Gerichte gliomatherapie: Gint4.T-gemodificeerde DNA-tetraëders leveren doxorubiccine af om PDGFRβ-gedreven celproliferatie te remmen

Samenvatting

Gliom is een van de dodelijkste intrinsieke hersentumoren vanwege de invasieve groei. Het effect van gliomabehandeling is slecht vanwege de aanwezigheid van de bloed-hersenbarrière en bloed-tumorbarrière en onvoldoende medicijntargeting. DNA-tetraëders (TDN) tonen grote potentieel voor medicijnafgifte en kunnen een nieuwe therapeutische strategie voor glioom zijn. In deze studie gebruikten we TDN om doxorubiccine (DOX) af te leveren voor de gliomatherapie. Gint4.T, een aptameer dat trombocyten-groeifactor receptor β op tumorcellen kan herkennen, werd gebruikt om TDN te modificeren (Apt-TDN) voor gerichte medicijnafgifte. De TDN werden zelf-geassembleerd door een eéntrapsynthese, wat kleine grootte (10 nm) en negatieve lading toonde. Foetale kalverseerumtest toonde de stabiliteit als medicijnafgiftemiddel. Apt-TDN kon effectief worden opgenomen door U87MG-cellen. In vergelijking met DOX en DOX@TDN (TDN geladen met DOX), toonde DOX@Apt-TDN (Gint4.T-gemodificeerde TDN geladen met DOX) meer vroege apoptose, hogere celcyclusarrest en grotere cytotoxiciteit tegenover U87MG-cellen. Concluderend, gaven onze bevindingen aan dat DOX@Apt-TDN een nieuwe therapie biedt met veelbelovende klinische toepassing voor glioompatienten.

Inleiding

Gliom, een tumor afkomstig van het neuro-epitheelt, is de meest voorkomende intracraniële maligniteit. Bijna 1/3 van alle hersentumoren zijn gliomen, en ongeveer 4/5 van primaire maligne hersentumoren zijn gliomen [1,2,3,4]. Momenteel is de meest effectieve behandeling voor gliom chirurgische resectie en postoperatieve gelijktijdige chemoradiotherapie, maar helaas blijft de prognose voor patiënten slecht. Traditionele chemotherapie voor gliom toont geen goed resultaat vanwege slechte tumor-targeting, complicaties door de bloed-hersenbarrière (BBB) en bloed-tumorbarrière (BTB), en onvoldoende medicijntargeting. De BBB is de belangrijkste factor die de afgifte van bijna alle macromoleculen (inclusief geneesmiddelen en genen) aan de hersenparenchym en hun goede werking verhindert. Geneesmiddelen die de BBB niet kunnen passeren, moeten in voldoende hoge doses worden toegediend om een effectieve behandelingsconcentratie in het interessegebied te bereiken. Echter, overmatige geneesmiddelen kunnen ernstige systemische bijwerkingen en ongewilde medicijnaccumulatie in ongetroffen weefsels veroorzaken. Bovendien hebben bestaande conventionele anti-glioma geneesmiddelen onvoldoende targeting-capaciteiten [3, 4]. Nanodeeltjes zijn uitgekomen als de meest veelbelovende medicijndragende hulpmiddelen. Vanwege hun groottevoordeel kunnen nanodeeltjes de BBB dwarslopen en een anti-tumor effect uitoefenen. Kafa et al. [5] ontwierpen chemisch gefunctionaliseerde multi-wandige koolstofnanobuizen (f-MWNTs) gericht op ANG en bevestigden hun vermogen om de BBB te passeren door in vivo en in vitro experimenten. Echter, deze nanomaterialen kunnen worden verdeeld over verschillende organen door het hele lichaam of zelfs het centrale zenuwstelsel (CNS) binnendringen, waar ze neurotoxiciteit kunnen veroorzaken [6].

DNA is een ideaal materiaal voor nanostuctuurconstructie omdat de assemblage precies gecontroleerd kan worden door Watson-Crick baseparen [7]. Tot nu toe zijn een aantal twee-dimensionale (2D) en drie-dimensionale (3D) DNA-nanostructuren ontworpen en gedemonstreerd [8,9,10]. Tetraëdrische DNA-nanostructuren (TDN) hebben veel aandacht getrokken vanwege hun bio-compatibiliteit, stabiliteit, rijkelijkge functionele modificatiesites en lage immunogeniciteit [11,12,13]. Turberfield et al. synthetiseerden DNA-tetraëdrische nanostructuren met een hoge opbrengst met een eéntrapsynthese methode [14]. Walsh et al. vonden dat een nucleïnezuur-sonde-bevattende DNA-tetraëder zoogdiercellen kon binnendringen zonder behoefte aan transfectorreagens [15]. Lee et al. toonden aan dat zelf-geassembleerde tetraëdrische nanopartikelen gebruikt kunnen worden voor gerichte siRNA-afgifte in vivo [16]. TDN hebben uitstekende toepassingsperspectieven getoond in moleculaire diagnostiek, moleculaire afgifte en gerichte medicijntheapie. Ze worden ook breed gebruikt in onderzoek op tumoren in verschillende organen, zoals borstkanker [17]. Op dezelfde manier zijn TDN ook gebruikt in het onderzoek van zenuwstelselziektes. Tian et al. [18] gebruikten DNA-tetraëders als basis en modificeerden ze met angiopep-2 (ANG) om met succes de nanoprobe ANG-TDN te construeren, die laag-dichtheid lipoproteïne receptor-gerelateerd eiwit 1 (LRP-1) kon targeten voor gerichte imaging. Onderzoek heeft aangetoond dat ANG-TDN de BBB kan passeren. Ma et al. [19] suggereerden dat tetraëdrische DNA-nanostructuren zenuwstamcellen (NSCs) kunnen binnendringen zonder behoefte aan transfactieagenten, waar ze zenuwstamcelmigratie, proliferatie en differentiatie bevorderen [20], en groot potentieel hebben voor zenuwweefselherstel en regeneratie. Daarom onderzochten we de mogelijkheid van het gebruik van TDN in gliomatherapie en het verbeteren van de targeting-capaciteit.

Trombocyten-groeifactor receptor β (PDGFRβ) is een belangrijk lid van de tyrosine-proteïnekinasefamilie die betrokken is bij cellulaire proliferatie, migratie en angiogenese. Verschillende studies hebben aangetoond dat PDGFβ een veelbelovend doelwit is voor anti-tumortherapieën vanwege de rol in angiogenese [21, 22]. Aptamers zijn korte, enkelstrengs DNA of RNA oligonucleotide die geproduceerd worden door de systematische evolutie van liganden door exponentiële verrijking (SELEX) methode. Aptamers zijn vergelijkbaar met antilichamen, die hoge affiniteit en specificiteit hebben tegenover hun doelen [23]. Vanwege hun unieke eigenschappen spelen aptamers een belangrijke rol in de gerichte afgifte van chemotherapeutische agentia, siRNA's en medicijn-geladen nanodeeltjes. Gint4.T, een RNA-aptameer dat specifiek PDGFRβ kan binden, is ook een PDGFRβ-specifieke antagonist [24]. Monaco et al. [25] suggereerden dat Gint4.T aptamers de bloed-hersenbarrière (BBB) kunnen passeren en specifiek PDGFRβ herkennen. Gint4.T-geconjugeerde polymere nanodeeltjes (PNPs) kunnen gemakkelijk worden opgenomen door glioblastoma (GBM) cellen. In deze studie rapporteren we een nieuw medicijn-geladen systeem dat de Gint4.T aptameer en TDN combineert. De Gint4.T-gemodificeerde TDN (Apt-TDN) geladen met DOX (DOX@Apt-TDN) vertoonde verbeterde specifieke cellulaire opname en cytotoxiciteit tegen U87MG-cellen.

Methoden

Materialen

Alle DNA-oligonucleotiden en 2'F-Py RNA-oligonucleotiden werden gekocht van Sangon Biotech (Shanghai, China), en alle oligonucleotidensequenties zijn weergegeven in Tabel 1. GelRed DNA-gelektingsoplossing werd gekocht van Sangon Biotech. Zowel foetale kalverseerum (FBS) als Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) werden gekocht van Thermo Fisher (New York, VS). Doxorubiccine (DOX) werd gekocht van Mengbio Technology (Chongqing, China). U87MG-cellen werden gekocht van Shanghai Life Academy of Sciences Cell Library (Shanghai, China). DAPI werd gekocht van Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Peking, China).

Bereiding van DNA-nanostructuren

Om de DNA-tetraëder te assembleren (Tabel 1), werden 2 μL van elk oligonucletide (S1, S2, S3 en S4) toegevoegd aan 42 μL TM-buffer (10 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl₂, pH = 8). De DNA-oplossing werd vervolgens verhit tot 95 °C gedurende 5 min en daarna afgekoeld tot 4 °C gedurende 2 min met behulp van een Bio-Rad PCR-machine (Californië, VS) [26, 27]. De eindconcentratie van TDN was 2 μM. TDN' werd op dezelfde manier bereid behalve dat S1 vervangen werd door S1'. Om de Apt-TDN te synthetiseren, werd de Gint4.T aptameer toegevoegd aan TDN in een gelijke molaire verhouding, en het mengsel werd geïncubeerd bij 37 °C gedurende 60 min. Voor de synthese werd de aptameer onderworpen aan een korte denaturatie-renaturatiestap (85 °C gedurende 5 min, snelle afkoeling over 2 min en vervolgens opwarmen tot 37 °C over 10 min) [25].

Agarose gel elektroforese

Een agarosegel (3%) werd gelopen in 0,5× TEB-buffer bij 100 V gedurende 30 min. De temperatuur van het elektroforeseapparaat werd gehandhaafd op 0 °C door het apparaat in een ijbad te plaatsen. Voor de elektroforese werd GelRed toegevoegd aan het agarosegel om de DNA-strengen te kleuren. Toen het proces voltooid was, werd een Bio-Rad fluorescentiescanner (Californië, VS) gebruikt om een afbeelding van het gel vast te leggen.

Dynamische lichtverstrooiing

Een Malvern Zetasizer ZS90 (Malvern, VK) werd gebruikt om de hydrodynamische grootte en zetapotentiaal van de TDN te meten. In totaal 1 mL van de TDN (100 nM) werd onderworpen aan dynamische lichtverstrooiing (DLS) analyse.

Atoommicro scoop beeldvorming

De TDN werden gedilueerd tot 100 nM met TM-buffer (Tris-HCl buffer bevattende MgCl₂). Vervolgens werd 10 μL van elk TDN-monster toegevoegd aan vers gespleten mica en geïncubeerd gedurende 10 min. De monsters werden vervolgens afgebeeld op een atoommicro scoop (AFM) instrument in AC-modus (Agilent 5500, VS).

Meting van de medicijnladingscapaciteit van de bereide TDN

Doxorubiccine werd opgelost in gedemineraliseerd water om een 500-μM voorraadowplossing te maken. Doxorubiccine bij verschillende concentraties (1 tot 20 μM) werd gemengd met TDN (100 nM) of Apt-TDN (100 nM) gedurende 6 uur bij kamertemperatuur (24–26 °C). De gemengde oplossingen werden vervolgens gecentrifugeerd bij 12.000×g gedurende 10 min om de medicijn-geladen TDN te verkrijgen. Vervolgens werden 50 μL van de supernatanten verwijderd en gemengd met PBS in een 1:1 verhouding. Een Varioskan LUX microplaatlezer (Californië, VS) werd gebruikt om de fluorescentie-intensiteit van doxorubiccine (λ_ex = 480 nm en λ_em = 590 nm) te meten om het bedrag doxorubiccine in de supernatanten te bepalen [28]. De concentratie doxorubiccine geladen in de TDN werd berekend door de standaardcurve en fluorescentie-intensiteit. We mengden ook doxorubiccine met de TDN bij toenemende molaire verhoudingen.

Serumstabiliteit van de TDN in vitro

De TDN werden gemengd met compleet medium en geïncubeerd bij 37 °C gedurende 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 of 24 uur. De TDN-oplossingen werden gemengd met FBS in een 1:1 verhouding en geïncubeerd bij 37 °C gedurende 1, 3, 5 of 7 uur. Na incubatie werden de mengsels op een 3% agarosegel gelopen.

Cytotoxiciteit van de TDN in vitro

Om de cytotoxiciteit van de nanostructuur te bepalen, werden U87MG-cellen bij een concentratie van 1 × 10⁴ cellen/put gezaaid op een 96-put plaat. De celkweekmedium werd verwijderd, en vers medium bevattende 0–500 nM TDN werd toegevoegd en geïncubeerd voor nog eens 24 uur en 48 uur na overnachting incubatie. Vervolgens werd 10 μL CCK-8 oplossing toegevoegd aan elke put, en het mengsel werd geïncubeerd gedurende 1 uur. De absorbantie bij 450 nm werd vervolgens gemeten met een microplaatlezer.

Fluorescentiebeeldvorming

Cellulaire opname van DOX en TDN werd bestudeerd door fluorescentiemicroskopie (Olympus, Tokyo, Japan). U87MG-cellen werden gezaaid op dekkers in 24-put platen met medium bevattende 10% hitte-geïnactiveerd foetaal kalverseerum en 1% penicilline en streptomycine en gegroeid gedurende ten minste 1 dag bij 37 °C in een vochtige atmosfeer met 5% CO₂ tot de cellen ten minste 75% confluentie bereikten. Na incubatie werden de kweekmedia verwijderd. Compleet medium bevattende 100 nM Cy3-TDN en Cy3-Apt-TDN werd toegevoegd en geïncubeerd gedurende 3 uur. TDN en Apt-TDN werden gemarkeerd met Cy3 om de intracellulaire opname van nanopartikelen te detecteren. Om de cellulaire opname van DOX te beoordelen, werden DOX (DOX 2 μM), DOX@TDN (DOX 2 μM) en DOX@Apt-TDN (DOX 2 μM) toegevoegd aan U87MG-cellen en geïncubeerd gedurende 3 uur. Na 3 uur behandeling werden de cellen gefixeerd met 4% paraformaldehyde gedurende 20 min in het donker en vervolgens gekleurd met 4′,6-diamidino-2-fenylindole (DAPI) gedurende 5 min. De cellen werden drie keer gewassen met PBS en waargenomen onder een fluorescentiemicroskoop.

Stroomcytometrie

In totaal 1 × 10⁶ U87MG-cellen werden geïmplanteerd in 6-put platen. Na overnachting incubatie werden de kweekmedia verwijderd, en media aangevuld met 100 nM Cy3-TDN, 100 nM Cy3-Apt-TDN of 100 nM Cy3-Apt-TDN + 1 μM vrije Apt werden toegevoegd en geïncubeerd gedurende 3 uur. Vervolgens werden de cellen gefixeerd met 4% paraformaldehyde gedurende 20 min, en stroomcytometrie werd gebruikt om de percentages Cy-3-positieve cellen te analyseren.

Celcyclus en apoptose

Na behandeling met DOX, DOX@TDN of DOX@Apt-TDN gedurende 24 uur, werden 5 × 10⁵ cellen verzameld en gefixeerd in 75% ijskoude ethanol overnacht. Vervolgens werden de cellen geïncubeerd met RNase en propidiumiodide gedurende 30 min bij 37 °C in het donker. De celcyclus werd onderzocht door stroomcytometrie. Bovendien, na de verschillende behandelingen, werden de cellen gekleurd met Annexin V-FITC/DAPI, en vroege apoptose werd verkend.

CCK-8 Assays

Om cellevensvatbaarheid te bepalen, werden U87MG-cellen (5 × 10³) gezaaid op 96-put platen met 100 μL medium en gecultureerd overnacht bij 37 °C onder een atmosfeer met 5% CO₂. Het medium werd vervolgens verwijderd, en vers medium bevattende DOX, DOX-TDN of DOX-Apt-TDN werd toegevoegd. Na 24 uur incubatie werd 10 μL CCK-8 oplossing toegevoegd, en de cellen werden nog 1 uur gecultureerd. Een microplaatlezer werd gebruikt om de absorbantie bij 450 nm te meten.

Statistische analyse

Alle experimenten in deze studie werden in drievoud uitgevoerd, en alle data worden gepresenteerd als de gemiddelde waarde met de standaarddeviatie (gemiddelde ± SD). Statistische analyse werd uitgevoerd met het SPSS 24.0 programma (IBM, VS). Significante verschillen werden bepaald met Student's t-toets, met P < 0,05 aangevende significante verschillen tussen groepen.

Resultaten

Synthese en karakterisatie van de TDN en Apt-TDN

De TDN werd zelf-geassembleerd uit vier oligonucleotiden (Tabel 1) via eéntrapsynthese zoals eerder gerapporteerd [18, 29]. De tumor-targeting aptameer Gint4.T werd gebruikt om TDN te modificeren via Watson-Crick baseparen. De DNA-tetraëder bevat vier vlakken, waarbij elk vlak gevormd wordt door één oligonucletide. Dus vier oligonucleotiden hybridiseerden met elkaar om een DNA-tetraëder te vormen (Figuur 1a). Gelelektroforeseanalyse toonde een enkele duidelijke band in lanes 4 en 5, wat suggereert dat de TDN en Apt-TDN met succes waren geconstrueerd. De mobiliteit van de Apt-TDN was verminderd in vergelijking met die van de TDN, wat suggereert dat de Gint4.T aptameer de TDN met succes had gemodificeerd.

De groottes van de TDN en Apt-TDN werden bepaald door DLS en AFM. De TDN en Apt-TDN toonden deeltjesgroottes van respectievelijk 10,1 nm en 13,5 nm, wat de toevoeging van de Gint4.T ligand weerspiegelt (Figuur 1c (A), (B)). Omdat de hydrodynamische diameter watermoleculen omvat, waren de deeltjes groter dan hun theoretische groottes. De hoogtes van zowel de TDN als Apt-TDN bepaald door AFM beelden waren ~ 2 nm (Figuur 1b), wat aangeeft dat aptameer-modificatie de 3D-structuur niet veranderde. De gemiddelde zetapotentialen van de TDN en Apt-TDN waren respectievelijk −5,69 mV (C) en −7,3 mV (D) (Figuur 1c (C) (D)). Op basis van deze parameters concludeerden we dat de TDN en Apt-TDN met succes waren geassembleerd.

Stabiliteit en cytotoxiciteit van de TDN in vitro

Gelelektroforeseanalyse toonde aan dat de TDN intact bleven bij incubatie in compleet medium gedurende 24 uur bij 37 °C (Figuur 2a (A)). Bovendien, toen de concentratie foetaal kalverseerum werd verhoogd tot 50%, bleven de TDN stabiel gedurende ten minste 7 uur (Figuur 2a (B)), wat consistent is met eerdere rapporten [18, 26]. Om de cytotoxiciteit van de nanostructuur te bepalen, werd de CCK-8 assay gebruikt om de cellevensvatbaarheid van U87MG-cellen na behandeling met de TDN bij een aantal concentraties te beoordelen. Zoals getoond in Figuur 2b, werd geen significante cytotoxiciteit waargenomen in U87MG-cellen behandeld met TDN bij 0–500 nM gedurende 24 uur en 48 uur. Daarom kunnen DNA-nanodeeltjes gebruikt worden als stabiele en bioveilige dragers voor medicijnafgifte.

Medicijnladingscapaciteit van de TDN en Apt-TDN

Doxorubiccine is een breed-spectrum chemotherapeutisch medicijn dat kan intercalareren in DNA-dubbele strengen. We berekenden een standaard doxorubiccine-curve (Figuur 3a) en onderzochten vervolgens de intercalatie van doxorubiccine in de TDN. Het bedrag geïntercaleerde doxorubiccine in de TDN en Apt-TDN nam geleidelijk toe met toenemende doxorubiccine-concentratie. Toen de doxorubiccine-concentratie 14 μM was, piekte het bedrag doxorubiccine geïntercaleerd in de TDN en Apt-TDN op 5,5 μM en 6,0 μM respectievelijk, en plateau-de daarna (Figuur 3b), wat aangeeft dat de DNA-strengen volledig bezet waren. Tegelijkertijd mengden we doxorubiccine met de TDN bij toenemende molaire verhoudingen. Het fluorescentiespectrum van doxorubiccine werd gescand voor analyse. Zoals getoond in Figuur 3c, werd het fluorescentiespectrum van doxorubiccine gedempt met doxorubiccine bij een molaire verhouding van 0,05. Op basis van deze bevindingen concludeerden we dat ongeveer 55 moleculen doxorubiccine in een enkele TDN bevatten waren, terwijl 60 moleculen in een enkele aptameer-gemodificeerde DNA-tetraëder bevatten waren.

Gerichte cellulaire opname van de Apt-TDN

DNA is een negatief geladen macromolecuul, wat de instap in het negatief geladen celmembraan moeilijk maakt. Doorgaans moeten individuele DNA-moleculen cellen benaderen met hulp van transfectorreagens. Hier markeerden we TDN en Apt-TDN met Cy3 om de intracellulaire opname van de nanopartikelen te monitoren. Na incubatie met U87MG-cellen gedurende 3 uur, ontstond een rood Cy3-fluorescentiesignaal in het cellulair cytoplasma, wat aangeeft dat de TDN het cytomembraan banden en zonder hulp van transfectorreagens in de cel werden opgenomen (Figuur 4a). De Apt-TDN toonde hogere rode fluorescentie, wat suggereert dat de aanwezigheid van de Gint4.T aptameer de DNA-tetraëder opname door U87MG-cellen aanzienlijk verhoogde. Echter, toen vrije aptameer werd toegevoegd, daalde de Cy3-fluorescentie naar het niveau waargenomen voor de TDN alleen. Vanwege competitieve inhibitie door de vrije aptameer, infereren we dat de aptameer op de TDN de opname van de TDN niet kon faciliteren. Op basis van deze competitieve inhibitie bewijzen we dat de Apt-TDN U87MG-cellen kan targeten. Stroomcytometrie bevestigde verder dat het percentage Cy3-positieve U87MG-cellen hoger was in de Apt-TDN groep dan in de TDN groep. Vrije Apt verlaagde het percentage Cy3-positieve U87MG-cellen in de Apt-TDN groep (Figuur 4b).

Cellulaire opname van de DOX@TDN en DOX@Apt-TDN

We gebruikten het karakteristieke fluorescentiespectrum van doxorubiccine om de medicijnopname-efficiëntie te beoordelen. Na 3 uur behandeling werd intracellulaire doxorubiccine geïmageerd door fluorescentiemicroskopie (Figuur 5a). Vrije doxorubiccine kon U87MG-cellen binnendringen en was gelokaliseerd in de kern. Met de toevoeging van DOX@TDN was de fluorescentie hoger dan die van vrije doxorubiccine. Dit resultaat suggereerde dat DNA-nanodeeltjes de cellulaire opname van doxorubiccine verhoogden. Toen DOX@Apt-TDN werd toegevoegd, was het rode signaal in de kern nog hoger dan die van cellen waaraan DOX@TDN was toegevoegd. Semi-kwantitatieve analyse van de intracellulaire opname van DOX bevestigde verder dat de Apt-TDN een meer dan tweevoudige toename van intracellulaire DOX-opname faciliteerde in vergelijking met dat voor het enkele medicijn. We infereren dat dit komt door Gin4.T-specifieke binding aan receptoren, waarna meer nanopartikelen de cel kunnen binnendringen. Na verteering in lysosomen kan doxorubiccine vrijgekomen in het cytoplasma en verder functioneren in de kern.

Cytotoxiciteit van DOX, de DOX@TDN en de DOX@Apt-TDN

Voor de cytotoxiciteitsstudie werden drie groepen U87MG-cellen behandeld met verschillende concentraties doxorubiccine (Figuur 6a). De IC₅₀ waarden voor doxorubiccine waren 13,39 μM voor DOX-behandeling, 7,826 μM voor DOX@TDN-behandeling en 4,205 μM voor DOX@Apt-TDN-behandeling. Onder de drie behandelingen toonde de DOX@Apt-TDN de hoogste cytotoxiciteit na 24 uur, wat de specificiteit van de Apt-TDN voor U87MG-cellen aangeeft. Na 24 uur werden cellen in de DOX, DOX@TDN en DOX@Apt-TDN groepen verzameld en gebruikt om vroege apoptose te verkennen. Onze data toonden aan dat de vroege apoptose-ratio hoger was in de DOX@Apt-TDN groep dan in de andere twee groepen (Figuur 6b). Bovendien was de fractie cellen in G0/G1-fase toegenomen in de DOX-Apt-TDN groep in vergelijking met de DOX en DOX-TDN groepen (p < 0,01), en de verhouding cellen in S-fase was afgenomen in de DOX-Apt-TDN groep (p < 0,01) (Figuur 6c). Het percentage cellen in G2-fase was niet veranderd (data niet getoond).

Discussie

Of via in vitro of in vivo experimenten, de stabiliteit van een medicijn en de drager moet worden bepaald. Na assemblage van de TDN, werd de stabiliteit ervan eerst in vitro bepaald. Deze studie toonde aan dat de 3D-structuur van DNA-nanodeeltjes hun stabiliteit in serum kan verbeteren door enzymbinding te inhibiteren. De biologische veiligheid van de relevante nanostructuur is de belangrijkste vereiste voor de toepassing. Geen significante cytotoxiciteit werd waargenomen in U87MG-cellen geco-cultureerd met verschillende concentraties van de TDN gedurende 24 uur of 48 uur. Geen van de DNA-sequenties die in deze studie gebruikt worden, codeert voor genetische informatie, en geen bijwerkingen werden gerapporteerd in de cytotoxiciteitstest. Daarom kan de TDN dienen als een veilige en stabiele medicijndrager.