Targeting van de miR-342-5p/Wnt3a As Stabiliseert Atherosclerotische Plaques en Remt Angiogenese in ApoE−/− Muis

Samenvatting

MicroRNA-342-5p (miR-342-5p) is geïmpliceerd in atheroscierose (AS), doch het mechanistische rol blijft onduidelijk. In deze studie onderzochten we hoe miR-342-5p de Wnt3a-seinenroute reguleert en de plaque-kwetsbaarheid en neovascularisatie beïnvloedt in een ApoE−/− muismodel van AS. Vierentwintig-wek-oude mannelijke ApoE−/− muizen werden 16 weken gevoed met een hoogvetdieet om kwetsbare plaques te induceren. miR-342-5p en Wnt3a-expressie werden gekwantificeerd door RT-qPCR en Western blotting. Functionele effecten van miR-342-5p-inhibitie (antagomir) en Wnt3a-over-expressie (oe-Wnt3a vector) werden beoordeeld op serumlipiden, inflammatoire en oxidatieve-stress cytocinen, plaquemorfologie en microvaatdichtheid (MVD). Resultaten onthulden dat miR-342-5p opgereguleerd was terwijl Wnt3a en β-catenine afgereguleerd waren in AS-aorta's, en miR-342-5p direct de 3'-UTR van Wnt3a targette. Antagoniseren van miR-342-5p of over-expressie van Wnt3a verlaagde totaal cholesterol, triglyceriden, LDL-C en pro-inflammatoire cytocinen (IL-5, IL-12p70, IFN-γ, TNF-α), verhoogde HDL-C en SOD-activiteit, verminderde lipide kernoppervlakte, verhoogde collageeninhoud, verlaagde macrofaag-infiltratie en verlaagde MVD. Integenstelling verergerde miR-342-5p-over-expressie al deze parameters. Dus bevordert miR-342-5p plaque-instabiliteit en angiogenese door Wnt3a te reprimeren; herstel van Wnt3a mitigeert deze effecten, wat een therapeutisch doelwit voor AS suggereert.

Inleiding

Atheroscierose (AS) blijft de leidende oorzaak van cardiovasculaire morbiditeit en sterfte wereldwijd. Plaque-destabilisatie – gekenmerkt door lipide, necrotische kernen, dunne vezelkappen, macrofaag-infiltratie en verminderde collageen – leidt tot ruptuur en acute gebeurtenissen. Hoewel lipide-verlagende therapieën resultaten hebben verbeterd, ervaren veel patiënten nog steeds cardiovasculaire gebeurtenissen, wat de noodzaak voor nieuwe moleculaire interventies benadrukt.

MicroRNAs (miRNAs) zijn korte non-coderende RNA's die post-transcriptioneel meerdere doelgenen reguleren. miR-342-5p, gelegen binnen de 14q32 miRNA-cluster, is gerapporteerd om angiogenese te beïnvloeden via TGF-β en VEGF-paden en inflammatoire reacties in vaatziekten te moduleren. Echter, de specifieke rol in AS en interactie met cruciale seinroutes blijven onvolledig gedefinieerd.

De Wnt/β-catenine baan is cruciaal voor vaatcel-homeostase, beïnvloedend gladde-spiercelproliferatie, endotheliale integriteit en plaquesamenstelling. Eerder werk geeft aan dat miR-342-5p Wnt3a negatief reguleert in andere ziektecontexten, wat een potentiële regulatorische as in AS suggereert.

Hier verhelderen we de miR-342-5p/Wnt3a-interactie in AS en evalueren de impact op plaquestabiliteit en angiogenese in ApoE−/− muizen.

Materialen en Methoden

Dieren en Ethiek

Mannelijke ApoE−/− en C57BL/6J muizen (8 weken oud) werden gehuisvest onder een 12 u licht/12 u donker cyclus en gevoed met standaard voer of een hoogvetdieet (20% vet, 0,25% cholesterol) gedurende 16 weken. Alle procedures volgden NIH-richtlijnen en werden goedgekeurd door het Institutionele Dierenexperimentencommissie van Qinghai Provinciale Volksziekenhuis (ethisch nummer 201870726).

Experimenteel Ontwerp

ApoE−/− muizen werden willekeurig toegewezen aan zes groepen (n = 12 elk): AS, NC (zoutoplossing), miR-342-5p agomir, miR-342-5p antagomir, oe-Wnt3a, en miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a. Behandelingen (40 mg/kg, staartvliet) werden tweekelijks gedurende 8 weken toegediend. C57BL/6J muizen dienden als normale controles.

Biochemische Analyses

Serum totaal cholesterol (TC), triglyceriden (TG), LDL-C, HDL-C, malondialdehyde (MDA) en superoxidedismutase (SOD) werden gemeten met commerciële kits (NanJing JianCheng Bioengineering Institute). Cytocinen (IL-5, IL-12p70, IFN-γ, TNF-α) werden gekwantificeerd door ELISA (MultiSciences).

Weefselverwerking

Na 12-u vasten werden muizen geëuthanaseerd; aortae werden gehaald, gewassen in RNA-vrij PBS, en verdeeld voor histologie (HE, Oil Red O, Sirius Red) of moleculaire assays (RT-qPCR, Western blot). Monsters voor histologie werden ingebed in paraffine, gesneden (4 µm), en gekleurd volgens standaardprotocollen.

Genexpressie en Eiwitaanalyse

RT-qPCR kwantificeerde miR-342-5p, Wnt3a, β-catenine en referentiegenen (U6, β-actine) met de 2^−ΔΔCt methode. Western blotting beoordeelde Wnt3a, β-catenine, CD34, α-SMA en β-actine, met ImageJ-densitometrie.

Immunohistochemie

Snitten werden geïmmunogekleurd voor MOMA-2 (macrofalen), α-SMA (gladde-spiercellen) en CD34 (endotheliale cellen). Kleurintensiteit gekwantificeerd via Image Pro Plus 6.0, en de plaque-kwetsbaarheidsindex berekend als (macrofalen + lipide %) / (gladde-spiercellen + collageen %). MVD bepaald door CD34⁺ microvaten/mm² te tellen.

Luciferase Reporter Assay

De Wnt3a 3'-UTR (wild-type en mutante) werd gekloneerd in GP-miRGLO. Muis aortale endotheliale cellen werden gecotransfecteerd met de reporter en variërende concentraties miR-342-5p agomir; luciferase-activiteit gemeten na 48 u.

Statistische Analyse

Data gepresenteerd als gemiddelde ± SD. Twee-groepsvergelijkingen gebruikten ongepaarde t-toetsen; meerdere groepen éénrichtings ANOVA met Tukey post-hoc toetsen. Significantie ingesteld op p < 0,05.

Resultaten

miR-342-5p Is Opgereguleerd en Wnt3a Is Afgereguleerd in AS Aorta's

RT-qPCR toonde een significante toename in miR-342-5p (≈3,5-voudig, p < 0,01) en een gelijktijdige afname in Wnt3a (≈0,4-voudig, p < 0,01) in AS-muizen versus normaal. Western blot bevestigde verminderde Wnt3a en β-catenine eiwitniveaus. Luciferase-assays toonden aan dat miR-342-5p direct bindt aan de Wnt3a 3'-UTR, reporteractiviteit verminderend tot 64% bij 100 pM, een effect opgeheven door muteren van de bindingsplaats.

miR-342-5p Antagomir of Wnt3a Over-expressie Verbeteren Lipideprofielen

miR-342-5p antagomir en oe-Wnt3a verlaagden TC, TG en LDL-C significant (≈30–40% reductie, p < 0,01) en verhoogden HDL-C (≈20% toename, p < 0,05) ten opzichte van AS en NC groepen. miR-342-5p agomir verergerde dyslipidemie. Over-expressie van Wnt3a redde de nadelige effecten van miR-342-5p over-expressie.

Inflammatoire en Oxidatieve Stress Markers Onderdrukt door miR-342-5p Inhibitie

Serum IL-5, IL-12p70, IFN-γ, TNF-α en MDA waren verhoogd in AS-muizen (p < 0,01). miR-342-5p antagomir of oe-Wnt3a verminderden deze cytocinen en MDA met ~40% en verhoogden SOD-activiteit met ~35% (p < 0,01). miR-342-5p agomir versterkte inflammatoire en oxidatieve markers verder.

Plaquemorfologie Verbeterd met miR-342-5p Inhibitie of Wnt3a Over-expressie

HE-kleuring onthulde dat miR-342-5p antagomir en oe-Wnt3a groepen kleinere plaquegebieden, dikke vezelkappen, verminderde lipide kernen en verhoogde collageeninhoud (Sirius Red) vertoonden ten opzichte van AS en NC groepen (p < 0,01). Oil Red O kwantificering bevestigde een ~30% afname in lipide-inhoud in behandelde groepen. De plaque-kwetsbaarheidsindex daalde met 45% in antagomir en oe-Wnt3a groepen, terwijl miR-342-5p agomir het met 60% verhoogde (p < 0,01).

Macrofaag-accumulatie en Gladde-spiercel-aanwezigheid Gemoduleerd

Immunohistochemie toonde aan dat miR-342-5p antagomir en oe-Wnt3a MOMA-2⁺ macrofaag percentages met ~50% verminderden en α-SMA⁺ gladde-spiercellen met ~30% verhoogden ten opzichte van AS en NC groepen (p < 0,01). De gecombineerde miR-342-5p agomir + oe-Wnt3a behandeling herstelde macrofaag- en gladde-spiercelniveaus richting baseline.

Angiogenese Geremd door Targeting van de miR-342-5p/Wnt3a As

CD34-immunokleuring en Western blot toonden aan dat miR-342-5p antagomir en oe-Wnt3a MVD met ~55% verminderden ten opzichte van AS-muizen (p < 0,01). miR-342-5p agomir verhoogde MVD met ~70% (p < 0,01). De gecombineerde behandeling matigde angiogenetische reacties.

Discussie

Onze bevindingen onthullen een eerder ongekende miR-342-5p/Wnt3a-as die lipide-metabolisme, inflammatie, oxidatieve stress, plaquesamenstelling en neovascularisatie in atheroscierose regeert. miR-342-5p opregulatie in AS-aorta's onderdrukt Wnt3a direct, daarmee β-catenine-seinen demping en een kwetsbaar plaque-fenotype bevorderend. Integenstelling herstelt inhibitie van miR-342-5p of herstel van Wnt3a beschermende lipide-profielen, vermindert pro-inflammatoire cytocinen, versterkt antioxidantverdediging, stabiliseert plaquarchitectuur en remt pathologische angiogenese.

Deze resultaten stemmen overeen met rapporten over miR-342-5p-betrokkenheid bij macrofaag-activatie en inflammatie, en met de vastgestelde rol van Wnt-seinen in vaatbiologie. Het therapeutische potentieel van het moduleren van deze as wordt benadrukt door de robuuste omkering van AS-kenmerken waargenomen in vivo.

Conclusie