Ontwikkeling van een precieze lysosomale pH-sensor met zelf-ontbindende SiO2-nanopartikels

Samenvatting

De zuur pH van lysosomen is nauw gerelateerd aan autofagie; dus, goed weten van de precieze lysosomen, pH-veranderingen zal meer informatie geven over het autofagieproces en de status. Tot nu toe konden echter alleen pH-veranderingen in een relatief brede reeks worden aangegeven, de exacte lysosomen pH-detectie is nooit bereikt. In onze studie hebben we een endo/lysosomale pH-indicator gevestigd gebaseerd op het zelf-ontbindende SiO₂ nanopartikelsysteem met specifieke syntheseparameters. De gecentraliseerde methylene blauw (MB) in de centraal-holle structurele nanopartikels presenteerde gevoelige vrijgave als functie van pH-waarden van pH 4,0–4,8, wat precies het pH-bereik van lysosomen is. De lineaire correlatie van de optische dichtheid (OD) waarden en de pH-waarden is opgebouwd, wat is gebruikt voor de detectie van lysosomen pH in 6 verschillende cellijnen. Bovendien, met dit systeem, slaagden we erin de gemiddelde pH-veranderingen van lysosomen precies te detecteren voor en na zwarte mesoporeuze silicium (BPSi) NP endocytose, wat het mechanisme van de autofagiebeëindiging na BPSi endocytose verduidelijkt. Dus, het zelf-ontbindende nanopartikels-gebaseerde luminale pH-indicator kan een nieuwe methodologie en strategie bieden om de lysosomale pH beter te kennen, dan meer details aan te geven over het autofagieproces of andere belangrijke signalen over metabolisme.

Inleiding

Lysosomen dienen als de eindbestemming voor macromoleculen, waar deze macromoleculen worden afgebroken door hydrolytische enzymen geactiveerd door lage pH [1]. De zuur pH van lysosomen onderhouden door de vacuolaire-type H⁺ −ATPase (v-ATPase) [2] die protonen uit het cytoplasma in de lysosomale lumen pompt was om de activiteit van ~ 60 typen hydrolytische enzymen te behouden [3]. Bovendien onthulde recente literatuurrapporten dat de zuur pH van lysosomen nauw gerelateerd is aan de autofagie [4], zodat goed weten van de precieze lysosomale pH-veranderingen meer informatie zal geven over het autofagieproces en de status. Gebaseerd op onze studies en literatuuroverzicht, zal amine-positief geladen nanopartikeleendocytose waarschijnlijk de pH-verandering in endo/lysosomen verhogen, zoals primaire en secundaire amine PEG-gedecoreerde nanopartikels of sommige hydrofiele decoratie op de deeltjesoppervlakte [5, 6].

De pH-toename geïnduceerd door de endocytose van amine nanopartikels zal dramatisch toenemen in transcriptiefactor EB (TFEB) kernlocalisatie [7], wat resulteert in niet alleen transcriptionele uprregulatie van het pad, maar ook lysosomale dysfunctie veroorzaakt, wat uiteindelijk resulteert in blokkade van autofagische flux [7,8,9]. Omdat TFEB autofagie reguleert, en gevolglik leidt de overexpressie ervan tot een significante toename in autofagoomproductie in gecultureerde cellen.

Dus, om het autofagieproces en de details van autofagie te voorspellen, is de meting van de precieze lysosomale pH en de verandering ervan zeer cruciaal. Tot nu toe, uit de endo/lysosomale pH-waarde aangevende literatuuroverzichten [10] en de commerciële producten voor het detecteren van endo/lysosomale pH-waarden, konden alleen pH-veranderingen in een relatief brede reeks worden aangegeven, en de exacte lysosomale pH-detectie is nooit bereikt. Dus, om de inzichtelijke details van autofagie te kennen, is de vestiging van een precieze luminale pH-verandering detectiemethode een belangrijke benadering.

Gebaseerd op onze vorige ervaringen met zelf-ontbindende SiO₂ nanopartikels, hebben we in deze studie een precieze pH-indicator gevestigd die de luminale pH-veranderingen detectie kan realiseren. SiO₂ nanopartikels hebben goede voordelen in afstembare grootte en biocompatibiliteit [11]. Door specifieke syntheseparameters in te stellen, kon de gevestigde zelf-ontbindende SiO₂ pH-indicator gevoelig de lading methylene blauw (MB) vrijgeven in pH 4,0–4,8, wat precies het pH-bereik van lysosomen is. Bovendien presenteerde de MB-vrijgave een lineaire correlatie met de pH-waardeveranderingen (schema 1). Vervolgens testten we de haalbaarheid van de pH-indicator op cellulaire niveau door 6 verschillende cellijnen te introduceren, slaagden erin de gemiddelde pH-veranderingen van lysosomen voor en na zwarte mesoporeuze silicium (BPSi) NPs endocytose te bepalen, wat het mechanisme van de autofagiebeëindiging na BPSi endocytose verduidelijkt. Dus, het zelf-ontbindende nanopartikels-gebaseerde luminale pH-indicator kan een nieuwe methodologie en strategie bieden om de lysosomale pH beter te kennen, dan meer details aan te geven over het autofagieproces of andere belangrijke signalen over metabolisme.

Schematische illustratie van MB@SiO₂ meting van lysosomale pH in levende cellen

Materialen en Methoden

Materiaal Sectie

Natriumsilicide (NaSi) en Si wafers (diameter 20 cm, p⁺ (100), 0,01–0,02 Ω cm) werden verstrekt door SiGNa Chemistry Inc. en Ocmetic Inc., respectievelijk. Ammoniumbromide (NH₄Br, 99%), natriumbromide (NaBr, 99%), tolueen (anhydr, 99,8%), zoutzuur (HCl, 37%), MB, en tetraethylorthosilicaat (TEOS) werden gekocht van Sigma-Aldrich. 0,5 kDa methoxy-PEG-silaan en 2 kDa methoxy-PEG-silaan werden gekocht van de Fluorochem Ltd. en Laysan Bio Inc. apart. RPMI 1640 medium werd verstrekt door de Life Technologies. Foetaal kalfserum (FBS) werd gekocht van TianHang biologische technologie. Natriumbicarbonaat, streptomycinesulfaat, penicilline G, HEPES, Lysozym Oplossing, CellLight Vroeg-eindosomen-GFP, LysoTracker™ Red DND-99, Pierce® BCA Eiwit Assay Kit, versterkte chemiluminescentie, pHrodo™ Red Transferrine conjugaat, Live Cell Imaging Oplossing, en Trizol reagent werden gekocht van Thermo Fisher Scientific. Ethanol en ammonia-water werden verstrekt door de Sinopharm. BioRT Master HiSensi cDNA First-Strand Synthesis kit werd gekocht van de Hangzhou Bioer Technology Co., Ltd. RIPA lysaat werd gekocht van de Heart Biologische Technologie Co., Ltd. P62, TFEB, en β-actine antilichamen werden gekocht van de Proteintech Group, Inc. LC 3B antilichaam werd verstrekt door de Abcam. 2-(4-Pyridyl)-5-((4-(2-dimethylaminoethy-laminocarbamoyl) methoxy) fenyl) oxazol (PDMPO) werd verstrekt door de Yeasen Biotech Co., Ltd.

Doel, Ontwerp, en Instelling van de Studie

Het doel van deze studie is om (1) de invloed van BPSi nanopartikels op autofagie in HepG2 cellen te verkennen, (2) het onderliggende mechanisme van lysosomale pH-waardeveranderingen die autofagie beïnvloeden te vinden, (3) een precieze lysosomale pH-indicator te vestigen die de pH van lysosomen precies kan meten, en ten slotte, (4) de invloed van pH-fluctuaties op autofagie aan te geven. Om het studie-doel hierboven te realiseren, hebben we het transcriptoom sequentie-experiment gebruikt om de transcriptoom genveranderingen in HepG2 cellen na het voeren van BPSi nanopartikels te verkennen en het geverifieerd door RT-qPCR en Western experimenten. Fluorescente kleurstoffen zoals PDMPO werden gebruikt om de verandering van lysosomale pH in HepG2 cellen na het voeren van BPSi te meten. Om de pH van lysosomen precies te meten, hebben we MB@SiO₂ nanopartikels ontwikkeld met 10 parameters en de karakterisaties van deze 10 soorten nanopartikels getest door experimenten zoals DLS en HR-TEM. De MB laadefficiëntie en vrijgavekinetiek studie van 10 series zelf-ontbindende nanopartikelsystemen werden getest in verschillende pH oplossingen en HepG2 cellen. Om de intracellulaire locatie van de nanopartikels na het binnengaan van de cel te verifiëren, deden we cel TEM experiment en live-cel confocale microscopie. Ten slotte maatten we de lysosomale pH-veranderingen in 6 soorten cellen na het voeren van BPSi om de universaliteit van MB@SiO₂ nanopartikels te verifiëren om de lysosomale pH-veranderingen te meten.

BPSi Nanopartikelsynthese

De BPSi nanopartikels werden bereid door onze vorige methode [12] en geleverd door onze medewerker (Wujun Xu, Afdeling Toegepaste Fysica, Universiteit van Oost-Finland). De bereiding van BPSi, NaSi, ammoniumzout, en NaBr (NaSi: NH₄Br: NaBr van 1:4:4, w/w/w) werd gemalen in een handschoenenkast met een Ar atmosfeer. Ze werden toegestaan te reageren in een buisoven onder een N₂ atmosfeer bij 240 °C gedurende 5 u (Verg. 1). Na afkoelen tot kamertemperatuur, werden de verkregen microdeeltjes gezuiverd door spoelen met 0,5 M HCl en 1,0 M HF oplossingen apart. De microdeeltjes werden balgemalen in ethanol bij 1000 toer/min gedurende 15 min, en de BPSi nanopartikels met de gewenste diameter werden verzameld via aanpassen van de centrifugatiesnelheid.

$$ \mathrm{NaSi}+{\mathrm{NH}}_4\mathrm{Br}\to \mathrm{NaBr}+{\mathrm{NH}}_3+\mathrm{Si}/\mathrm{H}+{\mathrm{H}}_2 $$ (1)

Door het Dynamische Lichtverstrooiing experiment, werden de diameterverdeling en oppervlaktelading van de nanopartikels bestudeerd. Alle NPs werden verdeeld in het medium na sterilisatie door lichte ultrasonificatie (5 s om ze gelijkmatig in de oplossing te disperseren, Ultrasonic cleaner SB-5200DT, Ningbo Scientz Biotechnology Co., Ltd.) direct vóór hun introductie tot de cellen.

10 Series Zelf-ontbindend Nanopartikelsysteem Vestiging

De 10 series zelf-ontbindende nanopartikels werden gesynthetiseerd door de methodologieën die we eerder rapporteerden [13,14,15,16], met gewijzigde parameters. In een typische procedure werd een bepaalde hoeveelheid MB eerst toegevoegd aan een mengsel van ethanol (75 mL) met ammonia-wateroplossing (25%, 3,4 mL), waarna een bepaalde hoeveelheid TEOS werd toegevoegd. De series zelf-ontbindende MB@SiO₂ NPs werden verkregen na 24 u roeren en 3 keer gewassen vóór hun drogen. De MB en TEOS hoeveelheden toegevoegd in de protocollen waren zoals beschreven in Tabel 1. De betekenis van 1,0/100 in de NPs_1,0/100 vertegenwoordigde de voorraad van MB en TEOS toen we de nanopartikels synthetiseerden, met 1,0 mg MB en 100 μL TEOS. En de betekenissen van 1,5/100 in de NPs_1,5/100 en anderen zijn consistent met die van 1,0/100.

Celcultuur

Om de efficiëntie en universaliteit van de pH-indicator gebaseerd op zelf-ontbindende nanopartikels te testen, probeerden we het te testen op specifieke tumor-afgeleide kankercellijnen. Dus, we selecteerden leverkanker, longkanker, darmkanker, en melanocytoma cellijnen als onderzoeksobjecten. De cellijnen van humane darmkankercellen HCT116, HCT8, en HCT15; humane leverkankercellen HepG-2; humane longkankercellen A549; en muis melanocytoma cellen B16 werden onderhouden in RPMI 1640 medium (Life Technologies) aangevuld met 10% hitte-geïnactiveerd FBS, 2,0 g/L natriumbicarbonaat, 0,1 g/L streptomycinesulfaat, 0,06 g/L penicilline G, en 5,958 g/L HEPES. De cellen werden onderhouden in een standaard, celcultuurincubator bij 37 °C in een vochtige atmosfeer met 5% CO₂.

Karakterisaties van 10 Series Zelf-ontbindende Nanopartikelsystemen

De morfologie van alle series nanopartikels werd gekarakteriseerd door HR-TEM met STEM-modus, en Si-kartering werd bestudeerd door EDS elementkartering. Nanopartikelsgrootteverdelingsanalyse werd uitgevoerd door ImageJ software door de nanopartikeldiameters in willekeurig geselecteerde STEM afbeeldingen te berekenen. De zetapotentieel van de nanopartikels en de polyverspreidingsindex (PDI) is gemeten door het dynamische lichtverstrooiing (DLS) onderzoek, in series buffers met specifieke pH-waarden. Data werd geanalyseerd door SPSS15.0 en de statistische resultaten werden gepresenteerd als gemiddelde ± S.D.

De MB Laadefficiëntie en Vrijgavekinetiek Studie van 10 Series Zelf-ontbindende Nanopartikelsystemen

Om de MB laadefficiëntie en vrijgavekinetiek te bestuderen, werd de standaardkromme van MB in series concentraties eerst opgesteld. De absorptie van MB werd uitgevoerd door UV–Vis spectrum met de absorptie bij 660 nm, wat de λmax van de monomere MB is. De MB laadefficiëntie werd berekend door de vergelijking hieronder, MB laadefficiëntie (%) = de hoeveelheid geïncapsuleerde MB/(totale hoeveelheid MB input).

De MB-vrijgave van 10 series nanopartikels werd bestudeerd in zuiver water en pH-buffers met verschillende pH-waarden (pH 4,0, pH 6,86, en pH 9,18) en Lysozym Oplossing (Thermo Scientific™ ^#90082). Bovendien werd de MB-vrijgavekinetiek na een specifieke duur in verschillende pH-buffers ook onderzocht. De OD-waarden bij 660 nm en de MB-vrijgavepercentages als functie van tijd werden dan bestudeerd.

In meer detail, werden de MB-vrijgavestudies uitgevoerd door de protocollen hieronder; 10 series nanopartikels oplossen in 15 mL standaardbuffer van pH 4,0, 6,86, en 9,18 met lysozymoplossing, respectievelijk; en de MB-vrijgave uitvoeren in een Hula mixer bij 37 °C. Gedurende de volgende 15 dagen, werd 1 mL van elk monster verzameld, gecentrifugeerd bij 12000 toer/min gedurende 10 min. De supernatans en het neerslag werden gemeten voor hun absorptiespectra bij 200–800 nm.

Bovendien werd de MB-vrijgave in precieze pH-buffers met lysozymoplossing in het pH-bereik van 4,1 tot 5,5 ook onderzocht met de bovengenoemde protocollen. Specifieke tijdduraties (6 u, 12 u, en 24 u) werden geplaatst als observatietijdstippen. De absorpties bij 660 nm werden vastgelegd in elk monster. De lineaire relatie van absorptie van elke pH-oplossing en de som van de kwadraten van de residualen werden geteld bij elk tijdstip, respectievelijk.

Om de MB-vrijgaveprofielen in cellen te detecteren, werden HepG-2 cellen gekweekt in een 75 cm² cultuurfles en gevoed met NPs (300 μg/mL) toen de cellen waren geprolifereerd tot 70% van de cultuurfles. Elke 30 min later, werden de cellen verzameld. De cellen werden herhaaldelijk bevroren en ontdooid om de MB in de cellen volledig vrij te maken. De celllyzaten werden gecentrifugeerd bij 12000 t/min gedurende 10 min. De supernatans werd verkregen en de absorptie ervan bij 660 nm gemeten om de totale hoeveelheid vrijgegeven MB te berekenen. In deze studie werden HepG2 cellen gekozen als onderzoeksobjecten, vanwege hun snelle celproliferatie wat de variantie onder alle 10 geteste groepen kon minimaliseren.

Cellulaire Colocalisatie van de 10 Series Nanopartikels en de Vrijgaveprestaties in 6 Verschillende Cellijnen

Cel TEM werd gebruikt om de colocalisatie van de nanopartikels in de endo/lysosomen te bestuderen volgens standaard cel TEM protocollen. Cellen werden gezaaid in de intensiteit van 1 × 10⁶ cellen/fles en geïnculeerd gedurende 24 u, zodat de celhechting kon plaatsvinden. Tien series nanopartikels in medium met dezelfde concentratie (100 μg/mL) werden geïnculeerd met de cellen voor nog eens 12 en 24 u, respectievelijk. Cellen werden daarna 3 keer gewassen met PBS om de overtollige nanopartikels te verwijderen, dan gefixeerd in 2,5% glutaraldehyde oplossing voor langer dan 1 dag. Gefixeerde cellen werden dan gewassen en gekleurd door osmiumtetroxide, 1% in gedemineraliseerd water voor 1 u, gevolgd door wassen met PBS voor 3 keer en DI water voor 2 keer. Klassiek cel TEM protocol [17, 18] werd daarna uitgevoerd, en secties met een dikte van 90 nm werden verzameld voor TEM observatie. MB-vrijgave als functie van pH-waarden werd bestudeerd in 6 cellijnen met zowel NPs_6/100 en NPs_7,5/80. Ook werden de OD-waarden van de vrijgave van de MB en de MB-vrijgavepercentages vastgelegd voor data-analyse.

Onderzoek naar Intracellulaire Opname van MB@SiO₂ Nanopartikels

Live-cel confocale microscopie werd gebruikt om de cellulaire opname en intracellulaire lot van de MB@SiO₂ nanopartikels te beoordelen. HepG-2 cel vroege eindosomen werden gekleurd (CellLight Vroeg-eindosomen-GFP, BacMam 2.0 ThermoFisher Scientific C10586, met excitatie/emissie ~ 488/510 nm) gedurende 16 u. En dan werden cellen geïnculeerd met NPs_6/100 (MB excitatie/emissie: 640/650–700 nm) bij de nanopartikelsconcentratie van 100 μg/mL op specifieke tijdsintervallen (2 u, 2,5 u, 3 u, 5 u, en 6 u). Vóór afbeeldingen werden genomen, werd lysozym gekleurd met de LysoTracker™ Red DND-99 (Thermo Fisher Scientific L7528, excitatie/emissie: 577/590 nm) gedurende 40 min. Daarna de kleurstofoplossing verwijderen en de cellen 2–3 keer wassen in PBS. Afbeeldingen werden genomen met een Nikon A1R Confocale Microscoop.

Transcriptoom Sequentie om Genexpressieverandering na BPSi Voeren te Evalueren

Totale RNA extractie van de controlegroep en BPSi-behandelde groep werd uitgevoerd met behulp van het Trizol reagent volgens de standaard opererende procedures. De kwaliteit van de initiële totale RNA monster voor het sequentie-experiment werd gedetecteerd met behulp van een NanoDrop ND-2000 spectrophotometer. Totale RNA die de kwaliteitscontrole doorstond werd gebruikt in opvolgende sequentie-experimenten. Een vergelijking van de genexpressie werd uitgevoerd door next-generation sequencing. Alle sequentieprogramma's werden uitgevoerd door BGI-Shenzhen Corporation (Shenzhen, China) met behulp van het BGISEQ-500 platform. Ruwe data verkregen door sequentie worden kwaliteitscontrole uitgevoerd om te bepalen of de sequentie data geschikt is voor opvolgende analyse. Als doorgegaan, voer kwantitatieve analyse van genen uit gebaseerd op genexpressieniveaus en voer significante verrijkingsanalyse van genontologie (GO) functies uit op de differentieel geëxprimeerde genen tussen de geselecteerde monsters.

Reverse Transcriptie Kwantitatieve Polymerase Ketting Reactie (RT-qPCR) Assay om de Activatie van TFEB-CLEAR Gen Netwerk te Bevestigen

Totale RNA werd geëxtraheerd uit de gekweekte HepG-2 cellen van de controle en BPSi-behandelde groepen door gebruik te maken van het Trizol reagent en omgekeerd getranscribeerd naar cDNA door gebruik te maken van de BioRT Master HiSensi cDNA First-Strand Synthesis Kit (Hangzhou Bioer Technology Co., Ltd.) met willekeurige primers. cDNA werd gebruikt om TFEB-CLEAR gen netwerk te amplificeren door kwantitatieve PCR met de Applied Biosystems™ 7500 real-time PCR systeem (Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, CA) met actine als referentiecontrole. Primers gebruikt voor kwantitatieve RT-PCR waren vermeld in Tabel S4.

Western Blot Assay om te Bevestigen dat Autofagie Geactiveerd Is na BPSi Voeren

Cellulaire eiwritten van de controlegroep en verschillende concentratie BPSi-behandelde groepen werden geëxtraheerd door RIPA lysaat (Heart Biologische Technologie Co., Ltd.). De protease-inhibitor werd toegevoegd aan de RIPA lysaat en voorverkoeld op ijs. De cellen 3 keer wassen met voorverkoeld PBS. Het vloeistof volledig weggooien en de schaal in ijs plaatsen voor 2 min. Vierhonderd microliter RIPA lysaat werd toegevoegd aan het oppervlak van de hele schaal, meerdere keren gepipetteerd met een pipet, en geïnculeerd op ijs gedurende 30 min, gedurende welke de schaal meerdere keren geschud werd om de cellen volledig te lyseren. Het gelyserde celvloeistof werd overgebracht naar 1 ml Eppendorf buisjes en gecentrifugeerd bij 13.000 toer/min gedurende 10 min, 4 °C. De verkregen supernatans werd 10 min gekookt in water en in – 20 °C geplaatst voor later gebruik. Eiwitconcentratie werd gekwantificeerd met behulp van de Pierce® BCA Eiwit Assay Kit (Thermo scientific).

Cel-extracten bevattende 25 μg totaal eiwit werden direct onderworpen aan SDS-PAGE en overgebracht. De membranen werden geblokkeerd met 5% magere melk en getest met primaire antilichamen die P62 (Proteintech ^#18420–1-AP), TFEB (Proteintech # 13372–1-AP), LC 3B (Abcam ^# ab192890), en β-actine (Proteintech ^#20536–1-AP) herkennen. Secundaire antilichamen werden gekozen volgens de herkomstsoort van de primaire antilichamen en gedetecteerd door versterkte chemiluminescentie (Pierce) of door gebruik te maken van de Bio-Rad ChemiDoc XRS + Gel Imaging Systeem (Bio-Rad, VS). De genormaliseerde bandintensiteit van P62, TFEB, en LC 3B relatief tot β-actine werd gekwantificeerd door densitometrie met behulp van ImageJ software in de BPSi groepen, en de data zijn het gemiddelde ± S.D. van drie onafhankelijke experimenten.

Cel pH Meten met PDMPO en pHrodo™ Red Transferrine Conjugaat door Confocale Microscopie

PDMPO Studie

1 × 10⁵ HepG-2 cellen werden gekweekt op steriele confocale platen overnachten en de BPSi nanopartikels werden gevoed met een concentratie van 100 μg/mL. De volgende dag, vóór immunofluorescence kleuring, werden de objectglazen driemaal gewassen met 0,01 M fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS), pH 7,4, toen werd 1 μM PDMPO kleurstof (Ex/Em = 329/440) toegevoegd. Na wassen met PBS voor drie keer, werden cellen geïnculeerd met vers RPMI-1640 cultuurmedium en geobserveerd onder een fluorescente microscoop (Nikon A1R, Japan) met een CCD camera en foto's genomen binnen 5 min, en de verhouding van blauwe en groene fluorescentie-intensiteit in de lysosomen werd dan berekend volgens de procedure van Chen et al. [19].

pHrodo™ Red Transferrine Conjugaat Studie

HepG-2 cellen werden geplateerd in confocale platen op dezelfde manier voor celhechting gedurende 24 u, dan werden platen op ijs gehouden voor 10 min. Cellen wassen met koude Live Cell Imaging Oplossing bevattende 20 mM glucose en 1% BSA. Toevoegen pHrodo™ Red Transferrine conjugaat (Ex/Em = 560/585 nm) bij 25 μg/mL in Live Cell Imaging Oplossing en incuberen bij 37 °C gedurende 20 min, dan cellen wassen in Live Cell Imaging Oplossing. De observatie werd ook uitgevoerd door confocale microscopie. De kwantitatieve analyse van de intensiteit van de microscopie-afbeeldingen werd uitgevoerd door ImageJ software.

Detectie van Cel Lysosomale pH

De cellen A549, HepG-2, HCT8, HCT15, HCT116, en B16 werden gekweekt in een 75 cm² cultuurfles en gevoed met NPs toen de cellen waren geprolifereerd tot 70% van de cultuurfles, en 6 u later, werden de cellen verzameld. De cellen werden herhaaldelijk bevroren en ontdooid om de MB in de cellen volledig vrij te maken. De celllyzaten werden gecentrifugeerd bij 12000 t/min gedurende 10 min. De supernatans werd verkregen en de absorptie ervan bij 660 nm gemeten om de totale hoeveelheid vrijgegeven MB te berekenen. De absorptie van de NPs_6,0/100 bij een standaard pH werd vergeleken om de pH-waarde van elke cel te verkrijgen.

Statistische Analyse

Statistische analyse werd uitgevoerd met de SPSS15.0 software door een twee-manier analyse van variantie (ANOVA) te gebruiken voor onafhankelijke groepen en de Tukey HSD methode te gebruiken voor meervoudige vergelijkingstest. Statistische significantie was gebaseerd op een waarde van P < 0,05.

Resultaten en Discussie

We detecteerden eerst differentiele genexpressie toen cellen gevoed werden met de dubbele PEG-functionele zwarte poreuze silica nanopartikels (BPSi NPs) (aangeboden door ons samenwerkende lab [12]). De verandering van de zetapotentieel van − 18,5 tot + 2,8 mV gaf ook aan dat de oppervlakte dubbele-PEGylatie succesvol was (Fig. S1a). De gemiddelde diameter van BPSi nanopartikels was 156 nm (Fig. S1b). Gebaseerd op de cluster heatmap van differentiele genexpressie (Fig. S2), selecteerden we meer dan 2-voudige differentiele genexpressies voor verder onderzoek. Go en KEGG werd geïntroduceerd om de differentiele genen te analyseren. Uit de Go verrijkingsbelletjeskaarten (Fig. 1a), werden de metabolische en lysosoom-geassocieerde genen waaronder fagolysosomale assemble, fagocytose, en xenobiotisch metabolisch proces geselecteerd voor verdere analyse. Opvallend, TFEB-CLEAR [17]-geassocieerde genexpressies waren significant toegenomen. De RT-PCR resultaten (Fig. 1b) verifieerden ook de gensequentieresultaten, de genen op TFEB-het gecoördineerde lysosomale expressie, en regulatie (CLEAR) pad namen aanzienlijk toe, zoals CTSD, CTSF, TFEB, MFN1, LAMP2, en TPP1. Deze genen zijn gemarkeerd op het lysosoompad, zoals getoond in Fig. S3. Hun expressie is hoger dan die van de controlegroep en heeft statistische significantie (P_{BPSi VS Controle} < 0,05). En TFEB reguleert positief de expressie van lysosomale genen, controleert de lysosoompopulatie, en bevordert de cellulaire degradatie van lysosomale substraten.

Autofagie is geactiveerd in HepG-2 cellen na het voeren van BPSi. a GO verrijkingsbelletjeskaart van de differentieel geëxprimeerde genen gevonden door transcriptoom sequentie. b Verificatie van genveranderingen in het TFEB-CLEAR gennetwerk na BPSi behandeling door RT-qPCR experimenten. c P62, TFEB, LC3B II/I eiwitexpressie na BPSi-behandeld. d Genormaliseerde bandgrijsintensiteit van P62, TFEB, LC3B II/I eiwit in BPSi-behandelde groepen volgens de controlegroep. Data werd gepresenteerd als gemiddelde ± S.D.

Daarnaast reguleert TFEB autofagie, en de overexpressie ervan leidt tot een significante toename in autofagoomproductie in gecultureerde cellen door het feit dat de belangrijkste functie van TFEB gen is om de biosynthese van lysosoom te induceren en de voorkoming van autofagie te bevorderen [20]. Western blot analyse werd ook ingezet om te testen of autofagie plaatsvond toen cellen gevoed werden met BPSi NPs. Het doel van de Western test was om verder te bevestigen dat de expressie van TFEB toegenomen was en het optreden van celautofagie na BPSi voeren. De LC3B en P62 eiwritten zijn beide autofagiemarkers. Wanneer autofagie plaatsvindt, neemt de expressie van microtubuul-geassocieerd eiwit 1A/1B-licht ketting 3B (LC3B) II/I toe. p62 is een receptor voor vesikels die zullen worden afgebroken door autofagie en is ook een receptor voor geübiquitineerde eiwitaggregaten om te worden opgeruimd, en de expressie ervan neemt af wanneer autofagie plaatsvindt. Dus we meetten de expressie van deze eiwritten in het Western experiment.

Uit de Western blot resultaten getoond in Fig. 1c, d, TFEB (P_{80 μg/ml VS controle} = 0,000008), LC3B II/I (P_{80 μg/ml VS controle} = 0,000297), en p62 (P_{80 μg/ml VS controle} = 0,000016) eiwritten waren alle significant opgereguleerd. Aangezien de opregulatie van TFEB en LC3B II/I eiwritten het activeren van autofagie aangeeft [18], verdenken we dat de BPSi endocytose het optreden van autofagie bevordert. Echter, het p62 eiwit zou tijdens het autofagieproces afgereguleerd moeten zijn, door de drager-eiwitaard die de endosomen naar lysosomen brengt en uiteindelijk afgebroken wordt. In onze studie, gaf de significante opregulatie van p62 de beëindiging van degradatie tijdens het endo-lysosoomfusieproces aan [21], wat waarschijnlijk veroorzaakt werd door pH-toename in endo/lysosoom vesikels. Dus, de BPSi endocytose kan eerst het optreden van autofagie induceren, dan het autofagieproces remmen door de endo/lysosomale pH-waarden te verhogen, dankzij zijn amide alcaliniteit.

Om de pH-toenamekenmerken in endo/lysosomen door BPSi endocytose te testen, werden twee commerciële pH-fluorescente probes in onze studie ingezet, pHrodo™ Red Transferrine Conjugaat (Thermo Fisher ^#P35376), en RatioWorks™ PDMPO.

pHrodo™ Red als commerciële intracellulaire pH-indicator presenteert meestal zwak fluorescent bij neutrale pH maar toenemende fluorescentie naarmate de pH daalt. Het was bedoeld om cellulair cytosool pH te kwantificeren in het bereik van 9–4 met een pKa van ~ 6,5 met excitatie/emissie van 560/585 nm. We konden een kwalitatieve analyseconclusie verkrijgen van 6 cellijnbepalingen dat de endocytose van BPSi NPs de capaciteit heeft om de pH-waarden in endo/lysosomen te verhogen, door het verzwakken van rode fluorescente signalen (Fig. S4 en S5). Echter, na het herhalen van de experimenten meerdere keren volgens de productbedieningsprotocollen, konden we nauwelijks kwantitatief de exacte pH-waarde die afnam onder verschillende cellijnen voor of na voeren met BPSi NPs analyseren vanwege het niet hebben van correlatie tussen intensiteit en de pH-waarden gevestigd.

PDMPO werd dan ingezet als een betere oplossing voor het aangeven van de pH-waardeveranderingen na BPSi endocytose, wat verhoudingsimagingtechnieken introduceert in pH-kwantitatieve meting. PDMPO [2-(4-pyridyl)-5-((4-(2-dimethylaminoethy-laminocarbamoyl) methoxy) fenyl) oxazol] wordt gekarakteriseerd als zuurgestelde dual-excitatie en dual-emissie pH-probe. Het emitteert intense groene fluorescentie bij lagere pH en geeft intense blauwe fluorescentie bij hogere pH. Deze unieke pH-afhankelijke fluorescentie maakt PDMPO een ideale pH-probe voor zuurgeorganellen (zoals lysosomen) met pKa = 4,47. PDMPO labelt selectief zuurgeorganellen (zoals lysosomen) van levende cellen en de twee distincte emissiepieken kunnen worden gebruikt om de pH-fluctuaties van levende cellen in verhoudingsmetingen te monitoren. Echter, we faalden nog steeds in het meten van de pH-waarden in 6 cellijnen voor en na BPSi voeren. Zoals de resultaten getoond in Fig. S6, werden geen significante verschillen waargenomen in alle 6 cellijnen voor en na BPSi voeren. Hoewel een correlatie is gevestigd tussen de Blauw/Groen Verhouding en de pH-waarden (Fig. S7), maakt de niet-lineaire correlatie van pH 4–5 de PDMPO-methode mislukken in kwantitatieve analyse van endo/lysosomen voor en na BPSi voeringen.

Uit de data van de twee commerciële pH-indicatoren hierboven, hebben we eerst ons vermoeden gedemonstreerd dat PEG-gedecoreerde nanopartikels met amide op de PEG-keten de endo/lysosomale pH kunnen laten stijgen door de alcalische aard van amide. Echter, zonder de kwantitatieve analyse van precieze pH-veranderingen (0,1 pH bereik), kunnen we nog steeds de correlaties tussen de autofagiestatus en de endo/lysosomale pH-waarden niet vestigen, dus mislukken in autofagievoorspelling.

Gebaseerd op onze vorige studie over zelf-ontbindende nanopartikels [13, 14] [15, 22], hielden we dezelfde concentratie ammoniumhydroxide in 75% ethanol, maar pasten we de MB en TEOS concentraties aan. Twee series TEOS hoeveelheid zijn ingesteld als 100 μL en 80 μL, om verschillende schildikte en poriegrootte te verkrijgen. Tien series MB hoeveelheid zijn ingesteld om verschillende groottes van de centraal-holle structuur en MB laadefficiënties te verkrijgen.

De MB en TEOS hoeveelheden toegevoegd in de protocollen waren als beschreven in Tabel 1 hieronder.

Zoals getoond in Fig. 2a, b, nam de nanopartikelsgrootte toe met de toename van de MB hoeveelheid, in beide TEOS concentraties (100 μL en 80 μL). Bij dezelfde MB concentratie, nam de deeltjesgrootte toe met de toename van TEOS hoeveelheid. Bovendien, met de toename van de TEOS hoeveelheid, groeide de schildikte op, wat is bewzen door de elementkartering (getoond als Fig. 2c). De polyverspreidingsindex (PDI) en oppervlaktelading van de nanopartikels worden getoond in Fig. S8 en Tabel S1. De morfologiestudies voorspelden dat met de toename van MB hoeveelheid, de laadefficiëntie zal opschieten, wat leidt tot snellere vrijgaveprofiel, terwijl met de toename van TEOS hoeveelheid, de vrijgave vertraagd zal worden. En we moeten de geschikte MB en TEOS concentratie vinden, waarmee we het geoptimaliseerde nanopartikelsysteem kunnen verkrijgen, dat we in staat kunnen stellen het MB-vrijgaveprofiel lineair gecorreleerd te maken met de pH-veranderingen.

Morfologiekarakterisering van 10 verschillende zelf-ontbindende nanopartikels met specifieke MB of TEOS hoeveelheid. a STEM figuren. b Nanopartikelsgrootteverdelingsanalyse. c Si-kartering van 10 zelf-ontbindende nanopartikels. Schaalbalken in alle figuren zijn 100 nm. De grootteverdelingsanalyse werd uitgevoerd door willekeurig gekozen 100 nanopartikels uit STEM figuren en gemeten door ImageJ software. Data werd gepresenteerd als gemiddelde ± S.D.

De MB laadefficiëntie werd bepaald door UV-Vis spectrum. De standaardkromme (Fig. S9) van MB werd eerst getekend met behulp van series concentraties van MB oplossing (van 6,25 tot 46,88 μg/mL), met de vergelijking als y = 67,63x + 0,10919, R² = 0,9987. Berekend met de bovenstaande vergelijking, verkrijgen we MB laadefficiëntie van 10 zelf-ontbindende nanopartikels met specifieke parameters, gedetailleerde data getoond in Fig. S10.

Vóór de studie van de MB-vrijgaveprofielen in verschillende pH-oplossingen, zijn de vrijgaveprofielen in zuiver water bestudeerd. Zoals getoond in Fig. S11 en Fig. S12, presenteerden alle nanopartikels met TEOS hoeveelheid van 80 μL verhoogde MB-vrijgave samen met de duurtoename, wat weerspiegeld werd door de UV–Vis absorptie. Bovendien, met de toegenomen ingekapselde MB hoeveelheid, werd de groeitrend van MB-vrijgave significanter. Ook, de vrijgavesnelheid groeit sneller. Echter, als de TEOS hoeveelheid toeneemt tot 100 μL, werd het deeltjesoppervlak meer gedenseerd en de vrijgave wordt langzamer wanneer de MB hoeveelheid onder 3,0 mg; bijna geen toenemetrend kon worden waargenomen in de MB-vrijgave in water gedurende 14 dagen vrijgave. Zolang de MB hoeveelheid toeneemt tot boven 4,0 mg, kon een duidelijke toenemetrend van MB-vrijgave worden waargenomen. Een ding om op te merken is dat de nanopartikelparameter van zowel NPs_7,5/80 en NPs_6,0/100 solide groei presenteerden naarmate de tijd verlengde, bijna een lineaire toenemetrend lieten zien gedurende de eerste 7 dagen, en dan het plateau bereikten.

Vervolgens focussten we op het MB-vrijgavegedrag in verschillende pH-buffers om te achterhalen of zelf-ontbindende nanopartikels met specifieke parameters de lineaire pH-afhankelijke MB-vrijgave konden hebben.

Eerst voerden we de MB-vrijgaveexperimenten uit bij pH 4,0 bufferoplossing. Uit Fig. S13 konden we gemakkelijk de conclusie trekken dat met dezelfde TEOS hoeveelheid van 100 μL, de MB-vrijgavesnelheid een vergelijkbare trend presenteerde werd waargenomen in de 5 nanopartikelsystemen van TEOS bij 80 μL (Fig. S14), de centrale positieve correlatie met de ingekapselde MB hoeveelheid.

Geconcentreerde MB diffuseert in de omringende oplossing via diffusie door concentratieverschil. De grotere concentratiegradiënt maakt de snellere MB-vrijgave. Vergeleken met de MB-vrijgave in zuiver water, vonden we dat de zuur omgeving de vrijgave van MB versnelde (Fig. S13 en S14 vergeleken met Fig. S11 en S12), wat aangeeft dat de MB-vrijgave niet alleen gedreven wordt door diffusie; echter, in zuur oplossingen, is electrostatische afstoting ook een belangrijke dryfkracht door de positieve ladingsaard van MB. We berekenden dan het vrijgavepercentage van elke nanopartikelparameter volgens de MB laadefficiëntie, MB standaardkromme, en de verdunningsverhouding bij metingen. Het vrijgavepercentage weerspiegelde de vrijgavesnelheid van MB in pH 4,0 zuur oplossing, en de resultaten (Fig. 3) toonden aan dat alleen het vrijgavepercentage van NPs_7,5/80 lineaire vrijgave presenteerde in pH 4,0 oplossing. Andere nanopartikelsystemen met specifieke MB en TEOS parameters toonden vergelijkbare vrijgavetrends, en het vrijgavepercentage had geen lineaire groei. Een uitzondering is NPs_6/100, en de MB-vrijgave bereikte het plateau in slechts 72 u; dus was het moeilijk te zeggen of de MB-vrijgave lineair kon groeien vóór die duur in dit stadium.

MB-vrijgavepercentage van 10 series zelf-ontbindende nanopartikels na een specifieke duur in pH 4,0 buffer. Alle experimenten werden drievoudig herhaald, en de data werden getoond als gemiddelde ± S.D.

Tegelijkertijd testten we de MB-vrijgaveprofielen in nabij-neutrale en alkali-buffers (pH 6,86 en pH 9,18). De resultaten in zowel Fig. S15, S16, Fig. S17, en S18 demonstreerden dat de MB-vrijgave vertraagde met de oplossing pH toename tot 6,86; bovendien, met de centrale MB concentratie toegenomen, nam het MB-vrijgavepercentage af. Bij pH 9,18, presenteerden alle nanopartikels met 10 specifieke parameters een zeer trage MB-vrijgave (Fig. S19 en S20); ongeacht in UV–Vis absorptie of het vrijgavepercentage, was de trend vergelijkbaar met die in pH 6,86 buffer, maar met nog lagere vrijgavepercentage. Dus, het was duidelijk dat de zelf-ontbindende nanopartikels alleen MB-vrijgave lineaire groei presenteerden in zuur oplossingen. We dachten terug aan de endo/lysosomen pH, van 4 tot 5, wat precies het pH-bereik is van MB lineaire groei als functie van tijd in een specifieke MB/TEOS parameter. Dus, we kregen meer vertrouwen dat het zelf-ontbindende nanopartikelsysteem een accurate meetinstrument kan zijn voor kwantitatief bepalen van de endo/lysosomale gemiddelde pH, dan bewijs leveren over de exacte pH-waarde van autofagiestatus.

De colocalisatie van de nanopartikels in de endo/lysosomen door cel TEM-studie en de MB-vrijgave in 6 verschillende cellijnen werden bestudeerd. Uit de cel TEM-resultaten bleven alle 10 series nanopartikels in de endo/lysosomen zonder te ontsnappen, na 24-u incubatie met de HepG-2 cellen (Fig. 4). Aangezien de diameter van HepG2 cellen gebruikt in Fig. 4 ongeveer 10–20 μm is en de diameter van MB@SiO₂ nanopartikels tussen 75 en 200 nm ligt, zal het heel moeilijk zijn om de nanopartikelsmorfologieën te verduidelijken met de afbeeldingen met lage vergroting (zoals getoond in Fig. S21). We onderzochten ook de intracellulaire locatie van de nanopartikels in de andere 5 cellijnen, en 4 nanopartikels werden willekeurig geselecteerd om te demonstreren dat de nanopartikels vastzaten in de endo/lysosomen (Fig. S22). De nanopartikels met alle parameters toonden een centrale holle structuur in alle andere 5 cellijnen na 24-u incubatie, wat de MB-vrijgave aangeeft. Bovendien, onder meer nauwkeurige observatie, merkten we op dat de MB-vrijgave verschillend kan zijn door verschillende holle groottes, wat wijst op het feit dat (1) de endo/lysosomale pH in verschillende cellen verschillend is en (2) de MB-vrijgave van de nanopartikels zeer gevoelig is voor de endo/lysosomale pH, met name voor de NPs_6/100 en NPs_7,5/80. Uit Fig. S23 kunnen we zien dat de nanopartikels de endocytose al gerealiseerd hadden en in de vesikels bleven 2 u na nanopartikelvoeren, daarna accumuleerden de nanopartikels geleidelijk in lysosomen.

De colocalisatie van de nanopartikels in de endo/lysosomen door cel TEM-studie na 12 en 24 u incubatie met de 10 series nanopartikels. De schaalbalk is 200 nm in de TEM-afbeeldingen

We evalueerden dan de correlatie tussen de pH-waarden en de OD-waarden in pH 4,0–4,8. Uit de resultaten in Fig. 5 en Fig. S24, voor NPs_6/100 en NPs_7,5/80 nanopartikelsystemen, presenteerde de MB-vrijgave een lineaire afname als functie van pH in het pH-bereik van 4,0 tot 4,8.

MB-vrijgave als functie van pH-waarden in NPs6/100 en NPs7.5/80 na specifieke incubatieduur, 6 u, 12 u, en 24 u. De lineaire correlatievergelijkingen werden ook berekend voor 6 u en 12 u voor MB-vrijgave van zowel NPs6/100 en NPs 7.5/80 als functie van pH-waarden. Alle experimenten werden drievoudig uitgevoerd, en de data werden getoond als gemiddelde ± S.D.

We converterden dan de OD-waarde naar het MB-vrijgavepercentage volgens de MB laadefficiëntie en voerhoeveelheid. Zoals getoond in Fig. S25, in de eerste 6 u, presenteerde het MB-vrijgavepercentage in NPs_6/100 en NPs_7,5/80 nanopartikelsystemen ook als functie van pH-waarden. We berekenden dan de residuele som van kwadraten en Pearson's correlatiecoëfficiënt bij 6 u en 12 u vrijgaveduur, respectievelijk, aangezien de residuele som van kwadraten een negatieve correlatie vertoont met nauwkeurigheid van lineaire fitting, terwijl de absoluutwaarde van Pearson's correlatiecoëfficiënt dichter bij 1, hoe lineairder het is. Zoals getoond in Tabel S2 en S3, is de hoogste graad van lineariteit de fitting van NPs_6,0/100 nanopartikelsystemen, gevolgd door die van NPs_7,5/80 bij 6 u vrijgave.

Tot dan waren we zo opgewonden door de resultaten dat de methode voor het precies monitoren van de pH-waarden is gevestigd, met name met de nauwkeurigheid kleiner dan of gelijk aan 0,1 pH-waarde interval. Dat betekent, we hebben grote mogelijkheden om de correlatie tussen endo/lysosomale pH-waarden en de autofagiestatus te achterhalen, wat van groot belang is voor beter bestuderen van het autofagiemechanisme en voorspellen van het autofagieproces. Zoals we kunnen zien in Fig. S26, de MB-vrijgave in HepG-2 cellen had al het plateau bereikt na incubatie gedurende 4 u. Dus, we kozen 6 u als observatietijdstip.

We onderzochten dan zorgvuldig de MB-vrijgave van NPs_6,0/100 in 6 cellijnen in de nanopartikel-cel interactieduur van 6 u, inclusief leverkanker HepG-2 cellijn, darmkanker HCT8, HCT 15, en HCT 116 cellijnen, longkanker A549 cellijn, en myomelano cytair kanker B16 cellijn.

Zoals getoond in Tabel 2, differentiëren we duidelijk de endo/lysosomen in 6 kankercellijnen, met de nauwkeurigheid op 0,01 pH-waarden, wat onmogelijk is te doen met de commerciële intraoculaire pH-indicatorkits.

Bovendien, herëvalueerden we pH-waarden in endo/lysosomen van de HepG2 cellen voor en na cultuur met BPSi nanopartikels. We bereikten de conclusie dat BPSi opname de endo/lysosomale pH-waarden significant verhoogt, van 4,70 ± 0,09 tot 5,59 ± 0,05, perfect illustrerend de reden voor BPsi opname geïnduceerde autofagie initieel dan beëindigde de autofagieflux. De intracellulaire opname van BPSi maakt de hoeveelheden van de endo/lysosomen toegenomen, wat consistent was met de resultaten van gensequentie, dat autofagie-gerelateerde genen (TFEB-CLEAR) geactiveerd waren. Tegelijkertijd, de autofagiebeëindiging door de verhoogde pH-waarden in endo/lysosomen coincideert ook met de resultaten van p62 eiwit opregulatie in Western blot studie.

Discussie

Nanopartikels kunnen doorgaans autofagie in cellen veroorzaken [23], en studies hebben getoond dat de autofagierespons op nanopartikels die een neutraal of anionisch oppervlak presenteren, betrekking heeft op verbeterde opruiming van autofagielading. Cellexpositie aan nanopartikels die een kationisch oppervlak presenteren, aan de andere kant, resulteert in transcriptionele uprregulatie van het TFEB-pad, maar veroorzaakt ook lysosomale dysfunctie, wat uiteindelijk resulteert in blokkade van autofagische flux [7]. En onze resultaten zijn in overeenstemming met deze eerdere conclusies. In onze studie vonden we dat de expressie van autofagie-gerelateerde genen en eiwritten in HepG2 cellen is toegenomen na voeren van BPSi nanopartikels door transcriptoom sequentie, RT-qPCR, en Western experimenten. Echter, het expressieniveau van autofagie-gerelateerd P62 eiwit daalt niet als de autofagie geactiveerd is. We vermoeden dat de PEG-amine op het oppervlak van BPSi nanopartikels de pH-waarde van het lysosoom verhoogt, wat resulteert in inhibitie van P62 degradatie. Bestaande lysosomale pH-indicatoren kunnen onze gok niet verifiëren. Om de lysosomale pH van levende cellen nauwkeurig te meten, hebben we een nieuwe methode voor endo/lysosomen pH kwalitatieve bepaling gevestigd gebaseerd op zelf-ontbindende nanopartikelsystemen. Tien nanopartikelsystemen met specifieke MB/TEOS parameters werden ingezet voor het verkrijgen van geoptimaliseerde pH gevoelig responsieve meetmethode. De radiale MB-concentratiegradiënt van binnen naar buiten diende als een belangrijke dryfkracht voor MB-vrijgave. De medicijnvrijgave verliep met gelijktijdige dragerontbinding, wat gedreven werd door een diffusie-gecontroleerd mechanisme. Bovendien, naarmate de pH-waarde daalt, neemt de waterstofionenconcentratie toe, en de versterkte electrostatische interactie bevordert binnenste MB sneller vrij te maken dan in neutrale oplossing [24]. Het geoptimaliseerde centrale holle nanopartikelsysteem kon de gecentraliseerde geconcentreerde MB vrijgeven als lineaire functie van precieze pH-waarden in het bereik van pH 4,0–4,8, wat precies de pH van lysosomen is. Uiteindelijk, door deze kwalitatieve pH-indicator gebaseerd op zelf-ontbindende nanopartikels, hebben we geslaagd in de detectie van de gemiddelde pH-waarden van lysosomen in 6 cellijnen. Bovendien, met dit systeem, kunnen we kwalitatief de pH-veranderingen van lysosomen differentiëren voor en na BPSi nanopartikeleendocytose door HepG-2 cellen, wat het mechanisme van het optreden en dan beëindiging van autofagie na BPSi endocytose verduidelijkt. De zelf-ontbindende nanopartikelsystemen banen een compleet nieuwe weg voor het bestuderen van de luminale pH-waarden, bieden nieuwe tools om de celsignalisering en metabolisme beter te kennen, en bieden dan nieuwe manieren en methoden voor de behandeling van kanker [25, 26].

Conclusie

In deze studie vonden we dat BPSi celautofagie kan bevorderen door transcriptoom sequentie, maar de aminogroepen op het oppervlak van de nanopartikels de pH van het lysosoom kunnen verhogen en de degradatie van autofagische flux kunnen remmen. Dus, de lysosomale pH beïnvloedt de autofagiestages aanzienlijk. En het precies verkrijgen van de informatie van lysosomale pH zal het waarnemen van autofagie bevorderen. Echter, de bestaande fluorescente lysosomale pH-indicatoren konden alleen een wijd bereik van lysosomale pH bepalen; dus, hebben we een precieze lysosomale pH-indicator gevestigd gebaseerd op het zelf-dissociatie systeem. Door de syntheseparameters van MB@SiO₂ aan te passen, was de vrijgave van MB geladen op de nanopartikels lineair en negatief gecorreleerd met pH. En de nanopartikels blijven voornamelijk in het lysosoom na het binnengaan van de cel. Door de hoeveelheid MB vrijgegeven in de cellen te meten, kan de pH-waarde van het lysosoom precies berekend worden volgens de lineaire functie. De gevestigde precieze pH-indicator bood een volledig nieuw instrument en methodologie om de lysosomale pH-waarden precies te bestuderen en verder meer informatie over autofagie te verkrijgen.

Beschikbaarheid van Gegevens en Materialen

Alle gegenereerde of geanalyseerde gegevens tijdens deze studie zijn opgenomen in dit gepubliceerde artikel en de bijbehorende supplementaire informatiebestanden.

Afkortingen

BPSi:

Zwarte mesoporeuze silicium

FBS:

Foetaal kalfserum

GO:

Genontologie

HCl:

Zoutzuur

KEGG:

Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes

MB:

Methylene blauw

NaBr:

Natriumbromide

NaSi:

Natriumsilicide

NH4Br:

Ammoniumbromide

NPs:

Nanopartikels

OD:

Optische dichtheid

PBS:

Fosfaat-gebufferde zoutoplossing

PDMPO:

2-(4-Pyridyl)-5-((4-(2-dimethylaminoethy- laminocarbamoyl) methoxy) fenyl) oxazol

RT-qPCR:

Reverse transcriptie kwantitatieve polymerase ketting reactie

TEOS:

Tetraethylorthosilicaat