Hyaluronzuur-gefunctionaliseerde gadoliniumoxide-nanodeeltjes voor magnetische resonantiebeeldgestuurde radiotherapie van tumoren
Abstract
Onnauwkeurige lokalisatie en intrinsieke radioresistentie van solide tumoren belemmerden de klinische implementatie van radiotherapie ernstig. In deze studie hebben we hyaluronzuur-gefunctionaliseerde gadoliniumoxide-nanodeeltjes (HA-Gd2 O3 NP's) via een hydrothermisch proces in één pot voor effectieve magnetische resonantie (MR) beeldvorming en radiosensibilisatie van tumoren. Op grond van HA-functionalisatie is de as-bereide HA-Gd2 O3 NP's met een diameter van 105 nm vertoonden een gunstige dispergeerbaarheid in water, lage cytotoxiciteit en uitstekende biocompatibiliteit en gingen gemakkelijk het cytoplasma van kankercellen binnen door HA-receptor-gemedieerde endocytose. Belangrijk is dat HA-Gd2 O3 NP's vertoonden een hoge longitudinale relaxiviteit (r 1 ) 6.0 mM −1 S −1 als MRI-contrastmiddelen en verbetering van de radiosensibilisatie op een dosisafhankelijke manier. Deze vondsten toonden aan dat zoals gesynthetiseerd HA-Gd2 O3 NP's als bifunctionele theranostische middelen hebben een groot potentieel bij de diagnose van tumoren en radiotherapie.
Inleiding
Radiotherapie is uitgebreid toegepast bij kanker, wat gepaard gaat met hoogenergetische röntgenstraling en afzetting van bestralingsdoses op tumorplaatsen door schade door vrije radicalen of DNA-schade te veroorzaken [1,2,3,4]. Een slechte radiogevoeligheid, onnauwkeurigheid van tumorlokalisatie en slecht onderscheid tussen laesies en normale weefsels die bijwerkingen van bestraling veroorzaken, beperken echter de klinische implementatie van radiotherapie [5]. Daarom is het belangrijk om methoden te ontwikkelen voor het verbeteren van de radiogevoeligheid van tumoren en het minimaliseren van systemische bijwerkingen. Een combinatie van nanotechnologie en radiotherapie is een gevestigde prioriteit voor radiosensibilisatie.
De afgelopen jaren wordt nanotechnologie beschouwd als een aantrekkelijke strategie voor de diagnose en therapie van kanker [6,7,8,9,10,11]. Een van de belangrijkste functies van nanodeeltjes (NP's) is een nauwkeurige tumortargeting op basis van de selectieve accumulatie van NP's in tumorweefsels via passieve targeting, het verbeterde permeabiliteit en retentie (EPR) effect, actieve targeting en de verlengde circulatietijd [12, 13,14]. Ons eerdere werk toonde aan dat het doteren van koolstof-NP's met heteroatomen hun intrinsieke eigenschappen effectief afstemt en gunstige eigenschappen introduceert [15,16,17]. Interessant is dat NP's kunnen worden gebruikt als radiosensitizers [18]. Zware metalen (met hoge Z-elementen) NP's (bijv. Au, Bi, Gd) als veelbelovende radiosensitizers kunnen worden gebruikt in radiosensibiliserende therapie vanwege hun hoge röntgenfotonvangstdwarsdoorsnede en Compton-verstrooiingseffect [19]. Wanneer röntgenstralen interageren met hoge Z-nanodeeltjes, Auger-elektronen en foto-elektronen, verwondt de afgifte van secundaire elektronen kankercellen, wat zorgt voor dosisverhoging tijdens bestralingstherapie [20]. Tot op heden is aangetoond dat op gadolinium gebaseerde NP's (GdNP's) effectieve MRI-contrastmiddelen (CA's) zijn [21, 22] en dat ze normaal weefsel onderscheiden van ziek weefsel en laesies op een niet-invasieve manier en in realtime. Deze middelen verkorten de longitudinale relaxatietijd om de longitudinale relaxiviteit te beïnvloeden r 1 [23], en hun onnauwkeurige targeting resulteert vaak in een bijwerking. Het is algemeen bekend dat hyaluronzuur (HA) een belangrijke ligand is en een drager voor medicijnafgifte om zich te richten op plaatsen met HA-receptoren zoals clusterdeterminant 44 (CD44) [24,25,26].
Op basis van de resultaten van eerdere onderzoeken hebben we HA gebruikt als een targeting-ligand om Gd2 te functionaliseren. O3 NP's met dubbele functies:effectieve tumorgerichte MRI-CA's en radiosensitizers om inherente radioresistentie en de onnauwkeurigheid van tumorlokalisatie te overwinnen. Bovendien, HA-Gd2 O3 NP's vertonen een hoge longitudinale relaxiviteit (r 1 ) als veelbelovende MR-beeldvormingsmiddelen met een betere MR-beeldvormingskwaliteit. Vergeleken met de momenteel beschikbare CA's [27, 28], is de resulterende HA-Gd2 O3 NP's vertonen drie belangrijke voordelen:ten eerste, de HA-Gd2 O3 NP's vertonen een gunstige biocompatibiliteit door het gebruik van de natuurlijke extracellulaire matrix als voorlopers. Ten tweede verbetert HA-functionalisatie de tumortargeting aanzienlijk en vermindert het de bijwerkingen. Eindelijk, de HA-Gd2 O3 NP's hebben een bifunctioneel vermogen bij diagnose en therapie. Om de effectiviteit te verifiëren en het mechanisme van radiosensibilisatieverbeteringen te onderzoeken, hebben we het radiosensibiliserende effect van HA-Gd2 geëvalueerd. O3 NP's over de levensvatbaarheid van tumorcellen, de celcyclus en apoptose.
Resultaten en discussie
Voorbereiding en karakterisering van HA-Gd2 O3 NP's
In deze studie, HA-Gd2 O3 NP's werden met succes bereid met behulp van een eenvoudig hydrothermisch proces zoals weergegeven in Schema 1. Deeltjesgroottes werden geanalyseerd door dynamische lichtverstrooiing, terwijl het morfologische onderzoek werd uitgevoerd door transmissie-elektronenmicroscopie. Zoals getoond in Fig. 1a, HA-Gd2 O3 NP's vertoonden uniforme dispersie en discrete quasi-bolvormige vormen zonder duidelijke aggregatie. De gemiddelde diameters van de HA-Gd2 O3 NP's waren 105 nm. In vergelijking met normale weefsels was de capillaire endotheliale permeabiliteit van tumorweefsels verhoogd en was de endotheliale opening 100-600 nm [29]. Daarom werden NP's met gewenste afmetingen gemakkelijk ondergedompeld in tumorweefsels, en ze kunnen de efficiëntie van passieve gerichte medicijnafgifte dramatisch verhogen.
Schematische synthese van HA-Gd2 O3 NP's uit de hydrothermische methode (A) en de volgende biomedische toepassingen (B)
Karakterisering van HA-Gd2 O3 NP's. Laag (een ) en hoog (b ) vergroting TEM beelden. De diameterverdeling (c ) en XRD-patronen (d ) van HA-Gd2 O3 NP's
De fasestructuur van HA-Gd2 O3 NP's werden onderzocht door XRD met behulp van grafietoxide (GO) -kracht als controle. Zoals getoond in Fig. 1d, één hoofddiffractiepiek (2θ =12,04°) en twee kleine pieken (2θ =29,6°, 42.1°) werden waargenomen in de HA-Gd2 O3 NP-diffractiepatroon, dat overeenkwam met de karakteristieke pieken van respectievelijk GO (100-vlak) en grafiet (002-vlak). De belangrijkste roosterafstand van HA-Gd2 O3 NP's vertoonden een kleinere afstand (0.73 nm berekend met de Bragg-formule) dan de GO-afstand van d 001 =0,85 nm, waarbij de opwaartse verschuiving in de piekpositie kan worden toegeschreven aan de afname van de afstand tussen de sp 3 lagen. Alle brede diffractiepieken toonden aan dat HA-Gd2 O3 NP's hadden een amorfe structuur, wat kan worden toegeschreven aan de zeer ongeordende koolstof en afname in sp 2 (C-C) laagafstand tijdens het carbonisatieproces. Het resultaat wees verder op HA-Gd2 O3 NP's met een slechte kristallijne aard hadden een heterogene meerlagige structuur, wat consistent was met onze eerdere rapporten met betrekking tot koolstofpunten [30, 31].
Chemische structuur en oppervlaktesamenstelling van HA-Gd2 O3 NP's
Functionele oppervlaktegroepen en samenstelling van HA-Gd2 O3 NP's werden onderzocht met behulp van Fourier-transformatie-infraroodspectrum en röntgenfoto-elektronspectroscopie. Zoals getoond in Fig. 2a, vertoonde het XPS-spectrum vier typische pieken bij 284,0, 400,0, 530,6 en 1188,5 eV, wat aangeeft dat HA-Gd2 O3 NP's waren voornamelijk samengesteld uit gadolinium-, koolstof-, zuurstof- en waterstofelementen. Het spectrum met hoge resolutie van Gd3d (Fig. 2b) onthulde de aanwezigheid van twee sterke pieken bij 1187,5 eV en 1221 eV, overeenkomend met een spin-baansplitsing van 32 eV, respectievelijk overeenkomend met de 3d 5/2 en 3d 3/2 energieniveaus van Gd. Deze waarnemingen kwamen goed overeen met eerdere rapporten van HA-Gd2 O3 NP's. De O (1en ) spectrum getoond in Fig. 2c werd gedomineerd door één grote piek gepositioneerd op 531,4 eV, wat overeenkwam met de binding tussen O 2− en Gd 3+ . FITR-spectroscopie werd uitgevoerd voor zowel naakt als HA-Gd2 O3 NP-monsters (figuur 2d). Voor de naakte monsters, zoals weergegeven in Fig. 2a, zijn de karakteristieke absorptiebanden van v als O–C–O op 1580 en 1380 cm −1 onthulde de aanwezigheid van een carbonaatgroep. De brede pieken van 3340 en 2900 cm −1 werden toegeschreven aan respectievelijk de O–H- en C–H-rektrillingen, die overeenkwamen met het aan het oppervlak geadsorbeerde water. Voor HA-Gd2 O3 NP's, de strekkende trillingen van COO − op 1580 en 1380 cm −1 waren versterkt, wat wijst op de introductie van de carboxylgroep van hyaluronzuur. Deze resultaten lieten zien dat de functionele groepen van HA-Gd2 O3 NP's bevatten voornamelijk bepaalde talrijke carbonyl-, carboxylaat- en hydroxylgroepen. De aanwezigheid van deze functionele groepen op het oppervlak schonk HA-Gd2 O3 NP's met uitstekende dispergeerbaarheid in water. Belangrijk is dat het Gd-ion dat in het oppervlak van de NP's is ingebed, nuttig kan zijn voor MR-beeldvorming en radiosensibilisatie, wat dramatisch verhinderde dat het Gd-ion in de omringende omgevingen lekte.
De chemische structuur en samenstelling van de HA-Gd2 O3 NP's. een Het full-scan XPS-spectrum van HA-Gd2 O3 NP's. b Gd3d spectrum. c O1S spectrum. d Het FTIR-spectrum van HA-Gd2 O3 NP's
Biocompatibiliteit van HA-Gd2 O3 NP's
Biocompatibiliteit van HA-Gd2 O3 NP's, als potentiële biomedische agentia, zijn van cruciaal belang voor hun biomedische toepassing. Ten eerste, de inherente cytotoxiciteit van HA-Gd2 O3 NP's werden beoordeeld in HepG2- en VSMC-cellen met behulp van de CCK-8-assay. Zoals getoond in Fig. 3a en S. Fig. 1, de HA-Gd2 O3 NP's vertoonden geen duidelijke cytotoxiciteit tot 3 dagen. Zelfs bij een concentratie van 200 g/ml na een blootstellingstijd van 24 u was de levensvatbaarheid van de cellen ongeveer 90%. Ten tweede, de hemocompatibiliteit van HA-Gd2 O3 NP's in vivo werden geschat met behulp van een hemolyse-assay. Zoals getoond in Fig. 3b, hebben we hemolyse van rode bloedcellen in het water waargenomen (positieve controle). Daarentegen werd geen duidelijke hemolyse waargenomen na HA-Gd2 O3 NP-incubatie bij verschillende concentraties van 0 tot 200 g/mL gedurende 2 h, wat vergelijkbaar was met de resultaten voor PBS-oplossing (negatieve controle). Vergeleken met de negatieve controle, is het percentage hemolyse bij verschillende concentraties van HA-Gd2 O3 NP's werden enigszins geëvalueerd op basis van de absorptie van het supernatant bij 541 nm. De resultaten toonden aan dat de hemolysepercentages van HA-Gd2 O3 NP's waren allemaal minder dan 3% in de bestudeerde concentratie, wat hun gunstige hemocompatibiliteit verifieerde. Om de potentiële toxiciteit te onderzoeken, heeft HA-Gd2 O3 NP's werden intraveneus geïnjecteerd in Balb/c-muizen (zoals te zien in S. Fig. 2). Na 1 week werden deze muizen geëxecuteerd en werden de blaas, nier en milt geoogst voor pathologische sectieanalyse. Zoals getoond in S. Fig. 2, toonde het resultaat van pathologische secties aan dat er geen waarneembare laesie of ontstekingsreactie was in de organen van HA-Gd2 O3 NP-behandelde muizen. Deze resultaten gaven duidelijk aan dat de as-gesynthetiseerde HA-Gd2 O3 NP's hadden een gunstige cytocompatibiliteit en een goede hemocompatibiliteit.
een Effect van HA-Gd2 O3 NP's over de levensvatbaarheid van HepG2- en VSMC-cellen met behulp van de CCK-8-assay. b Hemolytische activiteit van de HA-Gd2 O3 NP's in verschillende concentraties (50, 100, 200, 300 en 400 g/mL). PBS en water werden respectievelijk als negatieve en positieve controle gebruikt
MRI Phantom-onderzoek
De longitudinale (T 1 ) relaxatietijden van HA-Gd2 O3 NP's werden in vitro onderzocht samen met het commerciële contrast Magnevist (Gd-DTPA) als controle met behulp van fosfaatgebufferde zoutoplossing (pH =7,4, 0,2 M). Bij toenemende Gd-concentraties wordt de signaalintensiteit van T 1 - gewichtsfantoombeelden zijn duidelijk toegenomen, wat aangeeft dat alle monsters MRI-contrastversterking op T . kunnen genereren 1 -gewogen sequenties (Fig. 4a). Bovendien gaven grafieken van de signaalintensiteit versus inversietijd T 1 -ontspanningstijden van elk contrastmiddel bij specifieke concentraties. Zoals getoond in Fig. 4b, is de r 1 waarde van HA-Gd2 O3 NP's werden gemeten als 6,0 mM −1 S −1 , die aanzienlijk hoger was dan die van Magnevist (3,86 mM −1 S −1 ) onder dezelfde voorwaarden. De verbeterde r 1 kan worden toegeschreven aan de veel grotere hydrodynamische straal en oppervlakte van HA-Gd2 O3 NP's; daarom werden meer Gd-atomen gedoteerd in het rooster van NP's toegankelijk voor watermoleculen, waardoor de longitudinale relaxatie werd verkort en de r werd verbeterd 1 waarde.
een T1 fantoomafbeeldingen van de HA-Gd2 O3 NP's met verschillende concentraties van totale Gd-ionen. b De corresponderende plots van 1/T1 tegen concentraties van totale Gd-ionen. c In vivo T1 MR-beeldvorming en analyse van muizen na intraveneuze injectie van HA-Gd2 O3 NP's als contrastmiddelen. d Kwantificering van signaalveranderingen (SNR-ratio) in de blaas en nier op verschillende tijdstippen na toediening (n =3). *p <0,05
MR-beeldvorming in vivo
Om de potentiële toepassingen in vivo te bepalen, de MR-beeldvormingsprestaties en het lot van de circulatie van HA-Gd2 O3 NP's (10 mg/kg) werden onderzocht met behulp van een MRI-scanner met normale BALB/c-muizen als model. Vergeleken met pre-injectiebeelden (Fig. 4c), werden de helderdere gebieden van de nier en blaas, zoals aangegeven door de gestippelde cirkels, duidelijk waargenomen 10 min na injectie, wat aantoont dat HA-Gd2 O3 NP's kunnen worden gebruikt als CA's om T . te verbeteren 1 ontspanning in deze belangrijke organen in vivo. Belangrijk is dat de contrastverbetering van HA-Gd2 O3 NP's werden gehandhaafd tot 60 min na injectie, wat veel langer was dan die van Gd-complexe kleine moleculen (halfwaardetijd van ongeveer enkele minuten bij kleine dieren) [27], wat aangeeft dat HA-Gd2 O3 NP's hadden in vivo langere retentietijden dan het commerciële contrast. Om het MR-contrasteffect kwantitatief te analyseren, hebben we de signaal-ruisverhouding (SNR) berekend door de interessegebieden van de MRI-beelden nauwkeurig te analyseren en de waarden van SNRpost te berekenen. /SNRpre om de relatieve signaalverbetering (RSE) weer te geven (figuur 4d). De RSE-waarden van HA-Gd2 O3 NP's in de nier waren 1,35, 1,99 en 1,86. Evenzo zijn de RSE-waarden van HA-Gd2 O3 NP's in de blaas waren hoger dan die in de nier (1,29, 3,59 en 2,26). HA-Gd2 O3 NP's met een grote omvang (meer dan 100 nm) vertoonden lange circulatietijden en kunnen vervolgens worden geëlimineerd via de gal-intestinale route volgens eerdere resultaten [32]. Bovendien kan de verlengde circulatietijd in vivo de passieve targeting in tumoren hebben verhoogd door het EPR-effect te versterken.
Tumorbeeldvorming
HA-Gd2 O3 NP's met uitstekende MR-beeldvormingsprestaties en lange circulatietijd bieden een geweldige kans om tumoren af te beelden via een EPR-effect. We hebben dus subcutane levertumormodellen opgesteld om te onderzoeken of hepatocellulaire carcinomen (HCC's) kunnen worden gedetecteerd door HA-Gd2 O3 NP-versterkte MRI. Na intraveneuze injectie van de HA-Gd2 O3 NP's, zagen we dat het subcutane tumorgebied helderder wordt dan het omringende weefsel, zoals gezien door zowel coronale als transversale scanning (Fig. 5a). De RES van de subcutane tumor bereikte dramatisch 1,54 en 1,83 met respectievelijk transversale en coronale scanning, wat wijst op de effectieve accumulatie van de HA-Gd2 O3 NP's in het tumorgebied door het EPR-effect. Deze bevindingen tonen aan dat HA-Gd2 O3 NP's zijn zeer gevoelig voor MRI-visualisatie van tumoren. Veel onderzoeken hebben aangetoond dat de lange circulatietijd de efficiëntie van passieve targeting door lekkende vasculatuur van solide tumoren zou kunnen bevorderen [33].
T 1 -gewogen MR-beeldvorming (a ) en bijbehorende kwantitatieve analyse (b ) van Heps muis leverkanker xenograft tumoren na intraveneuze injectie van HA-Gd2 O3 NP's
Radiosensibilisatieverbetering van HA-Gd2 O3 NP's
De uitstekende prestaties van HA-Gd2 O3 NP's als een T 1 contrastmiddel zette ons ertoe aan om de locatie in de radiosensibilisatie van tumoren nauwkeurig te bepalen. Ten eerste werd onderzocht of dosisverhoging plaatsvond met deze combinatiebehandeling met behulp van een CCK-8-assay. Zoals afgebeeld in Fig. 6a, enkele HA-Gd2 O3 NP's (concentratie 0-200 μg/ml) hadden geen significante invloed op de levensvatbaarheid van HepG-2, maar röntgenstraling (bereik 0-9 Gy) verminderde de levensvatbaarheid van HepG-2-cellen tot minder dan 70% bij 9 Gy. Belangrijk is dat een combinatie van röntgenstraling met HA-Gd2 O3 NP's verminderden de levensvatbaarheid van HepG-2-cellen dramatisch tot minder dan 50%, vooral bij een concentratie van 200 g / ml bij 9 Gy. Vervolgens werd een klonogene test uitgevoerd om de levensvatbaarheid van de cellen in HepG-2-cellen te evalueren na een combinatie van röntgenstraling en HA-Gd2 O3 NP's. Zoals getoond in Fig. 6b, enkele HA-Gd2 O3 NP's hadden geen dramatische invloed op de vorming van HepG-2-celkolonies, maar röntgenstraling verminderde de vorming van HepG-2-celkolonies tot 46,7%. Behandeling met röntgenstraling en HA-Gd2 O3 NP's remden met name de levensvatbaarheid van celkolonievorming tot 29,8%. De bijbehorende afbeeldingen bevestigden verder de radiosensibilisatie van HA-Gd2 O3 NP's tegen HepG-2-cellen.
Het radiosensibilisatie-effect van HA-Gd2 O3 NP's in vitro. een Het synergetische effect van HA-Gd2 O3 NP's (0 g/mL, 12,5 g/mL, 25 g/mL, 50 g/mL, 100 g/mL en 200 μg/mL) en röntgenstraling (0 Gy, 3 Gy, 6 Gy en 9 Gy) over de levensvatbaarheid van HepG2-cellen met behulp van de CCK-8-assay. *p <0,05, **p <0,01, het verschil was statistisch significant. b De overlevingstests van de kolonies van HepG2-cellen behandeld met HA-Gd2 O3 NP's en röntgenstraling en c de overeenkomstige kwantitatieve analyse van het vermogen tot kloongenese. d Tumorvolumegroeicurven van verschillende groepen muizen na verschillende behandelingen. Groepen:a controle, b straling, c HA-Gd2 O3 NP's en d straling + HA-Gd2 O3 NP's. e Foto's van tumoren verzameld bij verschillende groepen muizen aan het einde van de behandeling
De effectiviteit van radiotherapie in vitro moedigde ons aan om HA-Gd2 . toe te passen O3 NP's gecombineerd met de bestraling om de tumorgroei bij tumordragende muizen te beheersen. De volumes van tumoren in de controle en enkelvoudige HA-Gd2 O3 NP-behandelingen groeiden snel en beide namen met 180% toe. Vergeleken met de enkele bestralingsbehandelingen 58%, HA-Gd2 O3 NP's gecombineerd met bestraling vertoonden een efficiënte tumorremming met 38% na 10 dagen bestraling (figuur 6d). De tumor werd gefotografeerd en de gemiddelde tumorvolumes in elke groep toonden aan dat het gemiddelde tumorvolume in groep (a) het hoogste was, terwijl dat in groep (d) het laagste was van alle groepen (Fig. 6e). Deze resultaten laten zien dat de as-bereide HA-Gd2 O3 NP's zijn veelbelovend voor de remming van tumorgroei onder röntgenstraling.
Flowcytometrie-assay en live/dood-kleuringsassay werden uitgevoerd om het radiosensibilisatiemechanisme bij de gecombineerde behandeling van HA-Gd2 beter te begrijpen. O3 NP's en röntgenstraling. Zoals getoond in Fig. 7a, werd intensieve groene fluorescentie zonder rood waargenomen in HepG-2-cellen die waren behandeld met enkelvoudig HA-Gd2 O3 NP's, die de levensvatbaarheid van hoge cellen verifieerden. Een kleine hoeveelheid rode fluorescentie werd waargenomen na röntgenstralingsbehandelingen, wat wijst op een laag niveau van celapoptose. Er werd echter sterke rode fluorescentie waargenomen na combinatiebehandeling van HA-Gd2 O3 NP's (200 g/ml) en straling, wat aantoont dat HA-Gd2 O3 NP's zouden de door röntgenstraling geïnduceerde celapoptose dramatisch kunnen verbeteren. Het radiosensibilisatiemechanisme van HA-Gd2 O3 NP's werden verder onderzocht met behulp van flowcytometrie. Zoals afgebeeld in Fig. 7b, enkele straling en HA-Gd2 O3 NP's induceerden respectievelijk 27,55% en 19,12% van de G2/M-fase-arrestatie. Echter, combinatiebehandeling van HA-Gd2 O3 NP's en straling verhoogden met name de G2 / M-fase-arrestatie, variërend van 30,89 tot 33,27% op een dosisafhankelijke manier. Ondertussen induceerde de combinatiebehandeling apoptotische celdood van 10,63 tot 22,67%, zoals weerspiegeld door de sub-G1-verhoudingen wanneer de enkele HA-Gd2 O3 NP's en straling veroorzaakten 3,02% en 13,87%. Om het mogelijke mechanisme van celdood verder te onderzoeken, werd een Annexin V-EGFP/PI-methode uitgevoerd door de flowcytometrie. Annexine V-EGFP-emissiesignaal werd uitgezet op de x -as, terwijl het PI-emissiesignaal werd uitgezet op de y -as (Fig. 8). De hoeveelheden necrosecellen, vroege apoptosecellen, late apoptosecellen en levende cellen werden bepaald door het percentage annexine V − /PI + (Q3), Annexin V + /PI + (Q2) en Annexin V − /PI − (Q4), respectievelijk. Het apoptotische percentage van de cellen in de controlegroep en enkelvoudige HA-Gd2 O3 NP (100 g/ml) groep waren minder dan 5%, wat resulteert in subtiele invloed. Vergeleken met behandelgroepen met enkelvoudige bestraling (8,8%), is het apoptosepercentage van de combinatie van HA-Gd2 O3 NP's en straling namen toe naarmate de concentratie toenam, variërend van 50 tot 200 g/ml. Vooral de vroege apoptosesnelheid van cellen nam duidelijk toe tot 33,2%, en de vroege en late apoptose bereikte 44,3% wanneer de concentratie 200 g/ml is. Over het algemeen is de combinatie van HA-Gd2 O3 NP's en röntgenbestraling hadden een synergetisch effect op de vorming van celkolonies, de levensvatbaarheid van de cellen op een dosisafhankelijke manier en het versterkende effect van radiosensibilisatie. Op basis van deze resultaten, HA-Gd2 O3 NP's kunnen een efficiënt alternatief zijn voor het verbeteren van de radiosensibilisatie voor radiotherapie.
Stralingsdosisverhoging van HA-Gd2 O3 NP's. een Levend-dood kleuring van HepG2-cellen. Groen (fluoresceïnediacetaatkleuring) =levende cellen, rood (propidiumjodidekleuring) =dode cellen. Schaalbalken =200 mm. b De celcyclusverdeling na verschillende behandelingen werd geanalyseerd door het DNA-gehalte te kwantificeren met behulp van een flowcytometrietest
De apoptose-analyses van HA-Gd2 O3 NP's. een De apoptose-niveaus van HepG-2-cellen na 24 h na behandeling van röntgenstraling. b De bijbehorende kwantitatieve analyse
Conclusies
Concluderend hebben we een bifunctionele HA-Gd2 . ontwikkeld O3 NP's voor effectieve MR-beeldvorming en radiosensibilisatie van tumoren in een hydrothermisch proces met één pot. Na het coaten met HA, de as-gesynthetiseerde HA-Gd2 O3 NP's vertoonden een gunstige dispergeerbaarheid in water, uitstekende biocompatibiliteit. De resulterende HA-Gd2 O3 NP's die de Gd-atomen inkapselen, vertoonden niet alleen effectief een hoge longitudinale relaxiviteit (r 1 ) voor MRI als een T 1 contrastmiddel, maar ook een verhoogde stralingsgevoeligheid van tumoren door celapoptose te induceren en de celcyclus als radiosensitizer te blokkeren. Dus de nieuwe HA-Gd2 O3 NP's laten een veelbelovend potentieel zien voor tumordiagnose en radiotherapie.
Materialen en methoden
Materialen
Fluoresceïnediacetaat (FDA) en propidiumjodide (PI) werden verkregen van Sigma (New York, NY, VS). GdCl3 ·6H2 O, ethyleenglycol (99%) werd gekocht bij Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. (Lianyungang, Jiangsu, Volksrepubliek China). De Cell Counting Kit-8 (CCK-8) werd gekocht bij Dojindo (Kumamoto, Japan). NaH2 PO4 , Na2 HPO4 , en H2 SO4 werden verkregen van het Guangfu Fine Chemical Research Institute (Nankai, Tianjin, Volksrepubliek China). Foetaal runderserum en Dulbecco's minimum essential medium (DMEM) werden gekocht bij de Invitrogen China Limited (Shanghai, Volksrepubliek China). Alle chemicaliën waren van analytische kwaliteit en werden zonder verdere zuivering gebruikt.
Synthese van HA-Gd2 O3 NP's
De HA-Gd2 O3 NP's werden als volgt bereid met behulp van een hydrothermische benadering in één pot:eerst werd 0,1 g HA opgelost in 20 mL water onder krachtig roeren bij kamertemperatuur gedurende de nacht. Vervolgens 0,1 g GdCl3 ·6H2 O en 0, 5 mL NaOH (1 M) werden respectievelijk toegevoegd. Vervolgens werd het mengsel nog 5 min geroerd om een homogene heldere oplossing te vormen en overgebracht naar een autoclaaf van 50 ml, afgesloten en hydrothermisch behandeld bij 120 ° C gedurende 6 uur. Na op natuurlijke wijze tot kamertemperatuur te zijn afgekoeld, werd de transparante suspensie gefiltreerd met een membraan van 0,22 m om eventuele grote agglomeratie te verwijderen. De bereide oplossing werd vervolgens gedurende 3 dagen tegen water gedialyseerd in een dialysezak met een molecuulgewichtsgrens van 14 kDa. De dialyse-oplossing werd verzameld en gevriesdroogd met behulp van een vacuümvriesdroger. De HA-Gd2 O3 Zo werden NP-poeders verkregen en bewaard voor verdere karakterisering.
Instrumentatie en karakteriseringen
De morfologieën van de HA-Gd2 O3 NP's werden onderzocht door transmissie-elektronenmicroscopie met hoge resolutie op een JEM-2100-microscoop (JEOL, Tokyo, Japan) onder een versnellende spanning van 200 kV. De elementaire samenstelling van HA-Gd2 O3 NP's werden bepaald door XPS-metingen in een MK II-foto-elektronspectrometer, met behulp van Al-Ka (1486,6 eV) als de röntgenbron en Fourier-transformatie infrarood (FTIR) spectrometer (Nicolet Nexus 470, GMI, Ramsey, MN, VS). De kristalstructuur van de HA-Gd2 O3 NP's werden gekarakteriseerd via röntgendiffractie (XRD) patronen op een Rigaku-D/MAX2500 diffractometer (Rigaku, Japan) uitgerust met Cu Kα (λ =0,15405 nm) straling met een scansnelheid van 4°/min in het bereik van 5 tot 80°.
Cell Viability Assay
De invloed van HA-Gd2 O3 NP's op de levensvatbaarheid van cellen werden bestudeerd via Cell Counting Kit CCK-8-assay (CCK-8-assay). HepG2 (humaan hepatocarcinoom, ATCC-nummer:HB-8065) en VSMC's (vasculaire gladde spiercellen) werden uitgezaaid in een plaat met 96 putjes met een dichtheid van 3 × 10 3 cellen/putje en gekweekt bij 37 °C in 5% CO2 incubator gedurende 24 h, daarna met DMEM met verschillende concentraties HA-Gd2 O3 NP's (0 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL en 200 μg/mL) vervangen het groeimedium. Na nog eens 4 uur incubatie, toevoeging van 10 μL CCK-8-oplossing aan elk putje, werden de cellen gedurende 4 uur op een donkere plaats geïncubeerd. De absorptie werd gemeten bij 490 nm met behulp van Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader (Bio Tek, Winooski, VT, VS). Niet-behandelde cellen (in DMEM) werden gebruikt als controle en de relatieve levensvatbaarheid van de cellen (gemiddelde SD, n =5) werd uitgedrukt als Abssample/Abscontrol × 100%.
Hemolyse-assay
In het kort, 19-21 g, leeftijden van 6 weken vrouwelijke BALB / c-muizen werden vriendelijk voorbereid door de Animal Management Rules van het ministerie van Volksgezondheid van de Volksrepubliek China. Drie milliliter bloed dat stabiliseerde met heparine-natrium werd verkregen door oogbollen te verwijderen. Vervolgens werd het volgens de literatuur gecentrifugeerd om het supernatant te verwijderen met 1200 tpm, 15 min. Daarna de sedimentatie vijf keer wassen met PBS om de rode bloedcellen van de muis (MRBC's) te verkrijgen, vervolgens ongeveer 3 ml bloed nemen door de oogbol te verwijderen, gestabiliseerd met heparine-natrium, gecentrifugeerd (1, 200 rpm, 15 min) om het supernatant te verwijderen volgens de literatuur [27], vijf keer gewassen met PBS om de rode bloedcellen van de muis (MRBC's) te verkrijgen. Tien keer verdunnen met PBS, werden MRBC's van 0,1 mL overgebracht in buisjes van 1,5 ml die vooraf waren gevuld met 0,9 ml PBS met verschillende deeltjesconcentraties (50-200 μg/ml) HA-Gd2 O3 NP's, respectievelijk 0,9 mL water (als positieve controle) en 0,9 mL PBS (als negatieve controle). Het mengsel werd 2 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd na zacht schudden en vervolgens 1 min gecentrifugeerd bij 12.000 pm. Ten slotte werden de foto's van alle monsters genomen en werd de absorptie van het supernatant (hemoglobine) gemeten met een UV-2450 UV-Vis-spectrofotometer. De hemolysepercentages van verschillende monsters werden berekend door het verschil in absorptie over het monster, de positieve en negatieve controle te delen bij 541 nm.
MR Phantom Study In Vitro and In Vivo
In vitro and in vivo MR images were acquired on 3 Tesla MRI scanner (Magnetom Trio Tim, Siemens, Germany). To study the T 1 phantom images in vitro, the solution of HA-Gd2 O3 NPs with different concentrations ranging from 0 to 16 mM was added to a 96-well culture plate, using the Magnevist (commercial MR contrast agent, Gd-DTPA) as control. For MR imaging in vivo, we chose the normal BALB/c mice as the model (n =4). Animal experiments were strictly conformed to the Animal Management Rules of the Ministry of Health of the People’s Republic of China. Ten milligrams per kilogram of HA-Gd2 O3 NPs filtering through sterilized membrane filters (pore size 0.22 μm) were intravenously injected into the animals, then immediately investigated with a MRI scanner. These samples for MR imaging in vitro and animals in vivo were imaged with the following parameters:TR/TE =300/10 ms, 256 × 256 matrices, slices =5, thickness =2 mm, averages =2, FOV =80 × 80.
Radiosensitization Effect In Vitro
CCK-8 assay was used to evaluate radiosensitizing activity of HA-Gd2 O3 NPs in vitro. Cells were seeded in five 96-well plates at a density of 3 × 10 3 cells/well, and each plate was treated at the same condition:cultured at 37 °C in 5% CO2 incubator for 24 h, then using DMEM containing different concentrations of HA-Gd2 O3 NPs (0 μg/mL, 12.5 μg/mL, 25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL, and 200 μg/mL) replacing the growth medium. After incubation for 4 h, five plates were irradiated at different X-ray doses (0 Gy, 3 Gy, 6 Gy, and 9 Gy), 300 cGy/min, respectively. After radiation, all the plates were incubated for 4 h, then measuring the absorbance under the same parameters.
Clonogenic survival assay was also conducted to study the radiosensitization effect in vitro. HepG2 cells were seeded in six-well plates at 4.0 × 10 4 cells/well and allowed to grow for 16 h. The cells were incubated with HA-Gd2 O3 NPs diluted in cell culture medium for 6 h. The cells were then irradiated at 6 Gy using a clinical linear accelerator (Oncor, Siemens, Germany) with 6 MeV irradiation using a 10 cm × 10 cm radiation field at a source-to-skin distance (SSD) of 100 cm to cover the entire cells. Then, these irradiated cells were allowed to grow for 14 days, fixed with 4% paraformaldehyde at room temperature for 40 min, stained with a 1% crystal violet after washing the cells.
Live-Dead Staining Assay and Flow Cytometry
To study the radiosensitization effect of HA-Gd2 O3 NPs, HepG2 cells were seeded in six-well plates at a density of 4.0 × 10 4 cells/well and allowed to grow for 12 h and set six groups (control, HA-Gd2 O3 NPs, radiation, radiation + 50 μg/mL HA-Gd2 O3 NPs, radiation + 100 μg/mL HA-Gd2 O3 NPs and radiation + 200 μg/mL HA-Gd2 O3 NP's). When cells were grown to 80% in plates, the first group had no treatment, the second group was incubated with 100 μg/mL HA-Gd2 O3 NPs for 24 h, the third group was just irradiated, and the fourth group to the sixth group were irradiated and incubated with different concentrations of HA-Gd2 O3 NPs (50, 100, and 200 μg/mL) for 24 h, respectively. After that, FDA and PI working buffer were added for cell staining. The fluorescence of stained cells was observed under a fluorescence microscope (×20), and live cells showed green color and dead ones exhibited red color. Furthermore, cells by different treatments were washed three times with PBS, digested, collected, and centrifuged at a speed of 2000 rpm for 5 min, then fixed with 70% ethanol at − 20 °C overnight followed by PI staining. DNA fragmentation was quantified by the fluorescence intensity of PI on a flow cytometer (BD, Accuri, C6BD, Accuri, C6), analyzed by software (FLOWJO 7. 6. 2) to make clear the cell cycle distribution.
Radiosensitization Effect In Vivo
Female BALB/c mice with body weights of 19–21 g and ages of 6 weeks were obtained from the Yangzhou University Laboratory Animal Center under the standard conditions. Animal experiments were compliant with the Animal Management Rules of the Ministry of Health of the People’s Republic of China. A subcutaneous tumor model was established as the following procedures:First, 1 × 10 6 HepS cells were inoculated into mice intraperitoneal, and the ascites were collected after 5 days. Then, these ascites were injected into subcutaneous. When the tumor sizes reached approximately 100 mm 3 , subcutaneous tumors models were established and applied to the following experiments.
Eight mice bearing subcutaneous tumors per group were treated with radiation at 3 Gy per fraction to a total dose of 9 Gy within 7 days. The radiotherapy was conducted after 3 h intravenous injection of HA-Gd2 O3 NPs (10 mg/Kg), on a Siemens Primus clinical linear accelerator (6 MeV) using a self-made device to cover the entire tumor. These mice were anesthetized by 1% pentobarbital (50 mg/kg) to assure immobility during irradiation. The volume was measured and recorded every day, determined from caliper measurement, and calculated by the formulae:V =0.5 × a × b 2 , where V (mm 3 ) is the volume of the tumor, and a (mm) and b (mm) are the tumor length and tumor width, respectively. Relative tumor volumes were normalized to their initial sizes. Each group was conducted on eight mice, wherein statistical analysis was performed using Student’s two-tailed t test (*p <0.05, **p <0.001).
Beschikbaarheid van gegevens en materialen
The data sets supporting the results of this article are included within the article.
Nanomaterialen
- Gouden nanodeeltjes voor chemosensoren
- Nanodiamanten voor magnetische sensoren
- Nanodeeltjes voor kankertherapie:huidige vooruitgang en uitdagingen
- Preparatie en magnetische eigenschappen van kobalt-gedoteerde FeMn2O4-spinel-nanodeeltjes
- Percolatiemagnetisme in ferro-elektrische nanodeeltjes
- Interactie-effecten bij de assemblage van magnetische nanodeeltjes
- Verbeterde stabiliteit van gouden magnetische nanodeeltjes met poly(4-styreensulfonzuur-co-maleïnezuur):op maat gemaakte optische eigenschappen voor eiwitdetectie
- Gemodificeerd hypervertakte polyglycerol als dispergeermiddel voor groottecontrole en stabilisatie van gouden nanodeeltjes in koolwaterstoffen
- Synthese en in vitro prestaties van met polypyrrool gecoate ijzer-platina nanodeeltjes voor fotothermische therapie en foto-akoestische beeldvorming
- Vergelijking tussen foliumzuur en op gH625 peptide gebaseerde functionalisering van Fe3O4 magnetische nanodeeltjes voor verbeterde celinternalisatie
- Magnetic Gold Nanoparticle-Labeled Heparanase Monoclonal Antibody en de daaropvolgende toepassing voor Tumor Magnetic Resonance Imaging