De oprichting en toepassingsstudies over nauwkeurige lysosoom pH-indicatoren op basis van zelfafbreekbare nanodeeltjes

Resultaten en discussie

We hebben eerst differentiële genexpressie gedetecteerd toen cellen werden gevoed met de dubbele PEG-functionele zwarte poreuze silica-nanodeeltjes (BPSi NP's) (aangeboden door ons samenwerkende laboratorium [12]). De verandering van het zeta-potentieel van -18.5 naar +-2,8 mV gaf ook aan dat de dual-PEGylering aan het oppervlak succesvol was (Fig. S1a). De gemiddelde diameter van BPSi-nanodeeltjes was 156 nm (Fig. S1b). Op basis van de clusterhittekaart van differentiële genexpressie (Fig. S2) hebben we meer dan 2-voudige differentiële genexpressies geselecteerd voor verder onderzoek. Go en KEGG werden geïntroduceerd om de differentiële genen te analyseren. Uit de Go-verrijkingsbubbelkaarten (figuur 1a) werden de metabole en lysosoom-geassocieerde genen, waaronder fagolysosoomassemblage, fagocytose en xenobiotisch metabolisch proces, geselecteerd voor verdere analyse. Met name TFEB-CLEAR [17]-geassocieerde genexpressies waren significant verhoogd. De RT-PCR-resultaten (Fig. 1b) verifieerden ook de gensequencing-resultaten, de genen op TFEB - de gecoördineerde lysosomale expressie en de regulatie (CLEAR) -route namen significant toe, zoals CTSD, CTSF, TFEB, MFN1, LAMP2 en TPP1 . Deze genen zijn gemarkeerd op de lysosoomroute, zoals weergegeven in Fig. S3. Hun expressie is hoger dan die van de controlegroep en heeft statistische significantie (P _{BPSi VS-besturing} <0,05). En TFEB reguleert positief de expressie van lysosomale genen, controleert de lysosoompopulatie en bevordert cellulaire afbraak van lysosomale substraten.

Autofagie wordt geactiveerd in HepG-2-cellen na het voeden van BPSi. een GO-verrijkingsbubbelkaart van de differentieel tot expressie gebrachte genen gevonden door transcriptoomsequencing. b Verificatie van genveranderingen in het TFEB-CLEAR-gennetwerk nadat BPSi is behandeld met RT-qPCT-experimenten. c P62, TFEB, LC3B II/I-eiwitexpressie na behandeling met BPSi. d Genormaliseerde bandgrijsintensiteit van P62, TFEB, LC3B II/I-eiwit in met BPSi behandelde groepen volgens de controlegroep. Gegevens werden weergegeven als gemiddelde ± SD.

Bovendien reguleert TFEB autofagie, en de overexpressie ervan leidt tot een significante toename van de autofagosoomproductie in gekweekte cellen vanwege het feit dat de belangrijkste functie van het TFEB-gen is om de biosynthese van lysosoom te induceren en het optreden van autofagie te bevorderen [20]. Western-blot-analyse werd ook gebruikt om te getuigen of de autofagie plaatsvond wanneer cellen werden gevoed met BPSi-NP's. Het doel van de Western-test was om verder te bevestigen dat de expressie van TFEB was verhoogd en het optreden van celautofagie na BPSi-voeding. De LC3B- en P62-eiwitten zijn beide autofagiemarkers. Wanneer autofagie optreedt, neemt de expressie van microtubule-geassocieerd eiwit 1A/1B-lichte keten 3B (LC3B) II/I toe. p62 is een receptor voor blaasjes die door autofagie worden afgebroken en is ook een receptor voor ubiquitinated eiwitaggregaten die moeten worden geklaard, en de expressie ervan neemt af wanneer autofagie optreedt. Dus meten we de expressie van deze eiwitten in het westerse experiment.

Van de Western-blot-resultaten getoond in Fig. 1c, d, TFEB (P _{80 μg/ml VS-controle} = 0,000008), LC3B II/I (P _{80 μg/ml VS-controle} = 0.000297), en p62 (P _{80 μg/ml VS-controle} = 0,000016) eiwitten waren allemaal significant opgereguleerd. Omdat de opregulatie van TFEB- en LC3B II / I-eiwitten de activering van autofagie [18] aangeeft, vermoedden we dat de BPSi-endocytose het optreden van autofagie bevordert. Er wordt echter verondersteld dat het p62-eiwit wordt gedownreguleerd tijdens het autofagieproces, vanwege de aard van het dragereiwit dat de endosomen naar lysosomen bracht en uiteindelijk degradeerde. In onze studie duidde de significante opregulatie van p62 op de beëindiging van degradatie tijdens het endo-lysosoomfusieproces [21], wat waarschijnlijk werd veroorzaakt door een verhoging van de pH in endo-lysosoomblaasjes. De BPSi-endocytose kan dus eerst het optreden van autofagie induceren en vervolgens het autofagieproces remmen door de endo/lysosoom-pH-waarden te verhogen, vanwege de amide-alkaliteit ervan.

Om de kenmerken van pH-verhoging in endo/lysosomen door BPSi-endocytose aan te tonen, werden in ons onderzoek twee commerciële pH-fluorescerende sondes gebruikt, pHrodo™ Red Transferrin Conjugate (Thermo Fisher ^# P35376) en RatioWorks™ PDMPO.

pHrodo™ Rood als commerciële intracellulaire pH-indicator is gewoonlijk zwak fluorescerend bij een neutrale pH, maar neemt toe als de pH daalt. Het moest de cellulaire cytosolische pH kwantificeren in het bereik van 9-4 met een pKa van ~ -6.5 met excitatie / emissie van 560/585 nm. We konden een kwalitatieve analyseconclusie verkrijgen uit 6 cellijnbepalingen dat de endocytose van BPSi NP's het vermogen heeft om de pH-waarden in endo / lysosomen te verhogen, vanwege de verzwakkende rode fluorescerende signalen (Fig. S4 en S5). Nadat we de experimenten echter verschillende keren hadden herhaald volgens de productbewerkingsprotocollen, analyseerden we nauwelijks kwantitatief de exacte pH-waarde die daalde tussen verschillende cellijnen voor of na het voeden met BPSi NP's omdat er geen correlatie was tussen intensiteit en de vastgestelde pH-waarden.

PDMPO werd vervolgens gebruikt als een betere oplossing voor het aangeven van de pH-waardeveranderingen na BPSi-endocytose, die ratio-beeldvormingstechnieken introduceren bij kwantitatieve pH-meting. PDMPO [2-(4-pyridyl)-5-((4-(2-dimethylaminoëthy-laminocarbamoyl)methoxy)fenyl)oxazool] wordt gekarakteriseerd als acidotrope pH-probe met dubbele excitatie en dubbele emissie. Het straalt intense groene fluorescentie uit bij lagere pH en geeft intense blauwe fluorescentie bij hogere pH. Deze unieke pH-afhankelijke fluorescentie maakt PDMPO een ideale pH-sonde voor zure organellen met pKa = 4.47. PDMPO labelt selectief zure organellen (zoals lysosomen) van levende cellen en de twee verschillende emissiepieken kunnen worden gebruikt om de pH-fluctuaties van levende cellen in verhoudingsmetingen te controleren. We slaagden er echter nog steeds niet in om de pH-waarden te meten in 6 cellijnen voor en na BPSi-voeding. Zoals de resultaten getoond in Fig. S6, werden er geen significante verschillen waargenomen in alle 6 cellijnen voor en na BPSi-voeding. Hoewel er een correlatie is vastgesteld tussen de blauw / groene verhouding en de pH-waarden (Fig. S7), zorgt de niet-lineaire correlatie van pH  4-5 ervoor dat de PDMPO-methode faalde in kwantitatieve analyse van endo / lysosomen voor en na BPSi-voedingen.

Uit de gegevens van twee commerciële pH-indicatoren hierboven, hebben we eerst onze vermoeden aangetoond dat met PEG versierde nanodeeltjes met amide op de PEG-keten de endo/lysosoom-pH zouden kunnen verhogen vanwege de alkalische aard van amide. Zonder de kwantitatieve analyse van precieze pH-veranderingen (0,1 pH-bereik), kunnen we echter nog steeds de correlaties tussen de autofagiestatus en de endo/lysosoom-pH-waarden niet vaststellen, waardoor de voorspelling van autofagie mislukt.

Op basis van ons eerdere onderzoek naar zelfafbreekbare nanodeeltjes [13, 14] [15, 22], hebben we dezelfde concentratie ammoniumhydroxide in 75% ethanol behouden, maar de MB- en TEOS-concentraties aangepast. Twee series TEOS-hoeveelheden zijn ingesteld op 100 L en 80  μL om verschillende schaaldiktes en poriegroottes te verkrijgen. Er zijn tien reeksen MB's ingesteld om verschillende maten van de centrum-holle structuur en MB-laadefficiëntie te verkrijgen.

De MB- en TEOS-hoeveelheden die in de protocollen werden toegevoegd, waren zoals beschreven in tabel 1 hieronder.

Zoals getoond in Fig. 2a, b, nam de grootte van de nanodeeltjes toe met de toename van de MB-hoeveelheid, in beide TEOS-concentraties (100 L en 80 L). Bij dezelfde MB-concentratie nam de deeltjesgrootte toe met de toename van de TEOS-hoeveelheid. Bovendien groeide met de toename van de TEOS-hoeveelheid de schaaldikte, wat is bewezen door de elementmapping (weergegeven als figuur 2c). The polydispersity index (PDI) and surface charge of the nanoparticles are shown in Fig. S8 and Table S1. The morphology studies predicted that with the increase of MB amount, the loading efficiency will grow up, leading to the faster release profile, while with the increase of TEOS amount, the release will slow down. And we need to find out the appropriate MB and TEOS concentration, with which we could obtain the optimized nanoparticle systems, that we may be able to make the MB release profile linear correlated with the pH changes.

Morphology characterization of 10 different self-decomposable nanoparticles with specific MB or TEOS amount. een STEM figures. b Nanoparticle size distribution analysis. c Si mapping of 10 self-decomposable nanoparticles. Scale bars in all figures are 100 nm. The size distribution analysis was performed by randomly chosen 100 nanoparticles from STEM figures and measured by ImageJ software. Data was presented as mean ± S.D.

The MB loading efficiency was determined by UV-Vis spectrum. The standard curve (Fig. S9) of MB was firstly drawn using series concentrations of MB solution (from 6.25 to 46.88 μg/mL), with the equation as y  = 67.63x  + 0.10919, R ²  = 0.9987. As calculated with the equation above, we obtain MB loading efficiency of 10 self-decomposable nanoparticles with specific parameters, detailed data shown in Fig. S10.

Before the study of the MB release profiles in different pH solutions, the release profiles in pure water have been studied. As shown in Fig. S11 and Fig. S12, all the nanoparticles with TEOS amount of 80 μL presented increased MB release along with the duration increase, which was reflected by the UV–Vis absorption. Moreover, with the MB encapsulated amount increase, the growth trend of MB release becomes more significant. Also, the release velocity grows faster. However, as the TEOS amount increase to 100 μL, the particle surface became more densed and the release becomes slower when the MB amount below 3.0 mg; almost no increase trend could be observed in the MB release in water during 14 days of release. As long as the MB amount increases to above 4.0 mg, an obvious increase trend of MB release could be observed. One thing to be noticed is that the nanoparticle parameter of both NPs_7.5/80 and NPs_6.0/100 presented solid growth as the time prolongs, almost showed a linear increase trend during the first 7 days, and then reached the platform.

Then, we focused on the MB release behavior in different pH buffers to figure out whether self-decomposable nanoparticles with specific parameters could have the linear pH-dependent MB release.

Firstly, we carried out the MB release experiments at pH 4.0 buffer solution. From Fig. S13, we could easily reach the conclusion that with the same TEOS amount of 100 μL, the MB release velocity presented a similar trend was observed in the 5 nanoparticle systems of TEOS at 80 μL (Fig. S14), the center positive correlation with the MB encapsulated amount.

Concentrated MB diffuses into the surrounding solution via diffusion due to concentration difference. The bigger concentration gradient makes the faster MB release. Compared with the MB release in pure water, we found that the acidic environment speeded up the release of MB (Fig. S13 and S14 compared with Fig. S11 and S12), indicating that the MB release is not only driven by diffusion; however, in acidic solutions, electrostatic repulsion is also an important driven force due to the positive charge nature of MB. We then calculated the release percentage of each nanoparticle parameter according to the MB loading efficiency, MB standard curve, and the dilution ratio at measurements. The release percentage reflected the release speed of MB in pH 4.0 acidic solution, and the results (Fig. 3) showed that only the release percentage of NPs_7.5/80 presented linear release in pH 4.0 solution. Other nanoparticle systems with specific MB and TEOS parameters showed similar release trends, and the release percentage did not have a linear growth. One exception is NPs_6/100 , and the MB release reached the platform in only 72 h; thus, it was hard to tell whether the MB release could grow linear before that duration at this stage.

MB release percentage of 10 series self-decomposable nanoparticles after a specific duration in pH 4.0 buffer. All experiments were triple repeated, and the data were shown as mean ± S.D.

Meanwhile, we tested the MB release profiles in near-neutral and alkali buffers (pH 6.86 and pH 9.18). The results in both Fig. S15, S16, Fig. S17, and S18 demonstrated that the MB release slowed down with the solution pH increase to 6.86; moreover, with the central MB concentration increased, the MB release percentage decreased. At pH 9.18, all nanoparticles with 10 specific parameters presented a very slow MB release (Fig. S19 and S20); no matter in UV–Vis absorption or the release percentage, the trend was similar with the one in pH 6.86 buffer, but with even lower release percentage. So, it was clear that the self-decomposable nanoparticles only presented MB release linear growth in acidic solutions. We thought back to the endo/lysosomes pH, from 4 to 5, which is exactly the pH range of MB linear growth as a function of time in a specific MB/TEOS parameter. Thus, we get more confident that the self-decomposable nanoparticle system may be an accurate measuring tool for quantitative determining the endo/lysosome average pH, then provide evidence on the exact pH value of autophagy status.

The precondition of using the specific self-decomposable nanoparticles as an endo/lysosome pH indicator is that the nanoparticles stay stable in the endo/lysosome during the whole measurement process. Secondly, the MB release in endo/lysosome should occur smoothly when the measurement carried out.

The colocalization of the nanoparticle in the endo/lysosomes by cell TEM study and the MB release in 6 different cell lines were studied. From the cell TEM results, all of the 10 series nanoparticles stayed in the endo/lysosomes without escaping, after 24-h incubation with the HepG-2 cells (Fig. 4). Since the diameter of HepG2 cells used in Fig. 4 is about 10–20 μm and the diameter of MB@SiO₂ nanoparticles is between 75 and 200 nm, it will be very difficult to clarify the nanoparticle morphologies using the images with low magnification (as shown in Fig. S21). We also investigated the intracellular location of the nanoparticles in the other 5 cell lines, and 4 nanoparticles were randomly selected to demonstrate the nanoparticles were trapped in the endo/lysosomes (Fig. S22). The nanoparticles with all parameters showed a central hollow structure in all other 5 cell lines after 24-h incubation, indicating the MB release. Moreover, under more precise observation, we noticed the MB release may be different due to different hollow sizes, pointing to the fact that (1) the endo/lysosome pH in different cells is different and (2) the MB release from the nanoparticles is very sensitive to the endo/lysosomes pH, especially for the NPs_6/100 and NPs_7.5/80 . From Fig. S23, we can find that nanoparticles have already realized the endocytosis and stayed in the vesicles 2 h after nanoparticle feeding, then nanoparticles gradually accumulated in lysosomes.

The colocalization of the nanoparticle in the endo/lysosomes by cell TEM study after 12 and 24 h incubation with the 10 series nanoparticles. The scale bar is 200 nm in the TEM images

We then evaluated the correlation between the pH values and the OD values in pH 4.0–4.8. From the results in Fig. 5 and Fig. S24, for NPs_6/100 and NPs_7.5/80 nanoparticle systems, the MB release presented a linear decrease as a function of pH in the pH range from 4.0 to 4.8.

MB release as a function of pH values in NPs6/100 and NPs7.5/80 after specific incubation duration, 6 h, 12 h, and 24 h. The linear correlation equations were also calculated for 6 h and 12 h for MB release from both NPs6/100 and NPs 7.5/80 as a function of pH values. All experiments were carried out triplicated, and the data were shown as mean ± S.D.

We then converted the OD value to the MB release percentage according to the MB loading efficiency and feeding amount. As shown in Fig. S25, in the first 6 h, the MB release percentage in NPs_6/100 and NPs_7.5/80 nanoparticle systems also presented as a function of pH values. We then calculated the residual sum of squares and Pearson’s related coefficient at 6 h and 12 h release duration, respectively, as the residual sum of squares present a negative correlation with closeness of linear fitting, while the closer the absolute value of Pearson’s related coefficient to 1, the more linear it is. As shown in Table S2 and S3, the highest degree of linearity is the fitting of NPs_6.0/100 nanoparticle systems, followed by the one of NPs_7.5/80 at 6 h release.

Till then, we were so excited by the results that the method for precisely monitoring the pH values has been established, especially with the accuracy less than or equal to 0.1 pH value interval. That means, we have great possibilities to figure out the correlation between endo/lysosome pH values and the autophagy status, which is of great significance for better studying the autophagy mechanism and predicting the autophagy process. As we can see in Fig. S26, the MB release in HepG-2 cells have already reached the plateau after incubation for 4 h. Thus, we chose 6 h as the observation time point.

We then carefully investigated the MB release of NPs_6.0/100 in 6 cell lines in the nanoparticle cell interaction duration of 6 h, including liver cancer HepG-2 cell line, colon cancer HCT8, HCT 15, and HCT 116 cell lines, lung cancer A549 cell line, and myomelanocytic cancer B16 cell line.

As shown in Table 2, we clearly differentiate the endo/lysosomes in 6 cancer cell lines, with the accuracy at 0.01 pH values, which is impossible to be done with the commercial intraocular pH indicator kits.

Moreover, we re-evaluated pH values in endo/lysosomes of the HepG2 cells before and after cultured with BPSi nanoparticles. We reached the conclusion that BPSi uptake significantly increases the endo/lysosome pH values, from 4.70 ± 0.09 to 5.59 ± 0.05, perfectly illustrating the reason for BPsi uptaken induced the autophagy initially then terminated the autophagy flux. The intracellular uptake of BPSi makes the quantities of the endo/lysosomes increased, which was consistent with the results of gene sequencing, that autophagy-related genes (TFEB-CLEAR) were activated. Meanwhile, the autophagy termination by the increased pH values in endo/lysosomes also coincide with the results of p62 proteins upregulation in Western blot study.