in het oppervlak van de NPs kan nuttig zijn voor MR imaging en radiosensitisatie, wat de Gd-ion dramatisch verhinderde om te lekken in de omgevende omgevingen.

Biocompatibiliteit van HA-Gd₂O₃ NPs

Biocompatibiliteit van HA-Gd₂O₃ NPs, als potentiële biomedische agenten, is cruciaal voor hun biomedische toepassing. Allereerst werd de inherente cytotoxiciteit van HA-Gd₂O₃ NPs beoordeeld in HepG2 en VSMC cellen met behulp van de CCK-8 assay. Zoals getoond in Fig. 3a en S. Fig. 1, vertoonden de HA-Gd₂O₃ NPs geen duidelijke cytotoxiciteit tot 3 dagen. Zelfs bij een concentratie van 200 μg/ml na een bloottijd van 24 uur, was de cellleefbaarheid ongeveer 90%. Tweedens werd de hemocompatibiliteit van HA-Gd₂O₃ NPs in vivo geschat met behulp van een hemolyse-assay. Zoals getoond in Fig. 3b, observeerden we hemolyse van rode bloedcellen in water (positieve controle). Integen, werd geen duidelijke hemolyse waargenomen na HA-Gd₂O₃ NP incubatie bij verschillende concentraties van 0 tot 200 μg/ml gedurende 2 uur, wat vergelijkbaar was met de resultaten voor PBS-oplossing (negatieve controle). Vergeleken met de negatieve controle, werd het percentage hemolyse bij verschillende concentraties van HA-Gd₂O₃ NPs iets geëvalueerd op basis van de absorbantie van het supernataant bij 541 nm. De resultaten toonden aan dat de hemolysepercentages van HA-Gd₂O₃ NPs allemaal minder dan 3% waren in de bestudeerde concentratie, wat hun gunstige hemocompatibiliteit verifieerde. Om de potentiële toxiciteit te onderzoeken, werden HA-Gd₂O₃ NPs intraveneus geïnjecteerd in Balb/c muizen (zoals gezien in S. Fig. 2). Na 1 week werden deze muizen geëxecuteerd, en de blaas, nieren, en milt werden geoogst voor pathologische snedeanalyse. Zoals getoond in S. Fig. 2, toonde het resultaat van pathologische sneden aan dat er geen observeerbare letsels of inflammatoire reactie was in de organen van HA-Gd₂O₃ NP-behandelde muizen. Deze resultaten gaven duidelijk aan dat de als-gesynthetiseerde HA-Gd₂O₃ NPs gunstige cytocompatibiliteit en goede hemocompatibiliteit hadden.

MRI Phantom Studie

De longitudinale (T₁) relaxatietijden van HA-Gd₂O₃ NPs werden in vitro onderzocht samen met het commerciële contrastmiddel Magnevist (Gd-DTPA) als controle met behulp van fosfaat-gebufferde zoutoplossing (pH = 7,4, 0,2 M). Met toenemende Gd-concentraties, nam de signaalintensiteit van T₁-gewogen phantomafbeeldingen duidelijk toe, wat aangeeft dat alle monsters MRI-contrastversterking konden genereren op T₁-gewogen sequenties (Fig. 4a). Verder gaven plots van de signaalintensiteit versus inversietijd T₁-relaxatietijden van elk contrastmiddel op specifieke concentraties. Zoals getoond in Fig. 4b, werd de r₁-waarde van HA-Gd₂O₃ NPs gemeten op 6,0 mM⁻¹s⁻¹, wat significant hoger was dan die van Magnevist (3,86 mM⁻¹s⁻¹) onder dezelfde omstandigheden. De verhoogde r₁ kan worden toegeschreven aan de veel hogere hydrodynamische straal en oppervlakte van HA-Gd₂O₃ NPs; daarom werden meer Gd-atomen gedopt in het rooster van NPs toegankelijk voor watermoleculen, wat de longitudinale relaxatie verkorte en de r₁-waarde verhoogde.

MR Imaging In Vivo

Om de potentiële toepassingen in vivo te bepalen, werden de MR imaging prestaties en circulatie-lot van HA-Gd₂O₃ NPs (10 mg/kg) onderzocht met behulp van een MRI-scanner met normale BALB/c muizen als model. Vergeleken met pre-injectie afbeeldingen (Fig. 4c), werden de helderdere regio's van de nieren en blaas zoals aangegeven door de stipellijnen duidelijk waargenomen op 10 min post-injectie, wat aantoont dat HA-Gd₂O₃ NPs gebruikt kunnen worden als CMs die T₁-relaxatie in deze belangrijke organen in vivo versterken. Belangrijk, de contrastversterking van HA-Gd₂O₃ NPs werd gehandhaafd tot 60 min post-injectie, wat veel langer was dan die van Gd-complexe kleine moleculen (halfwaardetijd van ongeveer enkele minuten in kleine dieren), wat aangeeft dat HA-Gd₂O₃ NPs langere retentietijden in vivo bezaten dan het commerciële contrast. Om het MR contrasteffect kwantitatief te analyseren, berekenenden we de signaal-ruis-verhouding (SNR) door fijn te analyseren van regio's van interesse van de MRI-afbeeldingen en berekenenden de waarden van SNR_post/SNR_pre om de relatieve signaalversterking (RSV) weer te geven (Fig. 4d). De RSV-waarden van HA-Gd₂O₃ NPs in de nieren waren 1,35, 1,99, en 1,86. Op dezelfde manier waren de RSV-waarden van HA-Gd₂O₃ NPs in de blaas hoger dan die in de nieren (1,29, 3,59, en 2,26). HA-Gd₂O₃ NPs met grote grootte (meer dan 100 nm) vertoonden lange circulatiemomenten, dan kunnen worden geëlimineerd met galweg-intestinale route volgens eerdere resultaten. Bovendien kan de verlengde circulatiemoment in vivo de passieve targeting in tumoren hebben verhoogd door het EPR-effect te versterken.

Tumor Imaging

HA-Gd₂O₃ NPs met uitstekende MR imaging prestaties en lange circulatiemoment bieden een grote kans voor imaging van tumoren via een EPR-effect. We vestigen dus subcutane levertumormodellen om te onderzoeken of hepatocellulaire carcinomen (HCCs) kunnen worden gedetecteerd door HA-Gd₂O₃ NP-verbeterde MRI. Na intraveneuze injectie van de HA-Gd₂O₃ NPs, observeerden we dat de subcutane tumorregio helderder werd dan het omringende weefsel zoals gezien door zowel coronaal als transversaal scannen (Fig. 5a). De RSV van de subcutane tumor bereikte dramatisch 1,54 en 1,83 met transversale en coronale scanning, respectievelijk, wat de effectieve accumulatie van de HA-Gd₂O₃ NPs in de tumorregio via het EPR-effect aangeeft. Deze bevindingen tonen aan dat HA-Gd₂O₃ NPs hoog gevoelig zijn voor MRI-visualisatie van tumoren. Veel studies toonden aan dat de lange circulatiemoment de efficiëntie van passieve targeting kan bevorderen door lekkende vasculatuur van solide tumoren.

Radiosensitisatie-Verhoging van HA-Gd₂O₃ NPs

De uitstekende prestaties van HA-Gd₂O₃ NPs als een T₁ contrastmiddel deden ons de locatie in de radiosensitisatie van tumoren nauwkeurig bepalen. Allereerst, of dosisverhoging plaatsvond met deze combinatiebehandeling werd onderzocht met behulp van een CCK-8 assay. Zoals afgebeeld in Fig. 6a, had enkele HA-Gd₂O₃ NPs (concentratie 0–200 μg/ml) geen significante invloed op de leefbaarheid van HepG-2, maar Röntgenbestraling (bereik 0–9 Gy) verlaagde HepG-2 cellleefbaarheid tot minder dan 70% bij 9 Gy. Belangrijk, een combinatie van Röntgenbestraling met HA-Gd₂O₃ NPs verlaagde HepG-2 cellleefbaarheid dramatisch tot minder dan 50%, met name bij een concentratie van 200 μg/ml bij 9 Gy. Vervolgens werd een klonogene assay uitgevoerd om de cellleefbaarheid in HepG-2 cellen na een combinatie van Röntgenbestraling en HA-Gd₂O₃ NPs te evalueren. Zoals getoond in Fig. 6b, had enkele HA-Gd₂O₃ NPs geen dramatische invloed op HepG-2 celkolonievorming, maar Röntgenbestraling verlaagde de HepG-2 celkolonievorming tot 46,7%. Echter, behandeling met Röntgenbestraling en HA-Gd₂O₃ NPs remde de celkolonievorming leefbaarheid aanzienlijk tot 29,8%. De corresponderende afbeeldingen verifieerden verder de radiosensitisatie van HA-Gd₂O₃ NPs tegen HepG-2 cellen.

De effectiviteit van radiotherapie in vitro moedigde ons aan om HA-Gd₂O₃ NPs gecombineerd met de bestraling toe te passen om tumorgroei in tumor-dragende muizen te controleren. De volumes van tumoren in de controle- en enkele HA-Gd₂O₃ NP-behandelingen groeiden snel en namen allebei met 180% toe. Vergeleken met de enkele bestralingsbehandelingen 58%, toonden HA-Gd₂O₃ NPs gecombineerd met bestraling efficiënte tumorinhibitie door 38% na 10 dagen van bestraling (Fig. 6d). De tumor werd gefotografeerd, en de gemiddelde tumorvolumes in elke groep toonden aan dat het gemiddelde tumorvolume in groep (a) het hoogst was terwijl dat in groep (d) het laagst was onder alle groepen (Fig. 6e). Deze resultaten onthullen dat de als-bereide HA-Gd₂O₃ NPs veelbelovend zijn voor de inhibitie van tumorgroei onder Röntgenbestraling.

Stroomcytometrie-assay en live/dood kleurassay werden uitgevoerd om het radiosensitisatie-mechanisme in de gecombineerde behandeling van HA-Gd₂O₃ NPs en Röntgenstraling verder te begrijpen. Zoals getoond in Fig. 7a, werd intensive groene fluorescentie zonder rood waargenomen in HepG-2 cellen behandeld met enkele HA-Gd₂O₃ NPs, wat hoge cellleefbaarheid verifieerde. Een kleine hoeveelheid rode fluorescentie werd waargenomen na Röntgenbestralingsbehandelingen, wat een laag niveau van celapoptose aangeeft. Echter, sterke rode fluorescentie werd waargenomen na combinatiebehandeling van HA-Gd₂O₃ NPs (200 μg/ml) en bestraling, wat aantoont dat HA-Gd₂O₃ NPs de door Röntgenbestraling geïnduceerde celapoptose dramatisch kunnen versterken. Het radiosensitisatie-mechanisme van HA-Gd₂O₃ NPs werd verder onderzocht met behulp van stroomcytometrie. Zoals afgebeeld in Fig. 7b, induceerden enkele bestraling en HA-Gd₂O₃ NPs 27,55% en 19,12% van G2/M-fase arrest, respectievelijk. Echter, combinatiebehandeling van HA-Gd₂O₃ NPs en bestraling verhoogde G2/M-fase arrest aanzienlijk, variërend van 30,89 tot 33,27% op een dosis-afhankelijke manier. Tegelijkertijd induceerde de combinatiebehandeling apoptotische celdood van 10,63 tot 22,67%, zoals weerspiegeld door de sub-G1 verhoudingen wanneer enkele HA-Gd₂O₃ NPs en bestraling 3,02% en 13,87% induceerden. Om het mogelijke mechanisme van celdood verder te onderzoeken, werd een Annexin V-EGFP/PI methode uitgevoerd door de stroomcytometrie. Annexin V-EGFP emissiesignaal werd geplot op de x-as, terwijl PI emissiesignaal geplot werd op de y-as (Fig. 8). De hoeveelheden necrose cellen, vroege apoptose cellen, late apoptose cellen, en levende cellen werden bepaald door het percentage van Annexin V⁻/PI⁺ (Q3), Annexin V⁺/PI⁺ (Q2), en Annexin V⁻/PI⁻ (Q4), respectievelijk. Het apoptotische percentage van de cellen in de controle-groep en enkele HA-Gd₂O₃ NP (100 μg/ml) groep waren minder dan 5%, wat resulteerde in subtiele invloed. Vergeleken met enkel-bestraalingsbehandeling groepen (8,8%), steeg de apoptose-ratio van de combinatie van HA-Gd₂O₃ NPs en bestraling met de concentratie toegenemend van 50 tot 200 μg/ml. Vooral, de vroege apoptose-ratio van cellen steeg duidelijk tot 33,2%, en de vroege en late apoptose bereikten 44,3% wanneer de concentratie 200 μg/ml is. In het algemeen had de combinatie van HA-Gd₂O₃ NPs en Röntgenbestraling een synergistisch effect op de celkolonievorming, de cellleefbaarheid op een dosis-afhankelijke manier, en radiosensitisatie-verhogingseffect. Gebaseerd op deze resultaten, kunnen HA-Gd₂O₃ NPs een efficiënte alternatief zijn voor het verbeteren van radiosensitisatie voor radiotherapie.

Conclusies

Concluderend, we hebben een bifunctionele HA-Gd₂O₃ NPs ontwikkeld voor effectieve MR imaging en radiosensitisatie van tumoren in een een-pot hydrothermaal proces. Na coating met HA, vertoonden de als-gesynthetiseerde HA-Gd₂O₃ NPs gunstige disperseerbaarheid in water, uitstekende biocompatibiliteit. De resulterende HA-Gd₂O₃ NPs die de Gd-atomen encapsuleren, vertoonden niet alleen effectief hoge longitudinale relaxiviteit (r₁) voor MRI als een T₁ contrastmiddel, maar versterkten ook de radiosensitiviteit van tumoren door het induceren van celapoptose en het blokkeren van de celcyclus als een radiosensitisator. Dus tonen de nieuwe HA-Gd₂O₃ NPs veelbelovend potentieel voor tumorendiagnose en radiotherapie.

Materialen en Methoden

Materialen

Fluoresceïne diacetaat (FDA) en propidium iodide (PI) werden verkregen van Sigma (New York, NY, VS). GdCl₃·6H₂O, ethyleenglycol (99%) werden gekocht van Hengrui Farmaceutisch Co., Ltd. (Lianyungang, Jiangsu, Volksrepubliek China). De Cel-Tel-Kit-8 (CCK-8) werd gekocht van Dojindo (Kumamoto, Japan). NaH₂PO₄, Na₂HPO₄, en H₂SO₄ werden verkregen van het Guangfu Fijnchemisch Onderzoeksinstituut (Nankai, Tianjin, Volksrepubliek China). Feitelijke runderserum en Dulbecco's minimaal essentieel medium (DMEM) werden gekocht van Invitrogen China Beperkt (Shanghai, Volksrepubliek China). Alle chemicaliën waren van analytische graad en werden zonder verdere zuivering gebruikt.

Synthese van HA-Gd₂O₃ NPs

De HA-Gd₂O₃ NPs werden bereid met een een-pot hydrothermale aanpak als volgt: Allereerst werd 0,1 g HA opgelost in 20 ml water onder vigoreus roeren bij kamertemperatuur overnacht. Vervolgens werden 0,1 g GdCl₃·6H₂O en 0,5 ml NaOH (1 M) respectievelijk toegevoegd. Daarna werd het mengsel nog 5 min geroerd om een homogene heldere oplossing te vormen en overgebracht naar een 50-ml autoklaaf, verzegeld, en hydrothermaal behandeld bij 120 °C gedurende 6 uur. Na afkoelen tot kamertemperatuur van nature, werd de transparante suspensie gefiltreerd met een 0,22-μm membraan om eventuele groot-groottes agglomeratie te verwijderen. De bereide oplossing werd vervolgens gedialyseerd tegen water voor 3 dagen in een dialysezak met 14-kDa molecuulgewichtafsnijpunt. De dialyseoplossing werd verzameld en vriesgedroogd met behulp van een vacuümvriesdroger. De HA-Gd₂O₃ NP poeders werden dus verkregen en bewaard voor verdere karakterisering.

Instrumentatie en Karakterisering

De morfologieën van de HA-Gd₂O₃ NPs werden onderzocht door hoge-resolutie transmissie-elektronenmicroscopie op een JEM-2100 microscoop (JEOL, Tokyo, Japan) onder een versnellingsspanning van 200 kV. De elementaire samenstelling van HA-Gd₂O₃ NPs werd bepaald door XPS-metingen in een MK II foto-elektron spectrometer, met behulp van Al-Ka (1486,6 eV) als de Röntgenbron en Fourier transformatie infrarood (FTIR) spectrometer (Nicolet Nexus 470, GMI, Ramsey, MN, VS). De kristalstructuur van de HA-Gd₂O₃ NPs werd gekarakteriseerd via Röntgendiffractie (XRD) patronen op een Rigaku-D/MAX2500 diffractometer (Rigaku, Japan) uitgerust met Cu Kα (λ = 0,15405 nm) straling bij een scansnelheid van 4°/min in het bereik van 5 tot 80°.

Celluleefbaarheidsassay

De invloed van HA-Gd₂O₃ NPs op cellleefbaarheid werd bestudeerd via Cel-Tel-Kit CCK-8 assay (CCK-8 assay). HepG2 (humane hepatocarcinoom, ATCC Nummer: HB-8065) en VSMCs (vaatsoepelspiercellen) werden gezaaid in een 96-put plaat bij een dichtheid van 3 × 10³ cellen/put en gekweekt bij 37 °C in 5% CO₂ incubator voor 24 uur, toen gebruikmakend van DMEM bevattende verschillende concentraties van HA-Gd₂O₃ NPs (0 μg/ml, 25 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml, en 200 μg/ml) vervangend het groeimedium. Na incubatie voor nog 4 uur, werd 10-μl CCK-8 oplossing aan elke put toegevoegd, cellen werden geïncubeerd voor 4 uur in een donkere plaats. De absorbantie werd gemeten bij 490 nm met behulp van Synergy HT Multi-Mode Microplaat Lezer (Bio Tek, Winooski, VT, VS). Niet-behandelde cellen (in DMEM) werden gebruikt als controle, en de relatieve cellleefbaarheid (gemiddelde SD, n = 5) werd uitgedrukt als Abs_monster/Abs_controle × 100%.

Hemolyse-assay

Kortweg, 19–21 g, 6-weken oude vrouwtjes BALB/c muizen werden vriendelijk bereid door de Dierbeheer Regels van het Ministerie van Gezondheid van de Volksrepubliek China. Drie milliliter bloed wat gestabiliseerd was met heparine natrium werd verkregen door oogballen te verwijderen. Daarna werd het gecentrifugeerd om het supernataant te verwijderen met 1200 toer/min, 15 min volgens de literatuur. Daarna, wassen van het sediment met PBS voor vijf keer om muis rode bloedcellen (MRBCs) te verkrijgen, dan ongeveer 3 ml bloed nemen door oogbal te verwijderen, gestabiliseerd met heparine natrium, gecentrifugeerd (1.200 toer/min, 15 min) om het supernataant te verwijderen volgens de literatuur, gewassen met PBS voor vijf keer om muis rode bloedcellen (MRBCs) te verkrijgen. Tien keer verdunnen met PBS, 0,1 ml MRBCs werden overgebracht in 1,5 ml buisjes voorgevuld met 0,9 ml PBS bevattende verschillende deeltjesconcentraties (50–200 μg/ml) van HA-Gd₂O₃ NPs, 0,9 ml water (als positieve controle), en 0,9 ml PBS (als negatieve controle), respectievelijk. Het mengsel werd geïncubeerd voor 2 uur bij kamertemperatuur na zacht schudden, toen gecentrifugeerd met 12.000 toer/min voor 1 min. Ten slotte, werden foto's van alle monsters genomen en de absorbantie van het supernataant (hemoglobine) gemeten door een UV-2450 UV-Vis spectrophotometer. De hemolysepercentages van verschillende monsters werden berekend door het verschil in absorbantie tussen het monster, de positieve, en negatieve controle bij 541 nm te delen.

MR Phantom Studie In Vitro en In Vivo

In vitro en in vivo MR-afbeeldingen werden verkregen op 3 Tesla MRI-scanner (Magnetom Trio Tim, Siemens, Duitsland). Om de T₁ phantomafbeeldingen in vitro te bestuderen, werd de oplossing van HA-Gd₂O₃ NPs met verschillende concentraties variërend van 0 tot 16 mM toegevoegd aan een 96-put kweekplaat, gebruikmakend van Magnevist (commercieel MR contrastmiddel, Gd-DTPA) als controle. Voor MR imaging in vivo, kozen we de normale BALB/c muizen als model (n = 4). Dierproeven voldeden strikt aan de Dierbeheer Regels van het Ministerie van Gezondheid van de Volksrepubliek China. Tien milligram per kilogram HA-Gd₂O₃ NPs gefilterd door gesteriliseerde membraanfilters (poriegrootte 0,22 μm) werden intraveneuze geïnjecteerd in de dieren, toen onmiddellijk onderzocht met een MRI-scanner. Deze monsters voor MR imaging in vitro en dieren in vivo werden geïmageerd met de volgende parameters: TR/TE = 300/10 ms, 256 × 256 matrices, sneden = 5, dikte = 2 mm, gemiddeldes = 2, FOV = 80 × 80.

Radiosensitisatie-effect In Vitro

CCK-8 assay werd gebruikt om radiosensitisatie-activiteit van HA-Gd₂O₃ NPs in vitro te evalueren. Cellen werden gezaaid in vijf 96-put platen bij een dichtheid van 3 × 10³ cellen/put, en elke plaat werd behandeld op dezelfde voorwaarde: gekweekt bij 37 °C in 5% CO₂ incubator voor 24 uur, toen gebruikmakend van DMEM bevattende verschillende concentraties van HA-Gd₂O₃ NPs (0 μg/ml, 12,5 μg/ml, 25 μg/ml, 50 μg/ml, 100 μg/ml, en 200 μg/ml) vervangend het groeimedium. Na incubatie voor 4 uur, werden vijf platen bestraald bij verschillende Röntgendoses (0 Gy, 3 Gy, 6 Gy, en 9 Gy), 300 cGy/min, respectievelijk. Na bestraling, werden alle platen geïncubeerd voor 4 uur, toen de absorbantie gemeten onder dezelfde parameters.

Klonogene overlevingsassay werd ook uitgevoerd om het radiosensitisatie-effect in vitro te bestuderen. HepG2 cellen werden gezaaid in zes-put platen bij 4,0 × 10⁴ cellen/put en toegestaan te groeien voor 16 uur. De cellen werden geïncubeerd met HA-Gd₂O₃ NPs gedund in celkweekmedium voor 6 uur. De cellen werden vervolgens bestraald bij 6 Gy met behulp van een klinische lineaire versnellers (Oncor, Siemens, Duitsland) met 6 MeV bestraling met een 10 cm × 10 cm bestralingsveld bij een bron-tot-huid afstand (SSD) van 100 cm om de gehele cellen te bedekken. Toen werden deze bestraalde cellen toegestaan te groeien voor 14 dagen, vastgezet met 4% paraformaldehyd bij kamertemperatuur voor 40 min, gekleurd met 1% kristalviolett na wassen van de cellen.

Live-Dood Kleurassay en Stroomcytometrie

Om het radiosensitisatie-effect van HA-Gd₂O₃ NPs te bestuderen, werden HepG2 cellen gezaaid in zes-put platen bij een dichtheid van 4,0 × 10⁴ cellen/put en toegestaan te groeien voor 12 uur en zes groepen ingesteld (controle, HA-Gd₂O₃ NPs, bestraling, bestraling + 50 μg/ml HA-Gd₂O₃ NPs, bestraling + 100 μg/ml HA-Gd₂O₃ NPs en bestraling + 200 μg/ml HA-Gd₂O₃ NPs). Toen cellen gegroeid waren tot 80% in platen, had de eerste groep geen behandeling, de tweede groep werd geïncubeerd met 100 μg/ml HA-Gd₂O₃ NPs voor 24 uur, de derde groep was alleen bestraald, en de vierde groep tot de zesde groep werden bestraald en geïncubeerd met verschillende concentraties van HA-Gd₂O₃ NPs (50, 100, en 200 μg/ml) voor 24 uur, respectievelijk. Daarna werden FDA en PI werklopende buffer toegevoegd voor celkleuring. De fluorescentie van gekleurde cellen werd waargenomen onder een fluorescentiemicroscoop (×20), en levende cellen toonden groene kleur en dode cellen vertoonden rode kleur. Verder werden cellen door verschillende behandelingen driemaal gewassen met PBS, verteerd, verzameld, en gecentrifugeerd met een snelheid van 2000 toer/min voor 5 min, toen vastgezet met 70% ethanol bij −20 °C overnacht gevolgd door PI-kleuring. DNA-fragmentatie werd gekwantificeerd door de fluorescentie-intensiteit van PI op een stroomcytometer (BD, Accuri, C6BD, Accuri, C6), geanalyseerd door software (FLOWJO 7. 6. 2) om de celcyclusdistributie duidelijk te maken.

Radiosensitisatie-effect In Vivo

Vrouwtjes BALB/c muizen met lichaamsgewichten van 19–21 g en leeftijden van 6 weken werden verkregen van het Yangzhou Universiteit Laboratorium Dierencentrum onder standaard omstandigheden. Dierproeven waren compliant met de Dierbeheer Regels van het Ministerie van Gezondheid van de Volksrepubliek China. Een subcutane tumormodel werd ingesteld als de volgende procedures: Allereerst werden 1 × 10⁶ HepS cellen geïnculeerd in muizen intraperitoneaal, en de ascites werden verzameld na 5 dagen. Daarna werden deze ascites in subcutane geïnjecteerd. Toen de tumorengroottes ongeveer 100 mm³ bereikten, werden subcutane tumormodellen ingesteld en toegepast op de volgende experimenten.

Acht muizen met subcutane tumoren per groep werden behandeld met bestraling bij 3 Gy per fractie tot een totale dosis van 9 Gy binnen 7 dagen. De radiotherapie werd uitgevoerd na 3 uur intraveneuze injectie van HA-Gd₂O₃ NPs (10 mg/kg), op een Siemens Primus klinische lineaire versnellers (6 MeV) met een zelfgemaakt apparaat om de gehele tumor te bedekken. Deze muizen werden geanesthetiseerd door 1% pentobarbitaal (50 mg/kg) om onbewegelijkheid tijdens bestraling te verzekeren. Het volume werd gemeten en vastgelegd elke dag, bepaald door schuifmaatmeting, en berekend door de formules: V = 0,5 × a × b², waar V (mm³) het volume van de tumor is, en a (mm) en b (mm) de tumorlengte en tumorbreedte zijn, respectievelijk. Relatieve tumorvolumes werden genormaliseerd tot hun initiële groottes. Elke groep werd uitgevoerd op acht muizen, waarin statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van Student's twee-zijdige t-toets (*p < 0,05, **p < 0,001).

Beschikbaarheid van Data en Materialen

De datasets die de resultaten van dit artikel ondersteunen, zijn opgenomen in het artikel.