Herstel van miR-133a-3p of reductie van PSAT1 beperkt endotheelschade-gedreven intracraniële aneurysma door inhibitie van GSK3β/β-catenine route

Samenvatting

De functionele rol van microRNA-133a-3p (miR-133a-3p) in intracraniële aneurysma (IA) is onduidelijk. Deze studie onderzoekt de regulerende rol van miR-133a-3p op vasculaire endotheelschade-geïnduceerd IA via de phosphoserine aminotransferase 1 (PSAT1)/glycogeen synthase kinase 3β (GSK3β)/β-catenine signaleringsroute. Normale intracraniële arteriolen en IA-weefsels werden verzameld van patiënten met hersenletsel en IA. De expressie van miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β en β-catenine in weefsels werd bepaald met RT-qPCR en western blot. Humane IA-endotheelcellen (ECs) werden gekweekt en behandeld met miR-133a-3p mimic en si-PSAT1 om hun functies in EC-migratie, apoptose en proliferatie te bepalen. De expressie van miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, β-catenine, Ki-67, CyclinD1, Bax en Bcl-2 in ECs werd getest met RT-qPCR of western blot. Bovendien werd een IA-rattenmodel opgesteld om pathologische veranderingen en expressie van miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, β-catenine, VEGF en MMP-9 in IA-weefsels in vivo te detecteren. De expressie van miR-133a-3p correleerde met het aantal en de grootte van IA. MiR-133a-3p expressie was verlaagd en PSAT1, GSK3β en β-catenine expressie was verhoogd in IA. Herstel van miR-133a-3p en depletie van PSAT1 verlichtten pathologische veranderingen; verlaagden PSAT1, GSK3β en β-cetenine expressie in IA; onderdrukten apoptose en bevorderden proliferatie en migratie van IA ECs, evenals verminderde VEGF en MMP-9 expressie in IA-weefsels in vivo. Onze studie suggereert dat overexpressie van miR-133a-3p of downregulatie van PSAT1 endotheelschade remt en endotheelcelproliferatie bevordert via inhibitie van de GSK3β/β-catenine route in IA. MiR-133a-3p kan een potentiële biomarker en therapeutisch doelwit zijn voor IA.

Presentatie van de Hypothese

In deze studie veronderstellen we dat de miR-133a-3p/PSAT1-as de endotheelschade-geïnduceerde IA kan beïnvloeden door modulatie van de GSK3β/β-catenine route.

Testen van de Hypothese

Om deze hypothese te verifiëren, verzamelden we klinische monsters, endotheelcellen (ECs) van humane IA, en stelden we IA-rattenmodellen op om de functies van miR-133a-3p en PSAT1 in het IA-proces te verduidelijken.

Implicaties van de Hypothese

Onze studie bevestigt onze hypothese dat overexpressie van miR-133a-3p of downregulatie van PSAT1 endotheelschade remt en endotheelcelproliferatie bevordert via inhibitie van de GSK3β/β-catenine route in IA. Deze bevindingen bieden nieuwe inzichten in een nieuwe doelwittherapie voor IA.

Inleiding

Intracraniële aneurysma (IA) is een cerebrovaculaire aandoening gekenmerkt door een abnormaal uitgebolde hersenarterie en subarachnoïdale bloeding (SAH) door IA-ruptuur, met een hoge sterfte en morbiditeit. Als destructieve ziekte is de pathogenese van IA niet volledig opgehelderd. IA is een zeldzame familiale vorm, maar wordt meestal gezien als het gevolg van verworven vasculaire schade door hypertensie, roken en andere traditionele risicofactoren. Endovasculaire coiling of microchirurgische clipping worden gebruikt om toekomstige ruptuur van ongeruptureerde aneurysma's bij patiënten met hoog rupturrisico te voorkomen. Ondanks significante vooruitgang in IA-chirurgie, is slechte post-operatieve herstel nog steeds aanwezig. De moeilijke behandelingssituatie maakt het nodig om het mechanisme verder te verkennen en een nieuwe therapeutische strategie te vinden.

MicroRNAs (miRNAs) zijn niet-coderende RNAs die de expressie van doegenes reguleren door translatie te remmen op post-transcriptioneel niveau of mRNA-afbraak te mediëren. Het is onthuld dat miR-133a-3p als tumorremmer fungeert in verschillende maligniteiten en overexpressie kan de groei van colorectale kankercellen remmen. Een eerdere studie toonde aan dat miR-133a-3p door blokkade van autofagie-gemedieerde glutaminolyse, maagkankermetastase en -groei onderdrukt. Ook is miR-133a-3p betrokken bij hartontwikkeling en cardiale hypertrofie. Een studie toonde aan dat upregulatie van miR-195-5p angiogenese en cisplatineresistentie in eierstockkanker vermindert via onderdrukking van de PSAT1-afhankelijke GSK3β/β-catenine route. Een andere studie rapporteerde dat miR-365 celdinvasie en -groei in plaveiselcelcarcinoom van de slokdarm (ESCC) onderdrukt via modulatie van PSAT1. PSAT1 is een enzym betrokken bij serinesynthese; oorspronkelijk gezuiverd uit schapenen hersenen en hoog tot expressie in veel weefsels. Gedocumenteerd is dat PSAT1 celcyclusprogressie in borstkanker mediaeert via modulatie van de GSK3β/β-catenine route. Liu et al. wijzen erop dat PSAT1 functioneert in de ontwikkeling van ESCC en slechte overleving voorspelt; het kan een veelbelovend doelwit zijn voor antikankertherapie. Gegeven deze analyses, werd deze studie verwacht bij te dragen aan een nieuwe benadering voor de functionele rol van de miR-133a-3p/PSAT1/GSK3β/β-catenine-as in IA.

Materialen en Methodes

Ethische Verklaring

De studie is goedgekeurd door de Institutionele Review Board van het Eerste Onderwijshospital van de Tianjin Universiteit voor Traditionele Chinese Geneeskunde. Alle deelnemers tekenden een toestemmingsverklaring. Alle dierproeven voldeden aan de Richtlijnen voor de Zorg en Gebruik van Laboratoriumdieren door Internationale Comités.

Studie-onderwerpen

Van januari 2016 tot maart 2018 werden gevallen van SAH door IA behandeld in de neurochirurgie van het Eerste Onderwijshospital van de Tianjin Universiteit voor Traditionele Chinese Geneeskunde geselecteerd. Pathologische monsters van 75 IA-gevallen verkregen door microchirurgie werden verzameld en geclassificeerd als IA-groep, bestaande uit 29 mannen en 46 vrouwen van 31–55 jaar, gemiddelde leeftijd 44,98 ± 6,79 jaar. Patiënten met hersenletsel behandeld in de neurochirurgie op hetzelfde moment in hetzelfde ziekenhuis werden geselecteerd als controlegroep. Ook 75 gevallen van normale intracraniële arteriolenweefsels werden verzameld door traumatische operatie of interne decompressie, bestaande uit 43 mannen en 32 vrouwen van 34–56 jaar, gemiddelde leeftijd 48,14 ± 8,68 jaar. Patiënten met hypertensie, diabetes of tumoren in de anamnese werden uitgesloten. Er was geen significant verschil in geslacht en leeftijd tussen de IA-groep en de controlegroep (beide P > 0,05).

Monsterbehandeling en -behoud

Na chirurgische resectie werden enkele monsters in beide groepen gefixeerd met formaldehyde, gedeshydrateerd met gegraalde alcohol van lage naar hoge concentratie, en in paraffine ingebettet. Vervolgens werden de monsters gesneden voor hematoxyline-eosine (HE) kleuring en immunohistochemische kleuring. Sommige monsters werden snel in vloeibare stikstoftanks geplaatst en daarna overgebracht naar een -80 °C vrieskast voor western blot analyse en reverse transcriptie kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR). Sommige monsters werden gefixeerd met glutaraldehyde voor elektronenmicroscopiewaarneming, en sommige werden gebruikt voor isolatie van ECs.

Elektronenmicroscopiewaarneming

Monsters werden gefixeerd met 3% glutaraldehyde, en vervolgens hergefixeerd met 1% osmiumtetroxide. Monsters werden gedeshydrateerd met aceton, in Epon812 ingebettet, en gesneden in halve-dunne coupes met een dikte van 3 µm. Ten slotte werden de monsters dubbel gekleurd met uranylacetaat en loodcitraat en waargenomen met een H-600IV transmissie-elektronenmicroscoop (Hitachi, Tokio, Japan).

HE-kleuring

De bereide paraffinecoupes werden 30 minuten bij 60 °C gebakken. Na de bovenstaande stappen werden de weefselcoupes in xylene gefixeerd, gedeshydrateerd met gegraalde absolute alcohol, en gewassen met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). De weefselcoupes werden gekleurd met hematoxyline, enkele seconden behandeld met ammonia, gekleurd met eosine voor 2 minuten, gedeshydrateerd, en heldergemaakt. Vervolgens werden de weefselcoupes bedruipt met neutrale gom en gedekt met een dekkersje. Ten slotte werd een microscoop (Nikon, Tokio, Japan) gebruikt voor waarneming en registratie.

Immunohistochemische Kleuring

Immunohistochemie-kit was geproduceerd door Zymed Laboratories (San Francisco, CA, VS). De paraffinecoupes werden ontweekt en gehydrateerd, en de paraffinecoupes werden 3 keer 5 minuten in xylenoplossing gedoopt. De coupes werden 2 keer 3 minuten in 100% absolute alcohol geplaatst en daarna achtereenvolgens 3 minuten in 95–75% alcohol gedoopt. Na ontweken werden de coupes 15 minuten geïncludeerd met 3% waterstofperoxide om de activiteit van endogeen peroxidase te elimineren. De coupes werden bedruipt met blokkeringsoplossing en geïncludeerd met normale geitenzerumwerkoplossing voor 15 minuten, daarna geprobeerd met primaire antilichaam tegen matrix metalloprotease (MMP)-9 (5 µg/mL) en vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) (1:250, Abcam, Cambridge, MA, VS) (PBS voor negatieve controle (NC)) en geïncludeerd voor 1–2 uur. De coupes werden opnieuw geprobeerd met biotinylering secundair antilichaam werkoplossing voor 30–60 minuten. De coupes werden toegevoegd met streptavidine/peroxidase werkvloeistof gelabeld met perioxidase, bedruipt met nieuw bereide diaminobenzidine (DAB) oplossing, tegengekleurd, en geblokkeerd. De beeld werd verkregen door Nikon SPOT FlexTM imaging systeem. Het oppervlak van MMP-9 en VEGF eiwitexpressie werd gemeten door immunohistochemische kwantitatieve analyse software. Vijf willekeurige hoog-vermogen visuele velden werden gedetecteerd in de accumulatiegebied van positieve cellen in elk monster, en de gemiddelde absorbantie van elk scherm werd gebruikt als gemiddelde waarde voor statistische analyse.

Isolatie en Kweek van ECs

De ECs werden geïsoleerd uit normale intracraniële arteriolenweefsels en IA-weefsels en gekweekt. Het weefsel werd in 3 mm² fragmenten gesneden en 25 minuten geïncludeerd in 0,1% collagene B/0,1% dispase (Roche, Basel, Zwitserland). Het weefsel werd losgemaakt, 2 minuten gehomogeniseerd met een 2-mL pipet, en gefilterd door een 100-µm zeef (BD Biosciences, NJ, VS) om ECs te isoleren. Celoplossing gecentrifugeerd en vervolgens heropgelost in kweekmedium MV2 met groeifactoren en 20% fetale kalverseerum (PromoCell, Heidelberg, Duitsland). Vervolgens werden de cellen gezaaid op fibronectine (Sigma Aldrich Inc., St. Louis, MO, VS)-beklede schalen met een dichtheid van 10⁴ cellen/cm² (1 µg/cm²) en 1 dag gekweekt met 5% CO₂. De dag na zaaien werden cellen gewassen met PBS om niet-gehechte cellen te verwijderen en in vers medium geplaatst. Bij ongeveer 80–100% confluentie werden kweken blootgesteld aan immunoseparatie door Ulex europaeus Agglutinin I (UEA)-beklede (Vector Laboratories, Ltd., Peterborough, VK) korrels (Dynabeads M-450 Tosylgeactiveerd, Oxoid, Hampshire, VK) om zuivere ECs te verkrijgen. ECs gebonden aan de lectine-beklede korrels werden verzameld met een magnetische deeltjesconcentrateur, terwijl ongebonden cellen werden verwijderd door tweemaal te wassen met basaal medium. UEA-positieve cellen werden heropgelost in kweekmedium en gezaaid op fibronectine-beklede schalen om hun hechting en groei te verbeteren. Kweken bereikten confluentie binnen 4–6 dagen.

Identificatie van ECs

De ECs werden geïdentificeerd door immunocytochemische kleuring met een celoppervlakte CD31 antilichaam en een FVII-gerelateerd antigene. De cellen werden tweemaal gewassen met PBS, gefixeerd met 4% paraformaldehyde, geïncludeerd met 3% H₂O₂ voor 10–15 minuten om endogene peroxidase-activiteit te elimineren en vervolgens geïncludeerd met 0,1% Triton X-100 voor 10 minuten om cellen te perforeren. De cellen werden bedruipt met specifiek primaire antilichaam: Factor VII (1:200), CD31 (1:400, Roche, Basel, Zwitserland) en geïncludeerd bij 4 °C overnachten. Vervolgens werden de cellen bedruipt met immunoglobuline G (1:50) gelabeld met perioxidase-gelabeld secundair antilichaam. De cellen werden geïncludeerd bij 37 °C voor 45 minuten en ontwikkeld met DAB in het donker voor 4 minuten. Vervolgens werd de kleurontwikkeling gestaakt met gedistilleerd water en de foto waargenomen onder de microscoop. De cellen werden waargenomen onder de fluoresentie omgekeerde fase-contrast microscoop, en de positieve cellen en het totale aantal cellen werden willekeurig geteld uit 10 visuele velden. Positieve kleuringscelfrequentie = (aantal positieve cellen/totaal aantal cellen) × 100%. De overeenkomstige NC-groep werd ingesteld en het primaire antilichaam werd vervangen door PBS, en de overige stappen werden zoals boven uitgevoerd.

Groepering en Transfectie van Cellen

Om de effecten tussen miR-133a-3p en PSAT1 op ECs van IA te bestuderen, werden ECs ingedeeld in controle groep (normale vasculaire ECs zonder enige transfectie), IA groep (IA vasculaire ECs zonder enige transfectie), mimic NC groep (getransfecteerd met miR-133a-3p mimic NC), miR-133a-3p mimic groep (getransfecteerd met miR-133a-3p mimic), small interfering RNA (si)-NC groep (getransfecteerd met si-PSAT1 NC), si-PSAT1 groep (getransfecteerd met si-PSAT1), en miR-133a-3p mimic + overexpressie (oe)-PSAT1 groep (getransfecteerd met miR-133a-3p mimic en oe-PSAT1). Daarbij werden mimic NC, miR-133a-3p mimic, si-PSAT1, si-NC, en oe-PSAT1 ontworpen en samengesteld door GenePharma Co., Ltd. (Shanghai, China). Transfectie werd strikt uitgevoerd volgens de instructies van Lipofectamine™ 2000 transfectiereagens (Thermo Fisher Scientific, MA, VS).

Stroomcytometrie

Het medium in de kweekschaal werd verwijderd, en de cellen werden tweemaal gewassen met PBS. Cellen werden losgemaakt met 0,25% trypsine, gecentrifugeerd met 800 rpm voor 5 minuten, en heropgelost in 1 × bindingsbuffer, en de celdichtheid werd aangepast tot 1 × 10⁷ cellen/mL. De celoplossing (100 µL) werd geïncludeerd met 5 µL propidiumiodide (PI, 20 µg/mL) en annexine V-FITC voor 20 minuten, daarna gemengd met 400 µL 1 × bindingsbuffer. Stroomcytometer (BD FACSArial I cel sorter) werd gebruikt om celapoptose binnen 1 uur te detecteren. Resultaten: het linksonder quadrant (Q4) op de spreidingskaart toonde gezonde levende cellen (FITC⁻/PI⁻), het rechtersonder quadrant (Q3) als vroege apoptotische cellen (FITC⁺/PI⁻), en het rechterboven quadrant (Q2) was de late apoptotische en apoptotische cellen (FITC⁺/PI⁺); apoptosesnelheid = vroege apoptose percentage (Q3) + late apoptose percentage (Q2).

3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Difenyltetrazoliumbromide (MTT) Assay

De cellen werden losgemaakt met trypsine om celoplossing te bereiden. Cellen werden geteld onder een omgekeerde microscoop. De celconcentratie werd aangepast tot 5 × 10⁴ cellen/mL. Cellen werden gezaaid in een 96-putsen kweekplaat. Na 48 uur werden cellen geïncludeerd met 20 µL MTT-oplossing voor 4 uur. MTT in elke put werd opgelost met 150 µL dimethylsulfoxide. De optische dichtheid (OD) waarde van ECs werd gemeten bij de golflengte van 570 nm. De proliferatiesnelheid van ECs werd berekend op basis van de OD-waarde.

Krabbeltest

De cellen in elke groep werden gezaaid in een 24-putsen plaat met 2 × 10⁵ cellen/put. Drie parallele putten werden in elke groep ingesteld. Bij ongeveer 90% confluentie werd het celgroeiplateau gekrabbeld met een gesteriliseerde eenmalige 1 mL micropipetpunt; elke put werd één keer gekrabbeld en de krabbellengte en -diepte van elke put waren consistent. Na krabben werden de drijvende cellen verwijderd, het kweekmedium vervangen door vers, en de krabafstand waargenomen onder de microscoop na 24 uur kweek. Het helingsgebied van de krabwond werd gerekend door de National Instrument Vision Assistant 8.6 software. Celmigratie = wondhelingsgebied/initieel krabwondgebied × 100%.

Proefdieren en Opzet van IA-Rattenmodellen

Vierentachtig Sprague-Dawley (SD) ratten van 7 weken oud en 180–200 g (Laboratoriumdierencentrum, Academie voor Militaire Medische Wetenschappen, Peking, China) werden geselecteerd. De ratten werden gehuisvest in het dierproefcentrum. De voedingsomstandigheden werden gecontroleerd op 22–25 °C en 50–60% vochtigheid met natuurlijk licht. Alle ratten werden gevoed in standaard rattenkooien met 4 ratten per kooi. De ratten kregen stedelijk sanitaire drinkwater en gewone rattenvoeder. De strooisel werd elke 3 dagen ververst, en de kooi gewassen en gesteriliseerd. De IA-ratten werden gemodelleerd volgens referentie [15]. Gebruikte aneurysma werd geïdentificeerd wanneer de volgende symptomen bij ratten voorkwamen [16]: 1, verminderde eet- of drinkactiviteit door gewichtsverlies (ongeveer 10% gewichtsverlies) over 24 uur; 2, flexie van de romp en voorpoten bij optillen; 3, lopen op één kant in normale houding; 4, leunen naar één kant in rust, geen spontane activiteit. Ratten met deze symptomen werden 3 maanden na de operatie gedood. IA-weefsels werden tijdens de operatie verkregen en met PBS perfunderd, en de blauwe kleurstof met glutamzuur werd in de cerebrale arterie perfunderd.

Behandeling en Interventie van IA-Ratten

De bovenstaande 84 ratten werden willekeurig verdeeld in 7 groepen met 12 ratten per groep. De behandelmethodes waren als volgt: normale groep (geen modellering uitgevoerd); IA groep (stereotactisch geïnjecteerd met 100 µL mengsel van PBS en Lipofectamine 2000); mimic NC groep (stereotactische injectie met 100 µL mengsel van miR-133a-3p mimic NC en Lipofectamine 2000); miR-133a-3p mimic groep (stereotactische injectie met 100 µL mengsel van miR-133a-3p mimic en Lipofectamine 2000); si-NC groep (stereotactische injectie met 100 µL mengsel van si-PSAT1 NC en Lipofectamine 2000); si-PSAT1 groep (stereotactische injectie met 100 µL mengsel van si-PSAT1 en Lipofectamine 2000); en miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 groep (stereotactische injectie met 100 µL mengsel van miR-133a-3p mimic en oe-PSAT1 en Lipofectamine 2000). Alle bovenstaande injecties werden eenmaal per dag uitgevoerd, en deze ratten werden 12 weken in een specifiek pathogen-vrij (SPF) dierlaboratorium gehouden. Na 12 weken werden ratten in elke groep geanesthetiseerd en de borstkas geopend zoals hierboven beschreven. Vanaf de linkerventrikel geïntubeerd in de aorta, werd bloed vrijgemaakt door de holle ader door te snijden. Tegelijkertijd werd 30 mL zoutoplossing met heparine natrium (37 °C) door de gang perfunderd, en vervolgens langzaam 10% polyformaldehyd/0,1 M fosfaatbuffer (pH 7,4) in de hersenen geïnjecteerd door de gang. Na perfusie-fixatie werden de hersenen geopend. De arteriële ring aan de basis van de schedel werd gescheiden en verwijderd onder de operatiemicroskoop, de veranderingen van aneurysma's waargenomen onder de microscoop, en de pathologische kenmerken onderzocht. De mimic NC, miR-133a-3p mimic, si-NC, si-PSAT1, en oe-PSAT1 waren samengesteld door Shanghai Sangon Biotechnology Co., Ltd. (Shanghai, China).

Detectie van Hemodynamica

De bloedstroomsnelheid aan het einde van de linker gemeenschappelijke halsslagader van ratten werd getest voor 3 dagen vóór de operatie en 12 weken na de interventiebehandeling. De methode was als volgt: de ratten werden in het dierframe van de anesthesiemachine voor inhalatie geplaatst, en de stroomparameters werden aangepast. Nadat de ratten stabiel ademden en geen duidelijke reactie lieten zien wanneer de staart van de ratten werd aangeraakt, werden de ratten vastgemaakt op de proeftafel met rubberband. Het haar van de hals van de rat werd geschoren met een elektrische scheermes. De kleur Doppler ultrascoopdetector werd aangezet, en de bloedstroomsnelheid aan het einde van de linker gemeenschappelijke halsslagader werd gemeten en de gegevens vastgelegd nadat de probe met een geschikte koppelingsmiddel was ingesmeerd. Na de meting werden de ratten voorzichtig terug in de kooi geplaatst om de luchtwegen vrij te houden tot de ratten wakker werden na anesthesie.

RT-qPCR

Totaal RNA werd geïsoleerd op basis van RNA simple totale RNA extractie kit (TIANGEN Biotechnology Co., Ltd., Peking, China). Hoogwaardig RNA werd bevestigd door ultraviolet analyse en formaldehyde denaturatie elektroforese, en RNA werd omgezet in complementaire DNA door PrimeScript RT reagent Kit. PCR-reactie werd uitgevoerd met SYBR Permix Ex TaqII (Takara, Dalian, Liaoning, China). PCR-primers werden ontworpen en samengesteld door Beijing ComWin Biotech Co., Ltd. (Peking, China) (Tabel 1). U6 werd geselecteerd als interne parameter voor miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, β-catenine, Bax, Bcl-2, Ki-67, en CyclinD1 met glyceraldehyde fosfaat dehydrogenase (GAPDH) als interne parameter. De gegevens werden gemeten met 2⁻ΔΔCt.

Western Blot Analyse

Totale eiwitten werden geëxtraheerd uit cellen en weefsels, en de eiwitmonsters gekwantificeerd met Bicinchoninic Acid Eiwit Assay Kit (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China). De monsters werden gemengd met 1/4 volume van 5 × monsterbuffer en 5 minuten gekookt. Het 10% scheidingsgel en 5% concentreringsgel werden geselecteerd voor elektroforese. Het membraan werd 60 minuten geïncludeerd in 5% magere melkpoeder. Het membraan werd toegevoegd met primaire antilichamen PSAT1 (1:500), GSK3β (1:500), β-catenine (1:5000), Bax (1:1000), Bcl-2 (1:1000), CyclinD1 (1:200), Ki-67 (1:5000), MMP-9 (1 µg/mL), VEGF (1:1000) (alle van Abcam, Cambridge, MA, VS). Vervolgens werd het membraan 60 minuten geïncludeerd met secundair antilichaam (1:2000). Het membraan werd 1 minuut gedoopt in de electrochemiluminescentie reactieoplossing (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China), daarna bedekt met voedselfolie na verwijdering van de vloeistof. Het membraan werd blootgesteld aan Röntgenstraling, en het resultaat werd waargenomen na ontwikkelen en fixeren. GAPDH (1:10000, Abcam) werd gebruikt als laadcontrole, en het eiwitbeeld werd geanalyseerd met ImageJ2x software.

Dubbele Luciferase Reporter Gen Assay

Statistische Analyse

Alle gegevens werden geanalyseerd met SPSS 21.0 software (IBM Corp., Armonk, NY, VS). De tellinggegevens werden aangegeven door frequentie of percentage, en de analyse werd bepaald door chi-kwadraattoets of Fisher's toets. De meetgegevens die aan een normale verdeling voldeden, werden uitgedrukt als gemiddelde ± standaarddeviatie. Vergelijking tussen twee groepen werd uitgevoerd met t-toets, terwijl vergelijking onder meerdere groepen geanalyseerd werd met eenrichtingsvariatieanalyse (ANOVA) gevolgd door Tukey's post-hoc toets. Een P-waarde < 0,05 werd als significant beschouwd.

Resultaten

Algemene Gegevens van Patiënten met IA

Zoals getoond in Tabel 2, werden de algemene gegevens van de IA-groep en de controlegroep vergeleken. De specifieke informatie staat in Tabel 2.

Expressie van miR-133a-3p is Gerelateerd aan het Aantal en de Grootte van IA

Door de relatie tussen miR-133a-3p expressie en de clinicopathologische kenmerken van IA te analyseren, werd in Tabel 3 gedetailleerd dat op basis van de gemiddelde relatieve expressie van miR-133a-3p in IA, 75 IA-gevallen in twee groepen verdeeld: miR-133a-3p hoge expressiegroep (n = 47) en miR-133a-3p lage expressiegroep (n = 28). De relatie tussen miR-133a-3p en verschillende clinicopathologische parameters werd statistisch geanalyseerd met chi-kwadraattoets of Fisher's toets. De resultaten toonden aan dat miR-133a-3p expressie niet gerelateerd was aan leeftijd, geslacht, vorm en positie van aneurysma (alle P > 0,05), maar geassocieerd was met aantal en grootte van aneurysma (beide P < 0,05).

MiR-133a-3p Expressie is Verlaagd en PSAT1, GSK3β, en β-catenine Expressie is Verhoogd in IA-Weefsels

De expressie van miR-133a-3p in IA werd bepaald met RT-qPCR, en de resultaten onthulden dat in verhouding tot de normale intracraniële arteriolen weefsels (de controlegroep), miR-133a-3p expressie verminderd was in de IA-weefsels (de IA-groep) (P < 0,05) (Fig. 1a). RT-qPCR en western blot analyse toonden aan dat PSAT1, GSK3β, en β-catenine expressie verhoogd was in de IA-weefsels ten opzichte van de normale intracraniële arteriolen weefsels (alle P < 0,05) (Fig. 1a–c).

MiR-133a-3p expressie is verlaagd en de PSAT1, GSK3β, en β-catenine expressie is verhoogd in IA-weefsels. a Expressie van miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, en β-catenine in de IA-groep en de normale groep. b Eiwitband van PSAT1, GSK3β, en β-cetenine expressie. c Eiwitexpressie van PSAT1, GSK3β, en β-catenine in de IA-groep en de normale groep door western blot assay. n = 75, *P < 0,05 vs. de controlegroep. Meetgegevens zijn afgebeeld als gemiddelde ± standaarddeviatie, en vergelijkingen tussen twee groepen werden uitgevoerd met onafhankelijke steekproef t-toets

Pathologische Veranderingen van Aneurysma en MMP-9 en VEGF Expressie in IA-Weefsels

Door directe waarneming van de normale intracraniële arteriolen weefsels en de IA-weefsels, werd gepresenteerd dat in de controlegroep de vaten in de arteriële weefsels helder rood waren en geen duidelijke atheromatose plakken en laterale trombus in de lumen gevonden werden. De tumor van de aneurysma-weefsels van de IA-groep was meestal bruin of donkerrood, het uiterlijk was scrotiform of fusiform, en de textuur was meestal zacht. Toen de tumor open werd gesneden, bleken witte of donkerrode atheromatose plakken op de tumorwand van sommige tumor monsters, die plat, rond, of ovaal in vorm waren. In sommige tumor monsters was er muurtrombus in de tumorholte, en de textuur van de trombus was zacht. De dikte van de tumorwand dunne geleidelijk vanaf de hals van de tumor, waarvan sommige slechts een dun vezel membraam aan de top van de tumor hadden, en sommige waren zelfs geruptureerd. De scheur van geruptureerd aneurysma was gelegen op of nabij de top van de tumor.

HE-kleuring toonde aan dat onder het lichtmicroscoop, de dikte van de wand van de normale intracraniële arteriolen weefsels uniform was; de anatomische structuur van de binnen-, midden-, en buitenlaag was helder en intact; de morfologie van de cellen in elke laag was normaal; de sarkolem van aangrenzende cellen vormden vaak nauw; en de inflammatoire cellen van de wand waren zeldzaam. In de IA-groep vormden lokale uitstulpingen in de distale laterale vasculaire holte aan de top van de bifurcatie van de intracraniële arterie in de aneurysmawand stompe en kleinere hoeken, en lokale ECs waren verloren. Een klein aantal monsters toonde een migratie van gladde spiercel laag naar de intima-laag en myogene intima celproliferatie. ECs verminderen of verdwenen zelfs. De endotheellaag werd samengesteld door hyperplastische myointimale cellen en lineair gerangschikte ECs, of door apoptotische ECs en bloedcellen gehecht aan de lumen. De vacuole degenereren en presenteerden met continuïteitonderbreking. Sommige werden samen met de basale membraan afgescheurd, en de intima collageenvezels namen toe. De atheroscletose veranderde, en de arteriolenwand was duidelijk dunner en gevuld met een groot aantal bindweefsel ladder weefsels. Inflammatoire celinfiltratie en partiële diffusie werden waargenomen in alle lagen, voornamelijk in de midden- en buitenmembraan. Lipide en cholesterol kristal deposities werden waargenomen in sommige cellen. Sommige van de tumorwanden waren volledig of lokaal gedund en naar buiten geëxpandeerd (Fig. 2a, b).

Pathologische veranderingen van aneurysma en de expressie van MMP-9 en VEGF in IA. a Normale intracraniële arteriolen weefselcoupes in de controlegroep onder HE-kleuring (× 10). b IA weefselcoupes gekleurd met HE (× 10). c Ultrastructuur van normale intracraniële arteriolen weefsels in de controlegroep onder een elektronenmicroscoop (× 10.000). d Ultrastructuur van IA weefsels onder een elektronenmicroscoop (× 10.000). e Expressie van MMP-9 in de controlegroep en de IA-groep door immunohistochemische kleuring (× 200). f Expressie van VEGF in de controlegroep en de IA-groep door immunohistochemische kleuring (× 200)

De coupes van de normale intracraniële arteriolen weefsels en IA-weefsels werden waargenomen door een elektronenmicroscoop, en het toonde aan dat in normale intracraniële arteriolen weefsels, de matrixvezels van de cerebrale vasculaire wand duidelijk gezien konden worden, en er was geen endotheelschade, celpyknose, of degeneratie. In de IA-weefsels werden duidelijke endotheelschade, celpyknose, of vacuole degeneratie waargenomen, het aantal midden gladde spiercellen was verminderd, de meeste kernpyknose verscheen, en chromatine aggregatie en apoptotische lichamen konden gezien worden. Sommige cellen toonden zwelling van de mitochondriën en verdwijning van normale interne structuur. De extracellulaire matrix die het cytoskelet vormde, was vervaagd en toonde amorfe vlokken. Er waren veel fragmenten in de ontbrekende delen van de cellen (Fig. 2c, d).

Immunohistochemische kleuring werd gebruikt om MMP-9 en VEGF expressie te testen, en de resultaten onthulden dat er geen expressie van MMP-9 en VEGF was in 75 gevallen van de controlegroep. Er bestonden 60 gevallen van positieve expressie van MMP-9 in de 75 IA-monsters. MMP-9 positieve expressie verscheen in de binnen- en buitenmembraan van de IA-wand, maar de expressie was niet uniform. De positieve expressie werd voornamelijk gekenmerkt door een bruinachtig geel cytoplasma. De positieve expressie van VEGF was 66 gevallen in 75 IA-monsters. In de wand van IA was er een hoge positieve expressie in de midden- en buitenmembraan en een lage positieve expressie in de intima. De positieve expressie werd ook voornamelijk gekenmerkt door een bruinachtig geel cytoplasma (Fig. 2e, f). De expressie van MMP-9 en VEGF in de twee groepen is getoond in Tabel 4.

Identificatie van Vasculaire ECs

De expressie van factor VIII en CD31 in ECs werden geanalyseerd door immunohistochemische kleuring. De resultaten rapporteerden dat vasculaire ECs positief reageerden op factor VIII en CD31-gerelateerde antigene antilichamen, en de positieve frequentie was 95%. Daarnaast waren er een groot aantal bruine deeltjes in het cytoplasma, en de vijfde passage van cellen van bruine kleuring was dramatisch hoger dan de primaire passage van cellen (Fig. 3a, b).

Vasculaire ECs reageren positief op FVIII en CD31 gerelateerde antigene antilichamen. a Identificatie van ECs door CD31. b Identificatie van ECs door FVII

Upregulatie van miR-133a-3p en Downregulatie van PSAT1 Remmen Apoptose en Bevorderen Proliferatie en Migratie van ECs in IA

Stroomcytometrie, RT-qPCR, en western blot analyse werden gebruikt voor het waarnemen van de apoptose en Bax en Bcl-2 expressie in ECs van IA na behandeling met miR-133a-3p mimic of si-PSAT1. Het werd aangegeven dat vergeleken met de controlegroep, de apoptosesnelheid van cellen en Bax expressie verhoogd was in de IA-groep en de Bcl-2 expressie was verminderd (alle P < 0,05). De celapoptose en Bax en Bcl-2 expressie in de IA-groep, mimic NC groep, en si-NC groep hadden geen significante verandering (alle P > 0,05). In vergelijking met de si-NC groep en mimic NC groep, was de apoptosesnelheid van cellen in de si-PSAT1 groep en miR-133a-3p mimic groep onderdrukt, de Bax expressie was gedaald, en de Bcl-2 expressie was toegenomen (alle P < 0,05). Versus de miR-133a-3p mimic groep, waren de apoptosesnelheid en Bax expressie verhoogd, en de Bcl-2 expressie was verminderd in de miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 groep (alle P < 0,05) (Fig. 4a–e).

Hoog tot expressie miR-133a-3p en laag tot expressie PSAT1 remmen apoptose en bevorderen proliferatie en migratie van IA ECs. a Detectie van apoptose van ECs door stroomcytometrie. b Detectie van apoptosesnelheid van ECs in elke groep. c Bax en Bcl-2 expressie in ECs gedetecteerd door RT-qPCR. d Eiwitband van Bax en Bcl-2 expressie. e Bax en Bcl-2 eiwitexpressie in ECs gedetecteerd door western blot analyse. f MTT assay werd gebruikt om proliferatieactiviteit van ECs in elke groep te detecteren. g RT-qPCR werd gebruikt om de expressie van Ki-67 en CyclinD1 in elke groep ECs te detecteren. h Eiwitband van Ki-67 en CyclinD1 expressie. i Ki-67 en CyclinD1 eiwitexpressie in ECs gedetecteerd door western blot analyse. j Detectie van de migratie van ECs in elke groep door krabbeltest. k Statistische resultaten van endotheelmigratie in elke groep. N = 3, *P < 0,05 vs. de controlegroep. #P < 0,05 vs. de mimic NC groep. &P < 0,05 vs. de si-NC groep. +P < 0,05 vs. de miR-133a-3p mimic groep. Meetgegevens zijn afgebeeld als gemiddelde ± standaarddeviatie; gegevens werden beoordeeld door eenrichtingsvariatieanalyse gevolgd door Tukey's post-hoc toets

MTT assay, RT-qPCR, en western blot analyse werden gebruikt om de proliferatie en de expressie van Ki-67 en CyclinD1 in ECs van IA na behandeling met miR-133a-3p mimic of si-PSAT1 te observeren. Het werd getoond dat in contrast met de controlegroep, de proliferatieactiviteit en Ki-67 en CyclinD1 expressie verminderd waren in de IA-groep (alle P < 0,05). Er was geen significant verschil in de proliferatieactiviteit en Ki-67 en CyclinD1 expressie van de IA-groep, mimic NC groep, en si-NC groep (alle P > 0,05). In verhouding tot de si-NC groep en de mimic NC groep, waren de proliferatieactiviteit en Ki-67 en CyclinD1 expressie verhoogd in de si-PSAT1 groep en de miR-133a-3p mimic groep (alle P < 0,05). In vergelijking met de miR-133a-3p mimic groep, waren de proliferatieactiviteit en Ki-67 en CyclinD1 expressie verminderd in de miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 groep (alle P < 0,05) (Fig. 4f, i).

De migratie van ECs in elke groep na behandeling met miR-133a-3p mimic of si-PSAT1 voor 24 uur werd waargenomen door krabbeltest. Het werd onthuld dat de migratie van cellen in de IA-groep geremd was ten opzichte van die in de controlegroep (P < 0,05). Er was geen duidelijke verandering in celmigratie van de IA-groep, de si-NC groep, en de mimic NC groep (alle P > 0,05). In vergelijking met de si-NC groep en de mimic NC groep, was de celmigratie in de si-PSAT1 groep en de miR-133a-3p mimic groep verhoogd (beide P < 0,05). Versus de miR-133a-3p mimic groep, was de celmigratie gedaald in de miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 groep (P < 0,05) (Fig. 4j, k).

Herstelde miR-133a-3p en Gedepleteerde PSAT1 Verminderen PSAT1, GSK3β, en β-catenine Expressie in ECs van IA

RT-qPCR werd gebruikt om miR-133a-3p expressie in ECs van IA te detecteren; het werd verkregen dat vergeleken met de controlegroep, miR-133a-3p expressie in de IA-groep verminderd was (P < 0,05). miR-133a-3p expressie in de IA-groep, mimic NC groep, en si-NC groep veranderde niet significant (P > 0,05). MiR-133a-3p expressie in de miR-133a-3p mimic groep was verhoogd ten opzichte van die in de mimic NC groep (P < 0,05). In contrast met de si-NC groep, was er geen duidelijke verandering in miR-133a-3p expressie in de si-PSAT1 groep (P > 0,05). Versus de miR-133a-3p mimic groep, toonde miR-133a-3p expressie geen significant verschil in de miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 groep (P > 0,05) (Fig. 5a).

Upregulatie van miR-133a-3p en downregulatie van PSAT1 verminderen PSAT1, GSK3β, en β-catenine expressie in ECs van IA. a miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, en β-catenine expressie in ECs gedetecteerd door RT-qPCR. b Eiwitbanden van PSAT1, GSK3β, en β-catenine. c PSAT1, GSK3β, en β-catenine eiwitexpressie in ECs in elke groep gedetecteerd door western blot analyse. N = 3, *P < 0,05 vs. de controlegroep. #P < 0,05 vs. de mimic NC groep. &P < 0,05 vs. de si-NC groep. +P < 0,05 vs. de miR-133a-3p mimic groep. Meetgegevens zijn afgebeeld als gemiddelde ± standaarddeviatie, en gegevens werden beoordeeld door eenrichtingsvariatieanalyse gevolgd door Tukey's post-hoc toets

De expressie van PSAT1, GSK3β, en β-catenine in ECs van IA werd getest door western blot analyse en RT-qPCR. Het werd aangegeven dat in verhouding tot de controlegroep, PSAT1, GSK3β, en β-catenine expressie in de IA-groep verhoogd was (alle P < 0,05). PSAT1, GSK3β, en β-catenine expressie in de IA-groep, mimic NC groep, en si-NC groep veranderden niet dramatisch (alle P > 0,05). PSAT1, GSK3β, en β-catenine expressie in de miR-133a-3p mimic groep en si-PSAT1 groep was gedaald ten opzichte van die in de mimic NC groep en si-NC groep (alle P < 0,05). In verhouding tot de miR-133a-3p mimics groep, was PSAT1, GSK3β, en β-cetenine expressie verhoogd in de miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 groep (alle P < 0,05) (Fig. 5a–c).

Upreguleren van miR-133a-3p en Downreguleren van PSAT1 Verlichten de Pathologische Veranderingen van IA-Weefsels

Door de hemodynamische veranderingen van ratten na modellering te testen, monitoren we de bloedstroomsnelheid van ratten in elke groep 3 dagen vóór de operatie en 12 weken na interventiebehandeling. Het werd getoond dat er geen duidelijke verschil in bloedstroomsnelheid in elke groep 3 dagen vóór de operatie was (P > 0,05). Na 12 weken interventie, daalde de bloedstroomsnelheid van ratten in de IA-groep ten opzichte van die in de normale groep (P < 0,05). Er was geen duidelijke verschil in de mate van daling van bloedstroomsnelheid in de IA-groep, mimic NC groep, si-NC groep, en miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 groep (alle P > 0,05). In vergelijking met de si-NC groep en de mimic NC groep, was de bloedstroomsnelheid verhoogd in de miR-133a-3p mimic groep en de si-PSAT1 groep (beide P < 0,05). In contrast met de miR-133a-3p mimic groep, was de bloedstroomsnelheid gedaald in de miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 groep (P < 0,05) (Fig. 6a).

Upregulatie van miR-133a-3p en downregulatie van PSAT1 verlichten de pathologische veranderingen van IA-weefsels. a Hemodynamische veranderingen op elk tijdstip na succesvolle modellering in ratten. b Veranderingen van IA-weefsel na transfectie. n = 12, *P < 0,05 vs. de normale groep. #P < 0,05 vs. de mimic NC groep. &P < 0,05 vs. de si-NC groep. +P < 0,05 vs. de miR-133a-3p mimic groep. Meetgegevens zijn afgebeeld als gemiddelde ± standaarddeviatie, en gegevens werden beoordeeld door eenrichtingsvariatieanalyse gevolgd door Tukey's post-hoc toets.

De veranderingen van IA-weefsels werden geverifieerd door HE-kleuring. De resultaten toonden aan dat in de normale groep, de elastische vezels in de middenlaag van intracraniële vasculaire weefsels netjes waren, de normale elastische proteïne golf-achtige structuur verscheen, en er was geen breuk en degradatie. In verhouding tot de normale groep, was de lumen van intracraniële vasculaire weefsels vergroot, de normale elastische proteïne golf-achtige structuur verdwenen, de elastische vezel in de middenlaag van lokaal elastische proteïne vaat was gebroken, en sommige van de elastische vezels waren volledig gedegradeerd in de IA-groep. Er was geen duidelijke verandering in de morfologie van IA-weefsels in de si-NC groep, mimic NC groep, IA-groep, en miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 groep. In contrast met de si-NC groep en de mimic NC groep, bestond de golfstructuur van elastische proteïne in intracraniële vasculaire weefsels van ratten in de miR-133a-3p mimic groep en de si-PSAT1 groep, en de lokale elastische proteïne vaatstructuur was licht verward, maar er was geen breuk en ontbinding (Fig. 6b).

Hoog tot Expressie miR-133a-3p en Laag tot Expressie PSAT1 Verminderen PSAT1, GSK3β, β-catenine, VEGF, en MMP-9 Expressie in IA-Weefsels In Vivo

De expressie van miR-133a-3p in IA-weefsels in vivo werd getest door RT-qPCR, het werd gesuggereerd dat in verhouding tot de normale groep, miR-133a-3p expressie gedaald was in de IA-groep (P < 0,05). miR-133a-3p expressie in de IA-groep, mimic NC groep, en si-NC groep veranderde niet duidelijk (alle P > 0,05). MiR-133a-3p expressie in de miR-133a-3p mimic groep was verhoogd ten opzichte van die in de mimic NC groep (P < 0,05). In vergelijking met de si-NC groep, was er geen gemarkeerde verandering in miR-133a-3p expressie in de si-PSAT1 groep (P > 0,05). Versus de miR-133a-3p mimic groep, toonde miR-133a-3p expressie geen significant verschil in de miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 groep (P > 0,05) (Fig. 7a).

Overexpressie van miR-133a-3p en lage expressie van PSAT1 verminderen PSAT1, GSK3β, en β-catenine, VEGF en MMP-9 expressie in IA-weefsels in vivo en PSAT1 is een doelgen van miR-133a-3p. a Detectie van miR-133a-3p, PSAT1, GSK3β, en β-catenine expressie in IA-weefsels van ratten in elke groep door RT-qPCR. b Eiwitbanden van PSAT1, GSK3β, en β-catenine. c Detectie van PSAT1, GSK3β, en β-catenine eiwitexpressie in IA-weefsels van ratten in elke groep door western blot analyse. d Eiwitbanden van VEGF en MMP-9. e Detectie van VEGF en MMP-9 eiwitexpressie in IA-weefsels van ratten in elke groep door western blot analyse. f Voorspelling van de doelaardige plaats van PSAT1 binding aan de corresponderende miR-133a-3p door Target Scan. g Resultaat van dubbele luciferase reporter gen assay. a–e, n = 12; f–g, N = 3, *P < 0,05 vs. de normale groep/de Wt + NC groep. #P < 0,05 vs. de mimic NC groep. &P < 0,05 vs. de si-NC groep. +P < 0,05 vs. de miR-133a-3p mimic groep. Meetgegevens zijn afgebeeld als gemiddelde ± standaarddeviatie, en gegevens werden beoordeeld door eenrichtingsvariatieanalyse gevolgd door Tukey's post-hoc toets

De expressie van PSAT1, GSK3β, en β-catenine in IA-weefsels in vivo werd getest door western blot analyse en RT-qPCR. Het verscheen dat in contrast met de normale groep, PSAT1, GSK3β, en β-catenine expressie in de IA-groep toegenomen was (alle P < 0,05). PSAT1, GSK3β, en β-catenine expressie in de IA-groep, mimic NC groep, en si-NC groep veranderden niet duidelijk (alle P > 0,05). PSAT1, GSK3β, en β-catenine expressie in de miR-133a-3p mimic groep en si-PSAT1 groep was verminderd vergeleken met die in de mimic NC groep en si-NC groep (alle P < 0,05). Versus de miR-133a-3p mimic groep, was PSAT1, GSK3β, en β-cetenine expressie verhoogd in de miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 groep (alle P < 0,05) (Fig. 7a–c).

Western blot analyse werd gebruikt om de VEGF en MMP-9 expressie in IA-weefsels in vivo te verifiëren; de resultaten waarnemen dat in vergelijking met de normale groep, VEGF en MMP-9 expressie in de IA-groep verhoogd waren (beide P < 0,05). VEGF en MMP-9 expressie in de IA-groep, mimic NC groep, en si-NC groep veranderden niet duidelijk (alle P > 0,05). In verhouding tot de mimic NC groep en si-NC groep, waren VEGF en MMP-9 expressie in de miR-133a-3p mimic groep en si-PSAT1 groep gedaald (alle P < 0,05). Versus de miR-133a-3p mimic groep, waren VEGF en MMP-9 expressie verhoogd in de miR-133a-3p mimic + oe-PSAT1 groep (alle P < 0,05) (Fig. 7d, e).

PSAT1 Is een Doelgen van miR-133a-3p

De online voorspellingssoftware (https://cm.jefferson.edu/rna22/Precomputed/) werd gebruikt om de doelaardige plaats van PSAT1 binding aan de miR-133a-3p te voorspellen en analyseren, en de sequentie van 3′UTR regio gecombineerd door PSAT1 en miR-133a-3p. Om te bewijzen dat de voorspelde bindingsplaats van miR-133a-3p resulteerde in een verandering in de luciferase-activiteit, werden de mutatie sequentie en de wild-type sequentie van PSAT1 3′UTR verwijderend miR-133a-3p bindingsplaats ontworpen. Luciferase-activiteit werd geverifieerd door co-transfectie van miR-133a-3p mimic en WT (Wt-miR-133a-3p/PSAT1) of MUT (Mut-miR-133a-3p/PSAT1) recombinante plasmids in vasculaire ECs. De resultaten onthulden dat miR-133a-3p mimic geen duidelijke effect had op luciferase-activiteit in de Mut-miR-133a-3p/PSAT1 groep (P > 0,05), terwijl de luciferase-activiteit in de Wt-miR-133a-3p/PSAT1 groep significant gedaald was (P < 0,05) (Fig. 7f, g).

Discussie

IA is een abnormale dilatatie van de intracraniële arterie, die de arteriële wand verzwakt door continu naar buiten te duwen van de vasculaire wand, wat resulteert in een hoger risico op aneurysma-ruptuur. In een studie uitgevoerd door Liu et al., is getoond dat sommige miRNAs betrokken zijn bij het reguleren van de celproliferatie van vasculaire gladde spiercellen, wat nauw verbonden is met IA. Ook een recente studie heeft bewijs geleverd dat circulerende miRNAs gebruikt kunnen worden als een nieuwe biomarker om de mogelijkheid van IA bij hoogrisico-individuen te beoordelen. Het wordt gewoonlijk overwogen dat PSAT1 betrokken kan zijn bij schizophrenie-spectrum aandoeningen en serinemetabolisme wijzigt. De huidige studie was ontworpen om de regulerende rol van miR-133a-3p gemoduleerde vasculaire endotheelschade en geïnduceerd IA te verkennen via modulatie van de PSAT1/GSK3β/β-catenine signaleringsroute.

In deze studie werd de relatie tussen miR-133a-3p expressie en clinicopathologische kenmerken van IA geanalyseerd, en de resultaten toonden aan dat de expressie van miR-133a-3p niet gerelateerd was aan leeftijd, geslacht, vorm, en positie van aneurysma maar geassocieerd was met het aantal en de grootte van aneurysma. Sommige wetenschappers overwoogen dat de afschuifspanning van regionale bloedstroom in de arteriële wand de inductie van monocyten chemoattracterende proteïne-1 (MCP-1) en macrofaag inflammatoire proteïne 1α (MIP-1α) expressie door fibroblasten en vasculaire ECs binnen de vasculaire wand induceerde. De hoogst reactieve chemotactische factoren MCP-1 en MIP-1α maakten een aggregatie van macrofagen in de vasculaire wand en mediateerden inflammatoire reactie, toen induceerden ze de excitatie van kerntranscriptiefactor c-Jun en reguleerden dan de activatie van geactiveerd proteïne 1 (AP-1), toen activeerden ze MMP-9 promotor in zijn structurele domein om MMP-9 mRNA expressie te verhogen, en ten slotte induceerden ze de ontbinding van extracellulaire matrix van de vasculaire wand, wat leidde tot de vorming van intracraniële aneurysma. Saito et al. vonden dat MMP-9 positieve cellen voornamelijk afkomstig waren van de midden- en buitenmembraan van de arterie macrofagen, wat bevestigde dat MMP-9 geëxprimeerd door macrofagen de degeneratie van de arteriële wand mediateerde, wat leidde tot de vorming van arteriële aneurysma. De bovenstaande studies hebben aangegeven dat MMP-9 gekoppeld was aan de vorming van IA. De resultaten van onze studie onthulden dat MMP-9 in IA upregulerd was; dus speculeerden we dat miR-133a-3p betrokken kan zijn bij het ontstaan en de ontwikkeling van IA door de PSAT1/GSK3β/β-catenine route te reguleren en verder MMP-9 te reguleren. In onze studie vonden we dat herstel van miR-133a-3p de expressie van PSAT1, GSK3β, β-catenine, en MMP-9 in intracraniële aneurysma weefsels verminderde. We zullen in toekomstig onderzoek relevante studies uitvoeren om onze bevindingen te verifiëren.

Onze studie heeft substantiële bewijzen geleverd ten aanzien van het idee dat miR-133a-3p expressie verminderd was en PSAT1, GSK3β, en β-catenine verhoogd was in IA. Opkomende bewijzen suggereren dat miR-133a-3p een onderdrukkende rol speelt in verschillende soorten tumoren. Recente studie heeft getoond dat miR-133a-3p expressie dramatisch verlaagd was in borstkankerweefsels in contrast met die in niet-kankerweefsels. Een andere studie beweerde dat miR-133a-3p expressie gedaald is in geavanceerde prostaatkanker (PCa) weefsels ten opzichte van die in de aangrenzende normale weefsels of goedaardige prostaataanomalie weefsels, met name in botmetastatische PCa weefsels. Het bevorderende effect van PSAT1 in andere typen ziekten is in sommige literaturen gevonden. Het wordt gerapporteerd dat PSAT1 expressie opmerkelijk verhoogd was in niet-kleincel longkanker (NSCLC) en slechte klinische uitkomst van NSCLC-patiënten voorspelde. Verder wordt PSAT1 beschouwd als het hoogst upregulerde gen in CRC-tumoren evenals hoog tot expressie in chemoresistente ziekte patiënten. Het is aangetoond dat GSK3β activiteit verhoogd was in kankerweefsels. Bovendien zijn ook het fosforylatieniveau van GSK3β als de expressie van nucleaire β-catenine verhoogd, wat suggereert dat GSK3β/β-catenine route betrokken kan zijn bij osteopontine regulatie.

Andere resultaten die uit onze data voortkwamen, suggereerden dat upregulatie van miR-133a-3p en downregulatie van PSAT1 apoptose onderdrukten en proliferatie en migratie van IA ECs bevorderden, VEGF en MMP-9 expressie in IA-weefsels verminderden. Er is eerder voorgesteld dat de overexpressie van miR-133a-3p de invasie, groei, en mitose van plaveiselcelcarcinoom cellen van de mondholte remt door collagen type I alpha 1 (COL1A1) te targeten. Het wordt gerapporteerd dat hoog tot expressie miR-133a-3p de propagatie van ESCC cellen kan onderdrukken, celapoptose bevorderen, en de migratie en invasie van ESCC cellen verminderen door COL1A1 te targeten. Een andere studie heeft geverifieerd dat tijdelijke upregulatie van miR-133a-3p de migratie, invasie, en groei capaciteiten van galblaascarcinoom cellen onderdrukt door direct recombinatie signaal-bindend proteïne Jκ te targeten. Op gelijke wijze suggereert deze studie dat miR-133a-3p zijn rol in IA uitoefent door PSAT1 te targeten. Het wordt getoond dat PSAT1 overexpressie ESCC celgroei en matrigel invasie in vitro bevordert, en injectie van muizen met ESCC cellen met hoge expressie van PSAT1 induceert tumorvorming in vivo. Een andere studie heeft ook gerapporteerd dat PSAT1 hoog tot expressie is en een slechte klinische uitkomst van patiënten voorspelt, evenals cel-tumorigenese en -proliferatie in vivo en in vitro bevordert. Eerder onderzoek bevestigt over het algemeen dat PSAT1 celcyclusprogressie, proliferatie, en tumorigenese bevordert door verlies- en winst-van-functie experimenten. Het is aangegeven dat MMP's samengesteld zijn uit een reeks enzymen die proteïne substraten splitsen op basis van een geconserveerd mechanisme dat verwijst naar activering van een actief plaats-gebonden watermolecuul door een Zn²⁺ ion. MMP-9 is een distincte protease die een enorme invloed uitoefent op veel biologische processen. Een studie beweerde dat MMP-9 verhoogd was in de aneurysma groepen vergeleken met de controlegroep. Vasculaire endotheliale groeifactor-A (VEGF-A) wordt erkend als de sleutelregulator van endovasculaire differentiatie van trofoblaast. Een studie onthulde dat gedempte PSAT1 expressie VEGF, β-catenine, en GSK3β fosforylatie expressie onderdrukt.

Conclusie

Kortom, onze studie bevestigt onze hypothese dat overexpressie van miR-133a-3p of downregulatie van PSAT1 endotheelschade remt en endotheelcelproliferatie bevordert via inhibitie van de GSK3β/β-catenine route in IA. Deze bevindingen bieden nieuwe inzichten in een nieuwe doelwittherapie voor IA. Deze bevindingen benadrukken de rol van miR-133a-3p in IA in relatie tot de PSAT1/GSK3β/β-catenine route. Echter, een conclusie over de effecten van miR-133a-3p en PSAT1 kan niet duidelijk worden gemaakt vanwege beperkt bekende onderzoeken op dit gebied. Het moet rigoreus worden gemonitord en op de juiste manier gerapporteerd in toekomstige klinische studies.

Beschikbaarheid van Data en Materialen

Niet van toepassing

Afkortingen

miR-133a-3p:

MicroRNA-133a-3p

IA:

Intracraniële aneurysma

PSAT1:

Phosphoserine aminotransferase 1

GSK3:

β-glycogeen synthase kinase 3β

SAH:

Subarachnoïdale bloeding

MiRNAs:

MicroRNAs

CRC:

Colorectale kanker

ESCC:

Plaveiselcelcarcinoom van de slokdarm

HE:

Hematoxyline-eosine

PBS:

Fosfaatgebufferde zoutoplossing

MMP:

Matrix metalloprotease

VEGF:

Vasculaire endotheliale groeifactor

NC:

Negatieve controle

DAB:

Diaminobenzidine

FBS:

Fetale kalverseerum

UEAI:

Ulex europaeus agglutinines I

PI:

Propidiumiodide

FITC:

V-fluoresceïne isothiocyaan

DMSO:

Dimethylsulfoxide

OD:

Optische dichtheid

SD:

Sprague-Dawley

SPF:

Specifiek pathogen-vrij

GAPDH:

Glyceraldehyde fosfaat dehydrogenase

BCA:

Bicinchoninic acid

3′UTR:

3′ Onvertaalde regio

WT:

Wild-type

MUT:

Mutant

ANOVA:

Variatieanalyse

NSCLC:

Niet-kleincel longkanker

VEGF-A:

Vasculaire endotheliale groeifactor-A