Exosomale miR-18b-3p van humane navelstreng MSC's verlaagt pre-eclampsie risico door leptin te targeten

Samenvatting

Exosomen afgeleid van humane navelstreng mesenchymale stamcellen (hucMSC's) die microRNA's expresseren, zijn benadrukt in humane ziekten. Echter, het gedetailleerde moleculaire mechanisme van hucMSC-afgeleide exosomale miR-18b-3p op pre-eclampsie (PE) vereist nog verder onderzoek. We wilden het effect van exosomen en miR-18b-3p/leptine (LEP) op het optreden van PE onderzoeken. De morfologie van de hucMSC en hucMSC-exosomen (Exos) werd geïdentificeerd. De exosomen werden geïnfecteerd met verschillende lentivirus die miR-18b-3p expresseren om de rol van miR-18b-3p in PE te verkennen. Het PE rattenmodel werd vestigd door intraperitoneale injectie van N-nitro-L-arginine methyl ester. De expressie van LEP en miR-18b-3p werd getest in PE ratten placenta weefsels. Ook werd het effect van exosomen op LEP en miR-18b-3p expressie gedetecteerd. De systolische bloeddruk (SBP), proteinurie, inflammatoire factoren, het gewicht van foetale rat en placenta en celdood in PE ratten werden gedetecteerd. Tot slot werd de relatie tussen miR-18b-3p en LEP geverifieerd met behulp van dubbele-luciferase reporter gen assay en RNA pull-down assay. Exosomen, herstel van miR-18b-3p of inhibitie van LEP verlaagden SBP en proteinurie van PE ratten alsook verhoogden het gewicht van foetale rat en placenta, verlaagden serum niveaus van inflammatoire factoren alsook onderdrukten apoptotische cellen van PE ratten, uitoefenend een onderdrukkend effect op PE progressie. miR-18b-3p was verlaagd en LEP was verhoogd in placenta weefsels van PE ratten. LEP was het directe doelgen van miR-18b-3p. Up-regulatie van miR-18b-3p of behandeling met de exosomen onderdrukte LEP expressie en verminderde PE optreden, terwijl down-regulatie van miR-18b-3p tegenovergestelde effecten had. Gedown-reguleerde LEP keerde het effect van miR-18b-3p reductie op PE ratten om. HucMSC-afgeleide exosomale miR-18b-3p target LEP om deel te nemen aan het optreden en de ontwikkeling van PE. Deze studie kan een nieuwe theoretische basis bieden voor het mechanisme en onderzoek van PE.

Inleiding

Pre-eclampsie (PE), gekenmerkt door proteinurie en hypertensie [1], is een belangrijke oorzaak van foetale en moederlijke sterfte en ziekte in de menselijke zwangerschap [2]. De etiologie en pathogenese van PE zijn niet duidelijk [3], wat gerapporteerd is geassocieerd met abnormale trofoblaast invasie resulterende in moederlijke endotheel dysfunctionele, chronische placenta malperfusie en hypertensie met nadelige uitkomsten [4]. Met uitzondering van foetale en placentaaflevering, is er geen specifieke therapie voor PE [5]. Daarom is het dringend om therapeutische doelen te verkennen om de prognose van deze ziekte te verbeteren.

Humane navelstreng (huc) is een geschikte bron van mesenchymale stamcellen (MSC's) die een verscheidenheid aan trofische factoren en cytokines secretoren alsook sterke anti-inflammatoire en immunomodulerende capaciteiten tonen [6]. Een studie heeft geverifieerd dat PE neurogliale markerexpressie in navelstreng Wharton's jelly-geleide MSC's versnelt [7]. Een beschermend effect van hucMSC exosomen (Exos) op placenta morfologie en angiogenese in PE ratten is ook gerapporteerd [8]. Exosomen zijn kleine (50–100 nm) secretorische vesiculen die communicatie tussen cellen in de tumor micro-omgeving bemiddelen via encapsuleren en transmissie van carcinogene factoren naar verafgelegen plaatsen of naar omringende cellen door de circulatie [9]. Een studie heeft de schade van vasculaire functies en complicaties onthuld geïnduceerd door effectieve overdracht van sFlt-1 en sEng in endotheele cellen in patiënten met PE door exosomen [10]. MicroRNA's (miRNA's) zijn endogene, niet-coderende RNA's met een lengte van 18–25 nucleotiden, en reguleren de genexpressie op post-transcriptioneel niveau [11]. De data in een studie hebben gerapporteerd dat miR-18b expressie celinvasie, vitaliteit en migratie van trofoblaast cellen in PE beïnvloedt [12]. Verder hebben Wu et al. voorgesteld dat miR-18b proliferatie in humane retina endotheele cellen geïnduceerd door hoge glucose attenueert, wat een nieuw inzicht kan bieden in het begrijpen van het mechanisme van diabetische retinopathie pathogenese [13]. Echter, de rol van hucMSC-afgeleide exosomale miR-18b-3p in PE blijft onbekend. Leptine (LEP) heeft pleiotrope effecten op celdifferentie/proliferatie en immuniteit van fysiologische toestanden en ontstaat voornamelijk uit adipocyten, naast andere weefsels, inclusief placenta [14]. Een studie heeft geverifieerd dat de abnormale LEP promotor methylatie betrokken is bij de PE progressie [15]. Een andere studie heeft voorgesteld dat placenta een hoofdplaats is van de expressie van LEP in zwangerschap [16]. Niettemin is de bindingsrelatie tussen miR-18b-3p en LEP nog onontgonnen. Daarom wilden we de rol van hucMSC-afgeleide exosomale miR-18b-3p in PE verkennen met de betrokkenheid van LEP, en we concludeerden dat hucMSC-afgeleide exosomale miR-18b-3p PE progressie kan inhibiteren via targeting LEP.

Materialen en Methodes

Ethische Goedkeuring

De studie werd goedgekeurd door het Institutionele Review Board van het Volksziekenhuis van Wuhan Universiteit. Alle deelnemers tekenden een document van geïnformeerde toestemming. Alle dierproeven waren in overeenstemming met de Richtlijn voor de Zorg en Gebruik van Laboratoriumdieren door Internationale Commissies van het Volksziekenhuis van Wuhan Universiteit.

Isolatie, Cultuur en Identificatie van HucMSC's

De foetale navelstreng afgeleverd door gezonde kraamvrouwen werd verzameld en in kleine stukjes gesneden en gefiltreerd met een zeef dan gemengd met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). De navelstreng weefsels werden gecentrifugeerd bij 1500 t/min gedurende 5 min met 10 cm centrifugeradius. De weefsels werden opgeschud in Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)/F12 bevattend 10% foetale kalfserum (FBS) en overgebracht naar een cultuurfles. De vloeistoffen werden na 4 dagen veranderd en daarna elke 3 dagen eenmaal. Cellen werden sub-gekweekt toen de confluentie ongeveer 90% bereikte. De adherente groei en morfologie van hucMSC's werden waargenomen onder een lichtmicroscoop. De cellen werden gekleurd met olie rood O kleurstofoplossing (Beyotime Instituut voor Biotechnologie, Shanghai, China) om osteogene differentiatie van hucMSC's te detecteren en gekleurd met alkalische fosfatase (ALP) kleurstofoplossing (Beyotime) om adipogene differentiatie van hucMSC's te detecteren. Een flowcytometer (Beckman Coulter Life Sciences, Brea, CA, VS) werd gebruikt om CD73, CD166 (beide 1: 10, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, VS) en CD105 (1: 20, AbD Serotec, Oxford, VK) te testen.

Extractie en Identificatie van HucMSC-Exos

De goed groeiende hucMSC's werden gekweekt. Het supernatans werd verzameld en gecentrifugeerd bij 28.500 t/min gedurende 1 uur met 10 cm centrifugeradius. Het supernatans werd weggegooid, en de cellen vastgezet met 2% glutaraldehyde en 1% oszuur, gedeshydrateerd met ethanol, gedoopt in propylene oxide, gedroogd gedurende 2 uur, ingebakken in Epon812 en gesneden. De sneden werden gekleurd met uraan en lood, respectievelijk. Ten slotte werden de exosomen waargenomen onder de elektronenmicroscoop. Nanosight detector (Malvern Instruments, Malvern, VK) werd gebruikt om Brownse beweging imaging van exosoom nanodeeltjes en de grootte te detecteren. De oppervlaktemarkers van hucMSC-Exos werden geïdentificeerd door western blot assay, en de resultaten toonden aan dat hucMSC-Exos CD9, CD81 en CD63 exprimeerden.

Lentivirus Infectie Methode

HucMSC werd geïnfecteerd met lentivirus bevattende lage expressie van miR-18b-3p vector en lage expressie van miR-18b-3p vector negatieve controle (NC) (Shanghai GenePharma Co, Ltd, Shanghai, China). Uiteindelijk werden de stabiel geëxprimeerde hucMSC-antagomir NC en hucMSC-miR-18b-3p antagomir verkregen. Cellen werden 48 uur gekweekt, en het supernatans werd verzameld en gecentrifugeerd met ultracentrifugatie om de corresponderende Exos-antagomir NC en Exos-miR-18b-3p antagomir te verkrijgen.

Experimentele Dieren

Wistar ratten (wegen 200–250 g, 8 w oud, ongeacht geslacht) in een gezond-schoon niveau en seksuele rijpheid werden geselecteerd (het Experimenteel Dierencentrum van Wuhan Universiteit, Wuhan, China). De ratten werden gevoed in een barrièresysteem met een temperatuur van 18–28 °C, relatieve vochtigheid van 40–70% en voldoende dieet en water.

Vestiging van Ratten PE Modellen

Het ratten PE model werd vestigd door intraperitoneale injectie van 50 mg/kg stikstofmonoxide synthetase remmer, N(G)-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME, Beyotime) met referentie naar een artikel [17]. De succesvolle vestiging van PE model was gebaseerd op verhoogde bloeddruk met 20 mmHg en hoger dan 115 mmHg alsook verhoogde proteinurie.

Dier Groepering

De vrouwtjesrat en de mannetjesrat werden willekeurig samen gehuisvest op 1: 1, en de twee ratten werden in een individuele speciale kooi gehouden om 5–6 uur 's avonds de vorige dag. De sperma in de vaginaal afscheiding van de vrouwtjesratten werd waargenomen door vaginaal propje en microscoop de volgende dag. Als het resultaat positief was op hetzelfde moment, werd de dag vastgelegd als de 0e dag van zwangerschap. Vanaf de 13^e dag van zwangerschap, werden ratten verdeeld in 6 groepen (10 ratten in elke groep): normale groep (hetzelfde bedrag normaal zoutoplossing werd intraperitoneaal geïnjecteerd van dag 13 tot dag 20 van zwangerschap), PE groep (L-NAME [50 mg/kg per dag] werd intraperitoneaal geïnjecteerd van dag 13 tot dag 20 van zwangerschap, en 20 μL van normaal zoutoplossing werd geïnjecteerd in de placenta op dag 16 tot dag 19 van zwangerschap), PE + miR-NC groep (L-NAME [50 mg/kg per dag] werd intraperitoneaal geïnjecteerd van dag 13 tot dag 20 van zwangerschap, en 20 μL van 4 nmol miR-NC werd geïnjecteerd in de placenta op dag 16 tot dag 19 van zwangerschap), PE + miR-18b-3p agomir groep (L-NAME [50 mg/kg per dag] werd intraperitoneaal geïnjecteerd van dag 13 tot dag 20 van zwangerschap, en 20 μL van 4 nmol miR-18b-3p agomir werd geïnjecteerd in de placenta op dag 16 tot dag 19 van zwangerschap), PE + miR-18b-3p antagomir groep (L-NAME [50 mg/kg per dag] werd intraperitoneaal geïnjecteerd van dag 13 tot dag 20 van zwangerschap, en 20 μL van 4 nmol miR-18b-3p antagomir werd geïnjecteerd in de placenta op dag 16 tot dag 19 van zwangerschap), PE + miR-18b-3p antagomir + small interfering RNA (si)-LEP groep (L-NAME [50 mg/kg per dag] werd intraperitoneaal geïnjecteerd van dag 13 tot dag 20 van zwangerschap, en 20 μL van 4 nmol miR-18b-3p antagomir en si-LEP werd geïnjecteerd in de placenta op dag 16 tot dag 19 van zwangerschap) en PE + si-LEP groep (L-NAME [50 mg/kg per dag] werd intraperitoneaal geïnjecteerd van dag 13 tot dag 20 van zwangerschap, en 20 μL van 4 nmol si-LEP werd geïnjecteerd in de placenta op dag 16 tot dag 19 van zwangerschap). Ratten werden behandeld met exosomen en exosomen dragende lentivirussen. De ratten werden toegewezen aan 5 groepen (10 ratten in elke groep): normale groep (hetzelfde bedrag normaal zoutoplossing werd intraperitoneaal geïnjecteerd van dag 13 tot dag 20 van zwangerschap), PE groep (L-NAME (50 mg/kg per dag) werd intraperitoneaal geïnjecteerd van dag 13 tot dag 20 van zwangerschap, en 20 μL van normaal zoutoplossing werd geïnjecteerd in de placenta op dag 16 tot dag 19 van zwangerschap), PE + Exos groep (L-NAME (50 mg/kg per dag) werd intraperitoneaal geïnjecteerd van dag 13 tot dag 20 van zwangerschap, en 20 μL van Exos (80 μg exosomen werden opgeschud in 20 μL normaal zoutoplossing) werd geïnjecteerd in de placenta op dag 16 tot dag 19 van zwangerschap), PE + Exos-antagomir NC groep (L-NAME (50 mg/kg per dag) werd intraperitoneaal geïnjecteerd van dag 13 tot dag 20 van zwangerschap, en 20 μL van Exos-antagomir NC (80 μg exosomen werden opgeschud in 20 μL normaal zoutoplossing) werd geïnjecteerd in de placenta op dag 16 tot dag 19 van zwangerschap) en PE + Exos-miR-18b-3p antagomir groep (L-NAME (50 mg/kg per dag) werd intraperitoneaal geïnjecteerd van dag 13 tot dag 20 van zwangerschap, en 20 μL van Exos-miR-18b-3p antagomir (80 μg exosomen werden opgeschud in 20 μL normaal zoutoplossing) werd geïnjecteerd in de placenta op dag 16 tot dag 19 van zwangerschap).

Detectie van Systolische Bloeddruk (SBP) en Bepaling van 24-uurs Proteinurie

De druk van ratten werd gemeten door ratten staart-arterie bloeddruk meting. De staart-manschet SBP van alle zwangere ratten werd gemeten op de 10e, 13e, 16e en 19e dag van zwangerschap met behulp van de ratten staart arterie druk detector (Tensys (R) Medical Inc., San Diego, CA, VS). De druk werd 3 keer in een korte tijd gemeten; daarna werd de gemiddelde waarde genomen als de bloeddruk.

In het geval van vrij dieet en water, werd de 24-uurs urinen van zwangere ratten verzameld op de 10e, 13e, 16e en 19e dag van de zwangerschap, en het eiwitinhalte werd gedetecteerd in de nefrologie afdeling van het Volksziekenhuis van Wuhan Universiteit.

Monsterverzameling

De zwangere ratten werden geanesthetiseerd met 3% pentobarbitaal natrium op de 21e dag van zwangerschap. Het perifeer bloed van de ratten werd bewaard, gecentrifugeerd om het serum te nemen en opgeslagen in de koelkast bij –20 °C voor stand-by. Vervolgens werden foetale rat en placenta genomen door keizersnede, het foetale membraen en de verbonden navelstreng werden verwijderd, en de navelstreng verbonden met de foetale rat werd afgeknipt. De placenta en foetale rat werden op aseptische gazen gelegd om bloed en vruchtwater respectievelijk te drogen, en vervolgens op de analytische balans gelegd om het gewicht te wegen. Een deel van placenta weefsels werd vastgezet met 4% paraformaldehyde, gedeshydrateerd met ethanol, opgeruimd met xyleen, ingebakken met paraffine en continu dwarsgesneden (5 μm) voor hematoxyline-eosine (HE) kleuring en terminale deoxynucleotidyl transferase-gemedieerde deoxyuridine trifosfaat-biotine nick end-labeling (TUNEL) kleuring. De rest werd opgeslagen bij -80 °C voor reverse transcriptie kwantitatieve polymerase ketting reactie (RT-qPCR) detectie, Western blot analyse en enzyme-gekoppelde immunosorbent assay (ELISA).

ELISA

Tumornecrosefactor-α (TNF-α), interleukine (IL)-1β en IL-6 inhoud in serum werden getest door ELISA. De concentraties van TNF-α, IL-1β en IL-6 werden bepaald volgens de instructies van de kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, VS). Optische dichtheid (OD) waarden (490 nm) werden getest door een microplaat lezer (Thermo Fisher Scientific, MA, VS). De corresponderende standaardcurve werd verkregen door de OD waarde als de abscis en de concentratie van het corresponderende standaardmonster als de ordinaten te gebruiken. TNF-α, IL-1β en IL-6 concentraties werden berekend uit de standaardcurve.

HE Kleuring

De paraffine monsters van placenta weefsels werden opgeruimd in xyleen, gedeshydrateerd door conventionele gradient alcohol, gekleurd met hematoxyline, gedifferentieerd door 1% chloorwaterstof alcohol en teruggekeerd naar blauw door 1% ammonia water. Vervolgens werden de weefsels tegengekleurd met 1% eosine oplossing, gedeshydrateerd (75%, 90%, 95% ethanol, respectievelijk, absolute ethylalcohol) en opgeruimd door xyleen, gedroogd, geblokkeerd en waargenomen onder de elektronenmicroscoop.

TUNEL Kleuring

Paraffine-ingebakken sneden werden routinematig gedewaxt en gedeshydrateerd volgens de instructies, en vervolgens werd apoptose gedetecteerd door TUNEL Kit (Nanjing Kejin Biotechnologie Co., Ltd., Jiangsu, China). 4,6-Diamino-2-fenylindole (Shanghai Baitai Biotechnologie Co., Ltd., Shanghai, China) werd gebruikt om TUNEL-positieve cellen te waarnemen met een fluorescentiemicroscoop (Nikon, Tokyo, Japan) [18].

RT-qPCR

De placenta weefsels werden gewogen. Per 50–100 mg placenta weefsels werden toegevoegd met 1 mL TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, Californië, VS) en volledig opgelost. De weefsels werden toegevoegd met 200 μL chlorofoorm en gecentrifugeerd bij 4 °C, 12.000 t/min om het totale RNA te extraheren. De concentratie en zuiverheid van RNA werden bepaald door DU-800 eiwit nucleïnezuur spectrofotometer (Beckman). U6 en β-actine werden gebruikt als laadcontroles. PCR primers werden ontworpen en samengesteld door Shanghai Sangon Biotechnologie Co. Ltd. (Shanghai, China). De primer sequenties zijn vermeld in Tabel 1. RNA werd omgezet naar cDNA op basis van instructies van RNA reverse transcriptie kit (Sangon). PCR geamplificeerd en producten geverifieerd door agarose gel elektroforese. De data werden berekend door 2^−ΔΔCt methode.

Western Blot Assay

Het totale eiwit van placenta weefsels werd geëxtraheerd door radio-immunoprecipitatie assay cel lyse buffer (Beyotime). HucMSC-Exo werd gebruikt om buffer te extraheren, wat gecentrifugeerd werd bij 14.000 t/min. Het supernatans werd bewaard voor het testen van de eiwitexpressie van exosomaal markereiwit (CD81, CD63 en CD9) in serum. De eiwitconcentratie werd bepaald door bicinchoninzuur kit (Beyotime, P0010). Het monster werd geladen volgens de kwantitatieve resultaten van eiwit, behandeld met 10% natrium dodecyl sulfaat-polyacrylamide gel elektroforese en overgebracht naar membraan. Het membraan werd geblokkeerd met 5% gemelkte melk, geprobed met primaire antilichamen LEP, CD63, CD81, CD9 en β-actine (4 mL, 1:1000, Santa Cruz Biotechnologie, Inc, Santa Cruz, CA, VS), opnieuw geprobed met 4 mL secundair antilichaam geit anti-konijn IgG/peroxidase, blootgesteld en ontwikkeld. β-Actine werd gebruikt als interne referentie. De grijwaarde werd geanalyseerd door gel grafische analyse software Image Lab.

Dubbele-Luciferase Reporter Gen Assay

Online voorspellende software https://cm.jefferson.edu/ werd gebruikt om de doelrelatie tussen miR-18b-3p en LEP alsook de bindingsplaats van miR-18b-3p en LEP 3′onvertaalde regio (UTR) te voorspellen. De LEP 3′UTR promotor regio sequentie bevattende miR-18b-3p bindingsplaats werd samengesteld. De LEP 3′UTR wild-type (WT) plasmid en LEP 3′UTR mutant type (MUT) werden geconstrueerd. De recombinante plasmiden werden genoemd als LEP 3′UTR-WT en LEP 3′UTR-MUT, respectievelijk. De gekweekte 293T cellen werden co-getransfecteerd met miR-18b-3p mimic en LEP 3′UTR-WT, miR-18b-3p mimic en LEP 3′UTR-MUT, mimic NC en LEP 3′UTR-WT, mimic NC en LEP 3′UTR-MUT gedurende 30 uur. Vervolgens werden 293T cellen verzameld. Vuurvlieg en renilla luciferase activiteit in cellen werden gemeten door luminescentie metingen in overeenstemming met dubbele-luciferase reporter gen detectiekit (Promega, Madison, WI, VS).

RNA Pull-Down Assay

Biotine-gelabelde RNA sondes (Bio-miR-NC, Bio-miR-18b-3p en Bio-miR-18b-3p-Mut) werden geïnculeerd met het lysaat van 293T cellen en geëxtraheerd met magnetische korrels geconjugeerd met antibioticum streptomycine. Het experiment werd uitgevoerd op basis van instructies van Pierce magnetische RNA pull-down kits (Pierce, IL, VS). De RNA werd geëlueerd en gezuiverd met TRIzol (Pierce). De verrijking van LEP in RNA complex werd gekwantificeerd met RT-qPCR zoals eerder beschreven [19].

Statistische Analyse

Alle data werden verklaard door SPSS 21.0 software (IBM Corp. Armonk, NY, VS). De meetdata werden aangegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie. De data werden uitgevoerd door onafhankelijke steekproef t test voor twee groepen vergelijkingen, terwijl vergelijkingen onder meerdere groepen beoordeeld werden door eensijdige variantieanalyse (ANOVA) gevolgd door Tukey's post hoc test. Het criterium voor statistische significantie was ingesteld op p < 0,05.

Resultaten

Morfologie en Identificatie van de HucMSC en HucMSC-Exos

De navelstreng weefselmassa's werden waargenomen onder een omgekeerde microscoop. Het kon gezien worden dat cellen op dag 3 uit de weefselmassa kroopen; cellen toonden spindelvormig en draadachtig alsook groeiden als kolonie op ongeveer 5 dagen. Toen gekweekt tot passage 3, was de morfologie van cellen uniform lang vusvormig en vergelijkbaar met fibroblast morfologie, en de rangschikking was regelmatig (Fig. 1a). Na 2 w adipogene differentiatie van hucMSC, werden lipiddruppels gevormd in het cytoplasma, en de lipiddruppels toonden Kranz structuur onder de omgekeerde microscoop (Fig. 1b), wat suggereert dat de geïsoleerde gekweekte hucMSC de capaciteit van adipogene differentiatie had. Na 2 w osteogene differentiatie, kon een groot aantal bruine calcium knopen gezien worden onder een omgekeerde microscoop (Fig. 1c), wat aangeeft dat geïsoleerde gekweekte hucMSC de capaciteit van osteogene differentiatie had. Een flowcytometer werd gebruikt om het immunofenotype van cellen te testen, en de resultaten omvatten dat cellen oppervlaktemarkers CD73, CD105 en CD166 van MSC's overexprimeerden (Fig. 1d).

Morfologie en identificatie van de hucMSC en hucMSC-Exos. a De morfologie van de hucMSC onder de omgekeerde microscoop, b hucMSC getest door olie rood O kleuring. c hucMSC getest door ALP kleuring. d Flowcytometrie gebruikt om immunofenotype te detecteren. e De vorm en grootte van hucMSC-Exos waargenomen door een TEM. f Detectie van deeltjesgrootteverdeling van exosomen met Nanosight analyse. g Eiwitexpressie van CD9, CD81 en CD63 in hucMSC-Exos gedetecteerd door western blot assay

De morfologie van hucMSC-Exos werd waargenomen door de TEM, en de resultaten presenteerden dat de exosomen rond of ovaal waren met lage centrale dichtheid en dikke kleuring aan beide kanten (Fig. 1e). Nanosight analyse werd gebruikt om de deeltjesgrootte van exosomen te analyseren, en de resultaten toonden aan dat de deeltjesgrootte voornamelijk verdeeld was tussen 40 en 100 nm, meer geconcentreerd rond 80 nm (Fig. 1f). Western blot assay onthulde dat alle oppervlaktemarkers CD81, CD63 en CD9 geëxprimeerd waren in hucMSC-Exos (Fig. 1g).

Herstel van miR-18b-3p Verlicht Pathologische Kenmerken van PE Ratten

De resultaten van SBP en 24-uurs proteinurie presenteerden dat: er was geen significant verschil in SBP en 24-uurs proteinurie in 6 groepen vóór administrasie (dag 10 van zwangerschap). SBP en 24-uurs proteinurie in dag 19 van zwangerschap toonden geen duidelijke verschillen in normale ratten. In PE ratten of PE ratten behandeld met miR-NC, miR-18b-3p agomir, miR-18b-3p antagomir, miR-18b-3p antagomir + si-LEP, si-NC of si-LEP, begonnen SBP en 24-uurs proteinurie te stijgen op dag 13 van zwangerschap. Er was geen duidelijk verschil van SBP en 24-uurs proteinurie in dag 16 en dag 19 van zwangerschap in PE ratten behandeld met miR-18b-3p agomir en si-LEP. PE ratten hadden verhoogde SBP en 24-uurs proteinurie in dag 19 van zwangerschap; deze toename werd verminderd door miR-18b-3p elevatie maar verder versterkt door miR-18b-3p inhibitie; LEP reductie onthield de rol van miR-18b-3p downregulatie in de SBP en 24-uurs proteinurie op dag 19 van zwangerschap in PE ratten (Fig. 2a, b).

Herstel van miR-18b-3p verlicht pathologische kenmerken van PE ratten. a Resultaten van SBP in ratten. b Resultaten van 24-uurs proteinurie in ratten. c Gewijzigingen van foetale ratten gewicht. d Veranderingen van placenta gewicht in ratten. e Veranderingen van inflammatoire factoren in serum gedetecteerd met ELISA. n = 10, *p < 0,05 versus de normale groep. ^p < 0,05 versus de PE + miR-NC groep. ^@p < 0,05 versus de PE + miR-18b-3p antagomir groep. ^&p < 0,05 versus de PE + si-NC groep. Meetdata werden afgebeeld als gemiddelde ± standaarddeviatie, en vergelijkingen onder meerdere groepen werden beoordeeld door eensijdige ANOVA gevolgd door Tukey's test

Het gewicht van foetale rat en placenta daalde in de PE ratten; up-regulatie van miR-18b-3p of down-regulatie van LEP verhoogde, terwijl down-regulatie van miR-18b-3p het gewicht van foetale rat en placenta in PE ratten verlaagde; LEP silencing keerde het effect van miR-18b-3p inhibitie op het gewicht van foetale rat en placenta in PE ratten om (Fig. 2c, d).

Inflammatoire factoren in serum van PE ratten werden gedetecteerd. Het werd gevonden dat TNF-α, IL-1β en IL-6 inhoud verhoogd was in de PE ratten; miR-18b-3p elevatie of LEP inhibitie onderdrukte, terwijl miR-18b-3p reductie de inhoud van TNF-α, IL-1β en IL-6 bevorderde; het effect van geïnhibeerde miR-18b-3p op TNF-α, IL-1β en IL-6 inhoud werd onthield door LEP depletie (Fig. 2e).

Overgeëxprimeerde miR-18b-3p Verbetert Histopathologische Verandering van Placenta Weefsels van PE Ratten

In normale ratten was de placenta villus rijk aan bloedvaten en had een duidelijke structuur, syncytiotrofoblasten waren de hoofdtrofoblasten in placenta villi, en er waren minder cytotrofoblasten. In PE ratten of PE ratten behandeld met miR-NC, miR-18b-3p antagomir, si-NC of miR-18b-3p antagomir + si-LEP, daalde het aantal placenta villi, de structuur was vervaagd en atrofieerd, sommige villi vertoonden fibrinoïde necrose, en het aantal syncytiotrofoblaast knopen in placenta villi nam toe, en de meeste villi waren onrijp. Het aantal trofocyten was verminderd, en de pathologische veranderingen werden verlicht in PE ratten behandeld met miR-18b-3p agomir en si-LEP (Fig. 3a).

Overgeëxprimeerde miR-18b-3p verbetert pathologische verandering en onderdrukt apoptotische cellen van placenta weefsels in PE ratten. a HE kleuring werd gebruikt om pathologische kenmerken van placenta weefsels te testen. b TUNEL kleuring werd geïmplementeerd om apoptotische cellen van placenta weefsels in PE ratten te bepalen. c Celdoodsratio werd gedetecteerd door TUNEL kleuring. n = 10, *p < 0,05 versus de normale groep. ^p < 0,05 versus de miR-NC groep. ^@p < 0,05 versus de miR-18b-3p antagomir groep. ^&p < 0,05 versus de si-NC groep. Meetdata werden afgebeeld als gemiddelde ± standaarddeviatie, en vergelijkingen onder meerdere groepen werden beoordeeld door eensijdige ANOVA gevolgd door Tukey's test

TUNEL kleuring suggereerde dat een klein aantal apoptotische cellen gezien kon worden. PE ratten hadden verhoogde apoptotische cellen, die verminderd werden door miR-18b-3p elevatie en LEP silencing, en verder versterkt door miR-18b-3p inhibitie; LEP silencing keerde ook het effect van miR-18b-3p inhibitie op het aantal apoptotische cellen in PE ratten om (Fig. 3b, c).

Samengevat, ratten met up-gereguleerde miR-18b-3p of geïnhibeerde LEP hadden een verminderde graad van PE progressie in histologie, en gesilenceerde LEP kon het therapeutische effect van geïnhibeerde miR-18b-3p ongedaan maken.

miR-18b-3p is Down-gereguleerd, Terwijl LEP Up-gereguleerd is in PE Ratten Placenta Weefsels en miR-18b-3p Target LEP

Gebaseerd op de bovenstaande resultaten, keerde LEP down-regulatie het therapeutische effect van down-regulatie van miR-18b-3p op PE ratten in pathologie en histologie om; dus stelden we de hypothese dat miR-18b-3p gerelateerd kan zijn aan LEP.

Western blot assay en RT-qPCR onthulden dat PE ratten verlaagde miR-18b-3p en verhoogde LEP expressieniveaus hadden; de behandeling van miR-18b-3p agomir up-reguleerde miR-18b-3p en down-reguleerde LEP in PE ratten, terwijl de behandeling van miR-18b-3p antagomir LEP expressie verhoogde; LEP silencing keerde het bevorderende effect van miR-18b-3p reductie op LEP expressie in PE ratten om (Fig. 4a–c).

miR-18b-3p is down-gereguleerd en LEP is up-gereguleerd in placenta weefsels van PE ratten. a Expressie van miR-18b-3p en LEP mRNA in placenta weefsels gedetecteerd met RT-qPCR. b Eiwitband van LEP in placenta weefsels. c Western blot assay uitgevoerd om LEP eiwitexpressie in placenta weefsels te detecteren. d Expressie van miR-18b-3p en LEP mRNA in placenta weefsels na exosoom behandeling gedetecteerd met RT-qPCR. e Eiwitband van LEP in placenta weefsels na exosoom behandeling. f Western blot assay uitgevoerd om LEP eiwitexpressie na exosoom behandeling te detecteren. g De bindingsplaatsen van miR-18b-3p en LEP voorspeld door een online software. h De doelrelatie tussen miR-18b-3p en LEP geverifieerd door dubbele-luciferase reporter gen assay. i doelrelatie tussen miR-18b-3p en LEP geverifieerd door RNA pull-down assay. n = 10, *p < 0,05 versus de normale groep. ^p < 0,05 versus de miR-NC groep. ^@p < 0,05 versus de miR-18b-3p antagomir groep. ^&p < 0,05 versus de si-NC groep. ^#p < 0,05 versus de PE groep. ^$p < 0,05 versus de PE + Exos-antagomir NC groep. Meetdata werden afgebeeld als gemiddelde ± standaarddeviatie, en vergelijkingen onder meerdere groepen werden beoordeeld door eensijdige ANOVA gevolgd door Tukey's test

Western blot assay en RT-qPCR werden gebruikt om de rol van exosomen in PE ratten te verkennen. De resultaten toonden aan dat exosomen miR-18b-3p up-reguleerden en LEP down-reguleerden in PE ratten, wat het onderdrukkende effect van exosomen op PE ontwikkeling aanduidt. Bovendien induceerden exosomen die miR-18b-3p antagomir droegen miR-18b-3p down-regulatie en LEP up-regulatie in PE ratten (Fig. 4d–f).

De doelrelatie tussen miR-18b-3p en LEP werd voorspeld door bioinformatica online voorspellende software https://cm.jefferson.edu/ (Fig. 4g). Dubbele-luciferase reporter gen assay suggereerde dat miR-18b-3p mimic de luciferase activiteit van LEP 3′UTR-WT verminderde, terwijl geen impact had op die van LEP 3′UTR-MUT (Fig. 4h). Verder onthulde de RNA pull-down assay dat LEP verrijking verhoogd was door WT-biotine-gelabelde miR-18b-3p (Fig. 4i). Deze bevindingen gaven aan dat LEP een doelgen is van miR-18b-3p.

HucMSC-Exos Verzwakken Pathologische Kenmerken van PE Ratten

De resultaten van SBP en 24-uurs proteinurie presenteerden dat er geen significant verschil was in SBP en 24-uurs proteinurie in 5 groepen vóór administrasie (dag 10 van zwangerschap). SBP en 24-uurs proteinurie in dag 19 van zwangerschap toonden geen duidelijk verschil in normale ratten. In PE ratten, begonnen SBP en 24-uurs proteinurie te stijgen op dag 13 van zwangerschap. Er was geen duidelijk verschil van SBP en 24-uurs proteinurie in dag 16 en dag 19 van zwangerschap in PE ratten behandeld met hucMSC-Exos en hucMSC-Exos die antagomir NC overdroegen. SBP en 24-uurs proteinurie steeg in dag 19 van zwangerschap in de PE ratten, terwijl de toename verminderd werd door injectie van hucMSC-Exos. Inhibitie van miR-18b-3p keerde het effect van hucMSC-Exos op SBP en 24-uurs proteinurie in dag 19 van zwangerschap in PE ratten om (Fig. 5a, b).

HucMSC-Exos verzwakken pathologische kenmerken van PE ratten. a Resultaten van SBP in ratten na exosoom behandeling. b Resultaten van 24-uurs proteinurie in ratten na exosoom behandeling. c Gewijzigingen van foetale ratten gewicht na exosoom behandeling. d Veranderingen van placenta gewicht in ratten na exosoom behandeling. e Veranderingen van inflammatie factoren na exosoom behandeling in serum bepaald met ELISA. n = 10, *p < 0,05 versus de normale groep. ^#p < 0,05 versus de PE groep. ^$p < 0,05 versus de PE + Exos-antagomir NC groep. Meetdata werden afgebeeld als gemiddelde ± standaarddeviatie, en vergelijkingen onder meerdere groepen werden beoordeeld door eensijdige ANOVA gevolgd door Tukey's test

Het gewicht van foetale rat en placenta werd gemeten, en we vonden dat de PE ratten verminderd gewicht van foetale rat en placenta hadden; miR-18b-3p down-regulatie onthield de rol van hucMSC-Exos in het gewicht van foetale rat en placenta in PE ratten (Fig. 5c, d).

Inflammatoire factoren in serum werden gedetecteerd met ELISA. TNF-α, IL-1β en IL-6 inhoud nam merkbaar toe in PE ratten. Exosomen behandeling verlaagde TNF-α, IL-1β en IL-6 inhoud in serum van PE ratten, die verhoogd werden door injectie van exosomen die miR-18b-3p inhibeerden (Fig. 5e).

Exosomen Verlichten Pathologische Verandering en Remmen Apoptose van Placenta Weefsels van PE Ratten

In normale ratten was de placenta villus rijk aan bloedvaten met een duidelijke structuur, syncytiotrofoblasten waren de hoofdtrofoblaast in placenta villi, en er waren minder cytotrofoblasten. In de PE ratten en PE ratten behandeld met hucMSC-Exos-miR-18b-3p-antagomir, daalde het aantal placenta villi, de structuur was vervaagd en atrofieerd, sommige villi presenteerden fibrinoïde necrose, en het aantal syncytiotrofoblaast knopen in placenta villi nam toe, en de meeste villi waren onrijp. De pathologische verandering was verbeterd in de PE ratten behandeld met hucMSC-Exos of hucMSC-Exos-antagomir NC versus de PE ratten en PE ratten behandeld met hucMSC-Exos-miR-18b-3p antagomir (Fig. 6a).

Exosomen verlichten pathologische verandering en verminderen apoptotische cellen van placenta weefsels in PE ratten. a HE kleuring werd gebruikt om pathologische kenmerken van placenta weefsels in PE ratten na exosoom behandeling te testen. b TUNEL kleuring werd geïmplementeerd om apoptotische cellen van placenta weefsels in PE ratten na exosoom behandeling te bepalen. c Celdoodsratio werd gedetecteerd door TUNEL kleuring. n = 10, *p < 0,05 versus de normale groep. ^#p < 0,05 versus de PE groep. ^$p < 0,05 versus de PE + Exos-antagomir NC groep. Meetdata werden afgebeeld als gemiddelde ± standaarddeviatie, en vergelijkingen onder meerdere groepen werden beoordeeld door eensijdige ANOVA gevolgd door Tukey's test

TUNEL kleuring gaf aan dat in normale ratten, een klein aantal apoptotische cellen gezien kon worden. PE ratten hadden verhoogde apoptotische cellen, en verminderde miR-18b-3p keerde de impact van hucMSC-Exos op het aantal apoptotische cellen in placenta weefsels van PE ratten om (Fig. 6b, c).

Discussie

PE is een multi-systeem zwangerschapsstoornis gekenmerkt door proteinurie en ofwel hoge bloeddruk of andere nadelige condities en gekoppeld aan een breed scala aan moederlijke endotheel dysfunctionele [20]. Het werd gerapporteerd dat hucMSC-Exo de morfologie van placenta weefsel in PE ratten verbeterde door celdood te onderdrukken en angiogenese in placenta weefsel te faciliteren op een dosis-afhankelijke manier [8]. Een studie heeft gerapporteerd dat miR-18b expressie celmigratie, vitaliteit en invasie in PE beïnvloedde [12]. Bovendien werd geverifieerd verhoogde moederlijke LEP concentratie en hypomethylatie van de LEP in placenta in vroege onset PE [21]. De huidige studie was ontworpen om het effect van exosomen en miR-18b-3p getarget LEP op het optreden van PE te verkennen. De bevindingen in deze studie onthulden dat hucMSC-afgeleide exosomale miR-18b-3p PE progressie remde door LEP te verlagen.

Gebaseerd op onze bevindingen, verlaagde miR-18b-3p en steeg LEP in placenta weefsels van PE ratten. Vergelijkbaar met onze studie, was de mRNA expressie van miR-18b merkbaar onderdrukt in PE placenta weefsels ten opzichte van die in normale placenta weefsels [12]. Daarnaast onthulde een studie dat miR-18b inhoud dramatisch verminderd was in maligne melanome weefsels in vergelijking met hun gematchte aangrenzende niet-tumor weefsels [22]. Een andere studie heeft geverifieerd dat placenta LEP expressie verhoogd was in vroege PE vergeleken met controles [23]. Bovendien toonde een studie aan dat LEP expressie duidelijk verhoogd was in pre-eclamptische placenta's [15]. Deze literatuur leverde een theoretische basis voor ons om de abnormale expressie van miR-18b-3p en LEP in PE te verkennen. Bovendien werd voorspeld met bio-informatica software dat LEP getarget werd door miR-18b-3p, en deze doelrelatie werd verder bevestigd met dubbele-luciferase reporter gen assay in ons onderzoek. Een studie rapporteerde dat LEP een doelwit is voor alle drie miRNA's (miR-1301, miR-223 en miR-224) in vroege onset PE [16]. Een andere studie toonde aan dat LEP miR-93 expressie verlaagde in osteoartritis en reumatoïde artritis [24]. Echter, de binding tussen miR-18b-3p en LEP in humane ziekten, met name in PE, blijft zelden bestudeerd, wat de nieuwheid van deze studie is. Verder rapporteerde een resultaat uit onze studie dat exosomen miR-18b-3p verhoogden en LEP verlaagden in placenta weefsels van PE. Het was vroeger gedocumenteerd dat de expressie van miR-18b-5p merkbaar verhoogd was in colorectale kanker plasma exosomen [25], terwijl de relatie tussen hucMSC-Exos en miR-18b-3p/LEP in PE verder studie nodig heeft.

Daarnaast toonde de bevinding uit ons onderzoek dat herstelde miR-18b-3p SBP en 24-uurs proteinurie van PE ratten verlaagde, het gewicht van placenta verhoogde, TNF-α, IL-1β en IL-6 inhoud in serum en placenta weefsels verlaagde alsook celdood onderdrukte. Deze data gaven aan dat miR-18b-3p elevatie bijdraagt aan het verlichten van symptomen en pathologische veranderingen in PE. Het werd gedemonstreerd dat stabiele up-regulatie van miR-18b effectieve tumor remmer activiteit produceerde, zoals het remmen van melanome cel vitaliteit, induceren van apoptose en verminderen van tumor groei in vivo [26]. Een ander resultaat in onze studie was dat hucMSC-Exos SBP en 24-uurs proteinurie van PE ratten verlaagden, het gewicht van placenta verhoogden, TNF-α, IL-1β en IL-6 inhoud in serum en placenta weefsels verlaagden alsook celdood onderdrukten. De bevindingen van de huidige studie onthulden dat exosomen behandelde PE rattenmodellen een toename presenteerden van het aantal en kwaliteit van foetussen, de kwaliteit van placenta, maar celdood was significant verminderd [8]. Interessant, een eerdere onderzoek heeft gedemonstreerd dat de toevoeging van foetale kalver exosomen de inhoud van macrofaag TNF-α en IL-6 verlaagde [27]. Een studie heeft onthuld dat gezuiverde exosomen productie van IL-1β in lipopolysacharide/nigericine-gestimuleerde macrofagen onderdrukte [28]. Verder hebben Nong et al. voorgesteld dat inflammatoire markers, zoals TNF-α en IL-6, dramatisch verminderd waren na administrasie van geproduceerde exosomen door humane geïnduceerde pluripotente stamcel-afgeleide MSC's [29]. Er is een artikel bevinding dat de SBP merkbaar verhoogd was in de groep vrouwen die later PE ontwikkelden [30, 31]. Het werd getoond dat PE patiënten positief geassocieerd waren met SBP en diastolische bloeddrukken en proteinurie [32]. Ook, een recente studie heeft een bewijs geleverd dat proteinurie toeneemt met vorderende zwangerschap in PE vrouwen [33]. Een belangrijke bevinding was dat ratten uit de PE groep verhoogde TNF-α hadden ten opzichte van de normale zwangere groep [34]. Een andere studie heeft geverifieerd dat serum IL-6 en IL-1β duidelijk verhoogd waren in vrouwen met PE in relatie tot controles [35]. De bovenstaande bevindingen suggereerden dat PE patiënten meestal hoge SBP, proteinurie en niveaus van inflammatoire factoren vertoonden. Dus kon afgeleid worden uit onze resultaten dat de hucMSC-afgeleide exosomale miR-18b-3p een therapeutisch effect had op PE.

Conclusie

Concluderend, onze studie levert bewijs dat hucMSC-afgeleide exosomen miR-18b-3p up-reguleren, wat LEP target om de inhoud van inflammatoire factoren te onderdrukken en de celdoodsratio in PE ratten placenta weefsels te verlagen, daarbij het optreden van PE remmend. Dus, exosomale miR-18b-3p kan een potentiële kandidaat zijn voor behandeling van PE via targeting LEP. Dit onderzoek identificeerde de rol van hucMSC-afgeleide exosomale miR-18b-3p targeting LEP tijdens PE ontwikkeling voor de eerste keer, wat een nieuw inzicht voor PE behandeling bood. Echter, vanwege de beperking van bekende onderzoeken, moet de studie in de toekomst rigoros gemonitord en gerapporteerd worden in klinische proeven.

Beschikbaarheid van data en materialen

Niet van toepassing.