Menselijke navelstreng mesenchymale stamcellen-afgeleide exosomale microRNA-18b-3p remt het optreden van pre-eclampsie door zich te richten op LEP

Materialen en methoden

Ethische goedkeuring

De studie werd goedgekeurd door de Institutional Review Board van het People's Hospital van de Wuhan University. Alle deelnemers ondertekenden een document van geïnformeerde toestemming. Alle dierproeven kwamen overeen met de Guide for the Care and Use of Laboratory Animal by International Committees of People's Hospital van Wuhan University.

Geïsoleerd, cultuur en identificatie van HucMSC's

De foetale navelstreng afgeleverd door gezonde kraamvrouw werd verzameld en in gehakt gesneden en gefiltreerd met zeef en vervolgens vermengd met fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS). De navelstrengweefsels werden gedurende 5 minuten bij 1500 tpm gecentrifugeerd met een centrifugale straal van 10 cm. De weefsels werden gesuspendeerd met Dulbecco's gemodificeerd Eagle-medium (DMEM) / F12 dat 10% foetaal runderserum (FBS) bevat en overgebracht naar een kweekkolf. De vloeistoffen werden na 4 dagen ververst en vervolgens eens per 3 dagen ververst. Cellen werden in subcultuur gebracht toen de samenvloeiing ongeveer 90% bereikte. De aanhangende groei en morfologie van hucMSC's werden waargenomen onder een lichtmicroscoop. De cellen werden gekleurd met olierode O-kleuroplossing (Beyotime Institute of Biotechnology, Shanghai, China) om osteogene differentiatie van hucMSC's te detecteren en geverfd met alkalische fosfatase (ALP) kleuroplossing (Beyotime) om adipogene differentiatie van hucMSC's te detecteren. Een flowcytometer (Beckman Coulter Life Sciences, Brea, CA, VS) werd gebruikt om CD73, CD166 (beide 1:10, BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, VS) en CD105 (1:20, AbD Serotec, Oxford, VK).

Extractie en identificatie van HucMSC-Exos

De goed groeiende hucMSC's werden gekweekt. Het supernatant werd verzameld en gedurende 1 uur bij 28.500 tpm gecentrifugeerd met een centrifugestraal van 10 cm. Het supernatant werd weggegooid en de cellen werden gefixeerd met 2% glutaaraldehyde en 1% osminezuur, gedehydrateerd met ethanol, ondergedompeld in propyleenoxide, 2 uur gedroogd, ingebed door Epon812 en in plakjes gesneden. De plakjes werden respectievelijk gekleurd met uranium en lood. Ten slotte werden de exosomen waargenomen onder de elektronenmicroscoop. Nanosight-detector (Malvern Instruments, Malvern, VK) werd gebruikt om Brownse bewegingsbeeldvorming van exosomen-nanodeeltjes en de grootte ervan te detecteren. De oppervlaktemarkers van hucMSC-Exos werden geïdentificeerd door middel van een western blot-assay en de resultaten toonden aan dat hucMSC-Exos CD9, CD81 en CD63 tot expressie bracht.

Lentivirus-infectiemethode

HucMSC was geïnfecteerd met lentivirus dat een lage expressie van miR-18b-3p-vector en lage expressie van miR-18b-3p vector-negatieve controle (NC) bevat (Shanghai GenePharma Co, Ltd, Shanghai, China). Ten slotte werden de stabiel tot expressie gebrachte hucMSC-antagomir NC en hucMSC-miR-18b-3p antagomir verkregen. Cellen werden 48 uur gekweekt en het supernatant werd verzameld en gecentrifugeerd met ultracentrifugatie om de overeenkomstige Exos-antagomir NC en Exos-miR-18b-3p antagomir te verkrijgen.

Experimentele dieren

Wistar-ratten (met een gewicht van 200-250 g, veroudering 8 w, ongeacht geslacht) op een gezond niveau en seksuele volwassenheid werden geselecteerd (het experimentele dierencentrum van de Wuhan University, Wuhan, China). De ratten werden gevoerd in een barrièresysteem met een temperatuur van 18-28 °C, een relatieve vochtigheid van 40-70% en voldoende voeding en water.

Opstelling van PE-modellen voor ratten

Het ratten-PE-model werd tot stand gebracht door intraperitoneale injectie van 50 mg/kg stikstofmonoxidesynthetaseremmer, N(G)-nitro-l-argininemethylester (L-NAME, Beyotime) met verwijzing naar een artikel [17]. De succesvolle oprichting van het PE-model was gebaseerd op verhoogde bloeddruk met 20 mmgHg en hoger dan 115 mmHg, evenals verhoogde proteïnurie.

Dierengroepering

De vrouwelijke rat en de mannelijke rat woonden willekeurig samen om 1:1 en de twee ratten werden om 17.00 uur tot 18.00 uur in een individuele speciale kooi gehouden. de vorige dag. Het sperma in de vaginale afscheidingen van de vrouwelijke ratten werd de volgende dag met een vaginale plug en een microscoop bekeken. Als het resultaat tegelijkertijd positief was, werd de dag geregistreerd als de 0e dag van de zwangerschap. Vanaf de 13 ^de dag van de dracht werden ratten verdeeld in 6 groepen (10 ratten in elke groep):normale groep (dezelfde hoeveelheid normale zoutoplossing werd intraperitoneaal geïnjecteerd van dag 13 tot dag 20 van de dracht), PE-groep (L-NAME [50 mg/ kg per dag] intraperitoneaal werd geïnjecteerd van dag 13 tot dag 20 van de dracht, en 20 L normale zoutoplossing werd op dag 16 tot dag 19 van de dracht in de placenta geïnjecteerd), PE + miR-NC-groep (L-NAME [50 mg /kg per dag] werd intraperitoneaal geïnjecteerd van dag 13 tot dag 20 van de dracht, en 20 L 4 nmol miR-NC werd op dag 16 tot dag 19 van de dracht in de placenta geïnjecteerd), PE + miR-18b-3p agomir-groep (L-NAME [50 mg/kg per dag] werd intraperitoneaal geïnjecteerd van dag 13 tot dag 20 van de dracht en 20 μL 4 nmol miR-18b-3p agomir werd op dag 16 tot dag 19 van de dracht in de placenta geïnjecteerd) , PE + miR-18b-3p antagomir-groep (L-NAME [50 mg/kg per dag] werd intraperitoneaal geïnjecteerd van dag 13 tot dag 20 van de zwangerschap en 20 μL van 4 nmol miR-18b-3p antagomir werd geïnjecteerd in de P lactenta op dag 16 tot dag 19 van de dracht), PE + miR-18b-3p antagomir + small interfererende RNA (si)-LEP-groep (L-NAME [50 mg/kg per dag] werd intraperitoneaal geïnjecteerd van dag 13 tot dag 20 van de dracht en 20 μL 4 nmol miR-18b-3p antagomir en si-LEP werd geïnjecteerd in de placenta op dag 16 tot dag 19 van de dracht) en PE + si-LEP-groep (L-NAME [50 mg/kg per dag] intraperitoneaal geïnjecteerd van dag 13 tot dag 20 van de dracht, en 20 l 4 nmol si-LEP werd op dag 16 tot dag 19 van de dracht in de placenta geïnjecteerd). Ratten werden behandeld met exosomen en exosomen die lentivirussen droegen. De ratten werden ingedeeld in 5 groepen (10 ratten in elke groep):normale groep (dezelfde hoeveelheid normale zoutoplossing werd intraperitoneaal geïnjecteerd van dag 13 tot dag 20 van de dracht), PE-groep (L-NAME (50 mg/kg per dag) ) werd intraperitoneaal geïnjecteerd van dag 13 tot dag 20 van de dracht en 20 L normale zoutoplossing werd op dag 16 tot dag 19 van de dracht in de placenta geïnjecteerd), PE + Exos-groep (L-NAME (50 mg/kg per dag) werd intraperitoneaal geïnjecteerd van dag 13 tot dag 20 van de dracht en 20 l Exos (80 g exosomen werden gesuspendeerd in 20 μL normale zoutoplossing) werd op dag 16 tot dag 19 van de dracht in de placenta geïnjecteerd), PE + Exos-antagomir NC groep (L-NAME (50 mg/kg per dag) werd intraperitoneaal geïnjecteerd van dag 13 tot dag 20 van de zwangerschap, en 20 l Exos-antagomir NC (80 g exosomen werden gesuspendeerd in 20 μL normale zoutoplossing) werd in de placenta geïnjecteerd op dag 16 tot dag 19 van de dracht) en PE + Exos-miR-18b-3p antagomir-groep (L-NAME (50 mg/kg per dag) werd vanaf dag 13 intraperitoneaal geïnjecteerd tot dag 20 van de dracht en 20 l Exos-miR-18b-3p antagomir (80 g exosomen werden gesuspendeerd in 20 μL normale zoutoplossing) werd op dag 16 tot dag 19 van de dracht in de placenta geïnjecteerd).

Detectie van systolische bloeddruk (SBP) en bepaling van 24-uurs proteïnurie

De druk van ratten werd gemeten door meting van de bloeddruk van de staartslagader van ratten. De staartmanchet-SBP van alle zwangere ratten werd gemeten op de 10e, 13e, 16e en 19e dag van de dracht met behulp van de rattenstaartslagaderdrukdetector (Tensys (R) Medical Inc., San Diego, CA, VS). De druk werd in korte tijd 3 keer gemeten; vervolgens werd de gemiddelde waarde als bloeddruk genomen.

In het geval van gratis dieet en water werd de 24-uurs urine van drachtige ratten verzameld op de 10e, 13e, 16e en 19e dag van de dracht, en het eiwitgehalte werd gedetecteerd in de afdeling nefrologie van het People's Hospital van de Wuhan University.

Voorbeeldverzameling

De drachtige ratten werden op de 21e dag van de dracht verdoofd met 3% pentobarbital-natrium. Het perifere bloed van de ratten werd bewaard, gecentrifugeerd om het serum te nemen en in de koelkast bewaard bij - 20 ° C voor stand-by. Vervolgens werden de foetale rat en placenta verwijderd door middel van een keizersnede, het foetale membraan en de aangesloten navelstreng werden verwijderd en de navelstreng die was verbonden met de foetale rat werd afgesneden. De placenta en de foetale rat werden op een aseptisch gaasje geplaatst om respectievelijk bloed en vruchtwater te drogen, en vervolgens op de analytische weegschaal gelegd om het gewicht te wegen. Een deel van de placentaweefsels werd gefixeerd met 4% paraformaldehyde, gedehydrateerd met ethanol, geklaard met xyleen, ingebed in paraffine en continu kruislings gesneden (5 m) voor hematoxyline-eosine (HE) kleuring en terminale deoxynucleotidyltransferase-gemedieerde deoxyuridinetrifosfaat-biotine nick end-labeling (TUNEL) kleuring. De rest werd bewaard bij -80 °C voor detectie van kwantitatieve polymerasekettingreactie (RT-qPCR) met omgekeerde transcriptie, Western-blot-analyse en enzymgekoppelde immunosorbentassay (ELISA).

ELISA

Tumornecrosefactor-α (TNF-α), interleukine (IL)-1β en IL-6-gehaltes in serum werden getest met ELISA. De concentraties van TNF-α, IL-1β en IL-6 werden bepaald volgens de instructies van de kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, VS). Optische dichtheidswaarden (OD) (490 nm) werden getest door een microplaatlezer (Thermo Fisher Scientific, MA, VS). De overeenkomstige standaardkromme werd verkregen met gebruikmaking van de OD-waarde als de abscis en de concentratie van het overeenkomstige standaardmonster als de ordinaat. TNF-α-, IL-1β- en IL-6-concentraties werden berekend uit de standaardcurve.

HE-kleuring

De paraffinemonsters van placentaweefsels werden geklaard in xyleen, gedehydrateerd met conventionele gradiëntalcohol, gekleurd met hematoxyline, gedifferentieerd met 1% zoutzuuralcohol en teruggebracht naar blauw door 1% ammoniakwater. Vervolgens werden de weefsels tegengekleurd met 1% eosine-oplossing, gedehydrateerd (respectievelijk 75%, 90%, 95% ethanol, absolute ethylalcohol) en geklaard met xyleen, gedroogd, geblokkeerd en bekeken onder de elektronenmicroscoop.

TUNEL-kleuring

In paraffine ingebedde secties werden routinematig van was ontdaan en gedehydrateerd volgens de instructies, en vervolgens werd apoptose gedetecteerd door TUNEL Kit (Nanjing Kejin Biotechnology Co., Ltd., Jiangsu, China). 4,6-Diamino-2-fenylindol (Shanghai Baitai Biotechnology Co., Ltd., Shanghai, China) werd gebruikt om TUNEL-positieve cellen te observeren met behulp van een fluorescentiemicroscoop (Nikon, Tokyo, Japan) [18].

RT-qPCR

De placentaweefsels werden gewogen. Per 50-100 mg placenta werden weefsels toegevoegd met 1 ml TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, Californië, VS) en volledig opgelost. De weefsels werden toegevoegd aan 200 L chloroform en gecentrifugeerd bij 4 ° C, 12.000 rpm om het totale RNA te extraheren. De concentratie en zuiverheid van RNA werden bepaald met een DU-800-eiwitnucleïnezuurspectrofotometer (Beckman). U6 en β-actine werden gebruikt als de laadcontroles. PCR-primers zijn ontworpen en samengesteld door Shanghai Sangon Biotechnology Co. Ltd. (Shanghai, China). De primersequenties zijn weergegeven in Tabel 1. RNA werd omgekeerd naar cDNA op basis van instructies van de RNA reverse transcription kit (Sangon). PCR werd geamplificeerd en producten werden geverifieerd door agarosegelelektroforese. De gegevens zijn berekend door 2 ^−ΔΔCt methode.

Western Blot-assay

Het totale eiwit van placentaweefsels werd geëxtraheerd door middel van cellysisbuffer met radio-immunoprecipitatietest (Beyotime). HucMSC-Exo werd gebruikt om buffer te abstraheren, die werd gecentrifugeerd bij 14.000 tpm. Het supernatant werd bewaard voor het testen van de eiwitexpressie van exosomaal markereiwit (CD81, CD63 en CD9) in serum. De eiwitconcentratie werd bepaald met een bicinchoninezuurkit (Beyotime, P0010). Het monster werd geladen volgens de kwantitatieve resultaten van eiwit, behandeld met 10% natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese en overgebracht naar membraan. Het membraan werd geblokkeerd met 5% magere melk, onderzocht met primaire antilichamen LEP, CD63, CD81, CD9 en β-actine (4 ml, 1:1000, Santa Cruz Biotechnology, Inc, Santa Cruz, CA, VS), opnieuw onderzocht met 4 ml secundair antilichaam geit anti-konijn IgG/mierikswortelperoxidase, blootgesteld en ontwikkeld. β-actine werd gebruikt als interne referentie. De grijswaarde werd geanalyseerd door gel grafische analysesoftware Image Lab.

Dual-Luciferase Reporter-gentest

On-line voorspellingssoftware https://cm.jefferson.edu/ werd gebruikt om de doelrelatie tussen miR-18b-3p en LEP te voorspellen, evenals de bindingsplaats van miR-18b-3p en LEP-3-onvertaalde regio (UTR ). De sequentie van het LEP 3'UTR-promotergebied die de miR-18b-3p-bindingsplaats bevatte, werd samengesteld. Het LEP 3'UTR wildtype (WT) plasmide en LEP 3'UTR mutant type (MUT) werden geconstrueerd. De recombinante plasmiden werden respectievelijk LEP 3'UTR-WT en LEP 3'UTR-MUT genoemd. De gekweekte 293T-cellen werden gecotransfecteerd met miR-18b-3p mimic en LEP 3′UTR-WT, miR-18b-3p mimic en LEP 3′UTR-MUT, mimic NC en LEP 3′UTR-WT, mimic NC en LEP 3′UTR-MUT gedurende 30 uur. Vervolgens werden 293T-cellen verzameld. Firefly- en renilla-luciferase-activiteit in cellen werden gemeten door luminescentiemetingen in overeenstemming met dual-luciferase reporter-gendetectiekit (Promega, Madison, WI, VS).

RNA pull-down-assay

Gebiotinyleerde RNA-probes (Bio-miR-NC, Bio-miR-18b-3p en Bio-miR-18b-3p-Mut) werden geïncubeerd met het lysaat van 293T-cellen en geëxtraheerd met behulp van magnetische korrels geconjugeerd met antibiotische streptomycine. Het experiment werd uitgevoerd op basis van instructies van Pierce magnetische RNA pull-down kits (Pierce, IL, VS). Het RNA werd geëlueerd en gezuiverd met TRIzol (Pierce). De verrijking van LEP in RNA-complex werd gekwantificeerd met behulp van RT-qPCR zoals eerder beschreven [19].

Statistische analyse

Alle gegevens werden verklaard door SPSS 21.0-software (IBM Corp. Armonk, NY, VS). De meetgegevens werden aangegeven als gemiddelde   ± standaarddeviatie. De gegevens zijn uitgevoerd door een onafhankelijke steekproef t test voor vergelijkingen van twee groepen, terwijl vergelijkingen tussen meerdere groepen werden beoordeeld door eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) gevolgd door Tukey's post hoc-test. Het criterium voor statistische significantie werd ingesteld op p < 0.05.

Resultaten

Morfologie en identificatie van de HucMSC en HucMSC-Exos

De weefselmassa's van de navelstreng werden waargenomen onder een omgekeerde microscoop. Het was te zien dat de cellen op dag 3 uit de weefselmassa kropen; cellen vertoonden spoelvorm en draadachtigheid en groeiden na ongeveer 5 dagen als een kolonie. Wanneer gekweekt tot passage 3, was de morfologie van cellen uniform lang spoelvormig en vergelijkbaar met fibroblastmorfologie, en de opstelling was regelmatig (figuur 1a). Na 2 w adipogene differentiatie van hucMSC werden lipidedruppeltjes gevormd in het cytoplasma en de lipidedruppeltjes vertoonden Kranz-structuur onder de omgekeerde microscoop (figuur 1b), wat suggereert dat het geïsoleerde gekweekte hucMSC het vermogen had tot adipogene differentiatie. Na 2 w osteogene differentiatie kon een groot aantal bruine calciumknobbeltjes worden gezien onder een omgekeerde microscoop (figuur 1c), wat aangeeft dat geïsoleerd gekweekt hucMSC het vermogen tot osteogene differentiatie had. Er werd een flowcytometer gebruikt om het immunofenotype van cellen te testen, en de resultaten omvatten dat cellen oppervlaktemarker CD73, CD105 en CD166 van MSC's tot overexpressie brachten (Fig. 1d).

Morfologie en identificatie van de hucMSC en hucMSC-Exos. een De morfologie van de hucMSC onder de omgekeerde microscoop, b hucMSC werd getest door olierood O-kleuring. c hucMSC werd getest door ALP-kleuring. d Flowcytometrie werd gebruikt om het immunofenotype te detecteren. e De vorm en grootte van hucMSC-Exos waargenomen via een TEM. v Detectie van deeltjesgrootteverdeling van exosomen met behulp van Nanosight-analyse. g Eiwitexpressie van CD9, CD81 en CD63 in hucMSC-Exos werd gedetecteerd door western blot-assay

De morfologie van hucMSC-Exos werd waargenomen door de TEM en de resultaten gaven aan dat de exosomen rond of ovaal waren met een lage centrale dichtheid en dikke kleuring aan beide zijden (figuur 1e). Nanosight-analyse werd gebruikt om de deeltjesgrootte van exosomen te analyseren, en de resultaten toonden aan dat de deeltjesgrootte voornamelijk verdeeld was tussen 40 en 100 nm, meer geconcentreerd rond 80 nm (figuur 1f). Western-blot-assay onthulde dat alle oppervlaktemarkers CD81, CD63 en CD9 tot expressie werden gebracht in hucMSC-Exos (Fig. 1g).

Het herstellen van miR-18b-3p verlicht pathologische kenmerken van PE-ratten

De resultaten van SBP en 24-uurs proteïnurie gaven het volgende weer:er was geen significant verschil in SBP en 24-uurs proteïnurie in 6 groepen vóór toediening (dag 10 van de zwangerschap). SBP en 24-uurs proteïnurie op dag 19 van de dracht vertoonden geen duidelijk verschil bij normale ratten. Bij PE-ratten of PE-ratten die zijn behandeld met miR-NC, miR-18b-3p agomir, miR-18b-3p antagomir, miR-18b-3p antagomir + si-LEP, si-NC of si-LEP, SBP en 24-h proteïnurie begon toe te nemen op dag 13 van de zwangerschap. Er was geen duidelijk verschil tussen SBP en 24-uurs proteïnurie op dag 16 en dag 19 van de dracht bij PE-ratten die werden behandeld met miR-18b-3p agomir en si-LEP. PE-ratten hadden verhoogde SBP en 24-uurs proteïnurie op dag 19 van de dracht; deze toename werd verminderd door miR-18b-3p-verhoging maar verder versterkt door miR-18b-3p-remming; LEP-reductie deed de rol van miR-18b-3p-downregulatie in de SBP en 24-uurs proteïnurie op dag 19 van de zwangerschap bij PE-ratten teniet (Fig. 2a, b).

Het herstellen van miR-18b-3p verlicht pathologische kenmerken van PE-ratten. een Resultaten van SBP bij ratten. b Resultaten van 24-uurs proteïnurie bij ratten. c Gewichtsveranderingen van foetale ratten. d Veranderingen van placentagewicht bij ratten. e Veranderingen van ontstekingsfactoren in serum werden gedetecteerd met behulp van ELISA. n = 10, *p < 0,05 versus de normale groep. ^p <-0,05 versus de PE + miR-NC-groep. ^@ p < 0,05 versus de PE + miR-18b-3p antagomir-groep. ^& p <-0,05 versus de PE + si-NC-groep. Meetgegevens werden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie en vergelijkingen tussen meerdere groepen werden beoordeeld door eenrichtings-ANOVA gevolgd door Tukey's test

Het gewicht van de foetale rat en placenta nam af bij de PE-ratten; opgereguleerde miR-18b-3p of neerwaarts gereguleerde LEP verhoogden, terwijl neerwaarts gereguleerde miR-18b-3p het gewicht van foetale rat en placenta bij PE-ratten verminderde; LEP-silencing keerde het effect van miR-18b-3p-remming op het gewicht van foetale rat en placenta bij PE-ratten om (Fig. 2c, d).

Ontstekingsfactoren in serum van PE-ratten werden gedetecteerd. Er werd gevonden dat de TNF-a-, IL-1β- en IL-6-gehalten verhoogden in de PE-ratten; miR-18b-3p-verhoging of LEP-remming onderdrukte, terwijl miR-18b-3p-reductie de inhoud van TNF-α, IL-1β en IL-6 bevorderde; het effect van geremd miR-18b-3p op de TNF-α-, IL-1β- en IL-6-inhoud werd teniet gedaan door LEP-depletie (Fig. 2e).

Overexpressie van miR-18b-3p verbetert histopathologische verandering van placentaweefsels van PE-ratten

Bij normale ratten was de placentavillus rijk aan bloedvaten en had een duidelijke structuur, syncytiotrofoblasten waren de belangrijkste trofoblasten in placentavilli en er waren minder cytotrofoblasten. Bij PE-ratten of PE-ratten die werden behandeld met miR-NC, miR-18b-3p antagomir, si-NC of miR-18b-3p antagomir + si-LEP, nam het aantal placentavlokken af, de structuur was wazig en geatrofieerd, sommige villi werden uitgevoerd fibrinoïde necrose, en het aantal syncytiotrofoblast knobbeltjes in placenta villi nam toe, en de meeste villi waren onvolgroeid. Het aantal trofocyten was verminderd en de pathologische veranderingen werden verlicht bij PE-ratten die werden behandeld met miR-18b-3p agomir en si-LEP (Fig. 3a).

Overexpressie van miR-18b-3p verbetert pathologische verandering en onderdrukt apoptotische cellen van placentaweefsels bij PE-ratten. een HE-kleuring werd gebruikt om pathologische kenmerken van placentaweefsels te testen. b TUNEL-kleuring werd geïmplementeerd om apoptotische cellen van placentaweefsels in PE-ratten te bepalen. c De snelheid van celapoptose werd gedetecteerd door TUNEL-kleuring. n = 10, *p < 0,05 versus de normale groep. ^p < 0,05 versus de miR-NC-groep. ^@ p < 0,05 versus de miR-18b-3p antagomir-groep. ^& p < 0,05 versus de si-NC-groep. Meetgegevens werden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie en vergelijkingen tussen meerdere groepen werden beoordeeld door eenrichtings-ANOVA gevolgd door Tukey's test

TUNEL-kleuring suggereerde dat een klein aantal apoptotische cellen kon worden gezien. PE-ratten hadden verhoogde apoptotische cellen, die werden verminderd door miR-18b-3p-verhoging en LEP-uitschakeling, en werden verder versterkt door miR-18b-3p-remming; LEP-silencing keerde ook het effect van miR-18b-3p-remming op het aantal apoptotische cellen in PE-ratten om (Fig. 3b, c).

Alles bij elkaar genomen hadden ratten met opgereguleerde miR-18b-3p of geremde LEP een verminderde mate van PE-progressie in histologie, en tot zwijgen gebrachte LEP kon het therapeutische effect van geremde miR-18b-3p tenietdoen.

miR-18b-3p wordt gedownreguleerd, terwijl LEP wordt opgereguleerd in placentaweefsels van PE Rat en miR-18b-3p richt zich op LEP

Op basis van de bovenstaande resultaten keerde LEP-downregulatie het therapeutische effect van downregulatie van miR-18b-3p op PE-ratten in pathologie en histologie om; daarom veronderstelden we dat miR-18b-3p mogelijk verband houdt met LEP.

Western-blot-assay en RT-qPCR onthulden dat PE-ratten miR-18b-3p en verhoogde LEP-expressieniveaus hadden; de behandeling van miR-18b-3p agomir verhoogde miR-18b-3p en verlaagde LEP bij PE-ratten, terwijl de behandeling van miR-18b-3p antagomir de LEP-expressie verhoogde; LEP-uitschakeling keerde het bevorderende effect van miR-18b-3p-reductie op LEP-expressie in PE-ratten om (Fig. 4a-c).

miR-18b-3p wordt gedownreguleerd en LEP wordt opgereguleerd in placentaweefsels van PE-ratten. een Expressie van miR-18b-3p en LEP-mRNA in placentaweefsels werd gedetecteerd met behulp van RT-qPCR. b Eiwitband van LEP in placentaweefsels. c Western-blot-assay werd uitgevoerd om LEP-eiwitexpressie in placentaweefsels te detecteren. d Expressie van miR-18b-3p en LEP-mRNA in placentaweefsels na exosoombehandeling werd gedetecteerd met behulp van RT-qPCR. e Eiwitband van LEP in placentaweefsels na exosoombehandeling. v Western-blot-assay werd uitgevoerd om LEP-eiwitexpressie te detecteren na exosoombehandeling. g De bindingsplaatsen van miR-18b-3p en LEP voorspeld door online software. u De doelrelatie tussen miR-18b-3p en LEP geverifieerd door dual-luciferase reportergenassay. ik targeting relatie tussen miR-18b-3p en LEP geverifieerd door RNA pull-down assay. n = 10, *p < 0,05 versus de normale groep. ^p < 0,05 versus de miR-NC-groep. ^@ p < 0,05 versus de miR-18b-3p antagomir-groep. ^& p < 0,05 versus de si-NC-groep. ^# p < 0,05 versus de PE-groep. ^$ p < 0,05 versus de PE + Exos-antagomir NC-groep. Meetgegevens werden weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie en vergelijkingen tussen meerdere groepen werden beoordeeld door eenrichtings-ANOVA gevolgd door Tukey's test

Western blot-assay en RT-qPCR werden gebruikt om de rol van exosomen in PE-ratten te onderzoeken. De resultaten toonden aan dat exosomen miR-18b-3p opreguleerden en LEP in PE-ratten neerwaarts reguleerden, wat wijst op het onderdrukkende effect van exosomen op de ontwikkeling van PE. Bovendien induceerden exosomen die miR-18b-3p antagomir transporteerden miR-18b-3p-downregulatie en LEP-upregulatie bij PE-ratten (Fig. 4d-f).

De doelrelatie tussen miR-18b-3p en LEP werd voorspeld door bio-informatica online voorspellingssoftware https://cm.jefferson.edu/ (Fig. 4g). Dual-luciferase-reportergentest suggereerde dat miR-18b-3p-nabootsing de luciferase-activiteit van LEP 3'UTR-WT verminderde, terwijl het geen invloed had op die van LEP 3'UTR-MUT (figuur 4h). Verder onthulde de RNA-pull-down-assay dat LEP-verrijking werd verhoogd door WT-gebiotinyleerd miR-18b-3p (Fig. 4i). Deze bevindingen gaven aan dat LEP een doelwitgen is van miR-18b-3p.

hucMSC-Exos verzwakken pathologische kenmerken van PE-ratten

De resultaten van SBP en 24 uur toonden aan dat er geen significant verschil was in SBP en 24-uurs proteïnurie in 5 groepen vóór toediening (dag 10 van de zwangerschap). SBP en 24-uurs proteïnurie op dag 19 van de dracht vertoonden geen duidelijk verschil bij normale ratten. Bij PE-ratten begonnen SBP en 24-uurs proteïnurie te stijgen op dag 13 van de dracht. There was no distinct difference of SBP and 24-h proteinuria in day 16 and day 19 of gestation in PE rats treated with hucMSC-Exos and hucMSC-Exos transmitting antagomir NC. SBP and 24-h proteinuria heightened in day 19 of gestation in the PE rats, while the increase was reduced by injection of hucMSC-Exos. Inhibiting miR-18b-3p reversed the effect of hucMSC-Exos on SBP and 24-h proteinuria in day 19 of gestation in PE rats (Fig. 5a, b).

hucMSC-Exos attenuate pathological characteristics of PE rats. een Results of SBP in rats after exosome treatment. b Results of 24-h proteinuria in rats after exosome treatment. c Weight changes of fetal rats after exosome treatment. d Changes of placental weight in rats after exosome treatment. e Changes of inflammation factors after exosome treatment in serum were determined using ELISA. n  = 10, *p < 0.05 versus the normal group. ^# p  < 0.05 versus the PE group. ^$ p  < 0.05 versus the PE + Exos-antagomir NC group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation, and comparisons among multiple groups were assessed by one-way ANOVA followed by Tukey’s test

The weight of fetal rat and placenta was measured, and we found that the PE rats had decreased weight of fetal rat and placenta; miR-18b-3p downregulation abolished the role of hucMSC-Exos in the weight of fetal rat and placenta in PE rats (Fig. 5c, d).

Inflammatory factors in serum were detected using ELISA. TNF-α, IL-1β and IL-6 contents remarkably increased in PE rats. Exosomes treatment decreased TNF-α, IL-1β and IL-6 contents in serum of PE rats, which were enhanced by injection of exosomes inhibiting miR-18b-3p (Fig. 5e).

Exosomes Alleviates Pathological Change and Inhibit Apoptosis of Placenta Tissues of PE Rats

In normal rats, the placental villus was abundant in blood vessels with a clear structure, syncytiotrophoblasts were the main trophoblast in placental villi, and there were fewer cytotrophoblasts. In the PE rats and PE rats treated with hucMSC-Exos-miR-18b-3p-antagomir, the number of placental villi reduced, the structure was blurred and atrophied, some villi were presented fibrinoid necrosis, and the number of syncytiotrophoblast nodules in placental villi enhanced, and most of the villi were immature. The pathological change was improved in the PE rats treated with hucMSC-Exos or hucMSC-Exos-antagomir NC versus the PE rats and PE rats treated with hucMSC-Exos-miR-18b-3p antagomir (Fig. 6a).

Exosomes alleviate pathological change and decrease apoptotic cells of placenta tissues in PE rats. een HE staining was utilized to test pathological features of placenta tissues in PE rats after exosome treatment. b TUNEL staining was implemented to determine apoptotic cells of placenta tissues in PE rats after exosome treatment. c Cell apoptosis rate was detected by TUNEL staining. n  = 10, *p < 0.05 versus the normal group. ^# p  < 0.05 versus the PE group. ^$ p  < 0.05 versus the PE + Exos-antagomir NC group. Measurement data were depicted as mean ± standard deviation, and comparisons among multiple groups were assessed by one-way ANOVA followed by Tukey’s test

TUNEL staining indicated that in normal rats, a small number of apoptotic cells could be seen. PE rats had enhanced apoptotic cells, and reduced miR-18b-3p reversed the impacts of hucMSC-Exos on the number of apoptotic cells in placenta tissues from PE rats (Fig. 6b, c).

Discussion

PE is a multisystem pregnancy disorder characterized by proteinuria and either high blood pressure or other adverse conditions and is linked to a wide range of maternal endothelial dysfunction [20]. It was reported that hucMSC-Exo improved the morphology of placental tissue in PE rats through suppressing cell apoptosis and facilitating angiogenesis in placental tissue in a dose-dependent manner [8]. A study has reported that miR-18b expression affected cell migration, viability and invasion in PE [12]. Moreover, it was verified increased maternal LEP concentration and hypomethylation of the LEP in placenta in early onset PE [21]. The current study was designed to explore the effect of exosomes and miR-18b-3p targeted LEP on the occurrence of PE. The findings in this study revealed that hucMSC-derived exosomal miR-18b-3p inhibited PE progression by reducing LEP.

Based on our findings, miR-18b-3p reduced and LEP elevated in placenta tissues of PE rats. Similar to our study, the mRNA expression of miR-18b was markedly suppressed in PE placental tissues relative to that in normal placental tissues [12]. In addition, a study revealed that miR-18b content was dramatically reduced in malignant melanoma tissues in comparison with their matched adjacent non-tumor tissues [22]. Another study has verified that placental LEP expression was raised in preterm PE compared with controls [23]. Moreover, a study showed that LEP expression was obviously heightened in preeclamptic placentas [15]. This literature provided a theoretical basis for us to explore the abnormal expression of miR-18b-3p and LEP in PE. Moreover, it was predicted using a bioinformatic software that LEP was targeted by miR-18b-3p, and this targeting relationship was further confirmed with dual-luciferase reporter gene assay in our research. A study reported that LEP is a target for all three miRNAs (miR-1301, miR-223 and miR-224) in early-onset PE [16]. Another study has displayed that LEP decreased miR-93 expression in osteoarthritis and rheumatoid arthritis [24]. However, the binding between miR-18b-3p and LEP in human diseases, especially in PE, remains scarcely studied, which is the novelty of this study. Furthermore, a result emerging from our study reported that exosomes increased miR-18b-3p and decreased LEP in placenta tissues of PE. It was formerly documented that the expression of miR-18b-5p was notably raised in colorectal cancer plasma exosomes [25], while the relationship between hucMSC-Exos and miR-18b-3p/LEP in PE needs further study.

Additionally, the finding from our investigation showed that restored miR-18b-3p reduced SBP and 24-h proteinuria of PE rats, increased the weight of placenta, declined TNF-α, IL-1β and IL-6 contents in serum and placenta tissues as well as suppressed cell apoptosis. These data indicated that miR-18b-3p elevation contributes to alleviating the symptoms and pathological changes in PE. It was demonstrated that stable upregulation of miR-18b produced effective tumor inhibitor activity, such as inhibiting melanoma cell viability, inducing apoptosis and reducing tumor growth in vivo [26]. Another result in our study was that hucMSC-Exos reduced SBP and 24-h proteinuria of PE rats, increased the weight of placenta, declined TNF-α, IL-1β and IL-6 contents in serum and placenta tissues as well as suppressed cell apoptosis. The findings of the current study revealed that exosomes treated PE rat models presented an increase of the number and quality of fetuses, the quality of placenta, but cell apoptosis was significantly reduced [8]. Interestingly, a previous research has demonstrated that the addition of fetal bovine exosomes declined contents of macrophage TNF-α and IL-6 [27]. A study has revealed that purified exosomes suppressed production of IL-1β in lipopolysaccharide/nigericin-stimulated macrophages [28]. Furthermore, Nong et al. have suggested that inflammatory markers, such as TNF-α and IL-6, were dramatically decreased after administration of exosomes produced through human-induced pluripotent stem cell-derived MSCs [29]. There is a article finding that the SBP was markedly elevated in the group of women who later developed PE [30, 31]. It was displayed that PE patients were positively associated with SBP and diastolic blood pressures and proteinuria [32]. Also, a recent study has provided a proof that proteinuria heightened with advancing gestation in PE women [33]. A important finding was that rats from the PE group had increased TNF-α relative to the normal pregnant group [34]. Another study has verified that serum IL-6 and IL-1β were obviously elevated in women with PE in relation to controls [35]. The above findings suggested that PE patients usually showed high SBP, proteinuria and levels of inflammatory factors. Thus, it could be inferred from our results that the hucMSC-derived exosomal miR-18b-3p had a therapeutic effect on PE.

Conclusion

In conclusion, our study provides evidence that hucMSCs-derived exosomes upregulate miR-18b-3p, which targets LEP to suppress the contents of inflammatory factors and reduce cell apoptosis rate in PE rat placenta tissues, thereby inhibiting the occurrence of PE. Thus, exosomal miR-18b-3p may be a potential candidate for treatment of PE via targeting LEP. This research identified the role of hucMSC-derived exosomal miR-18b-3p targeting LEP during PE development for the first time, which provided a novel insight for PE treatment. However, due to the limitation of known researches, the study needs to be monitored rigorously and reported appropriately in the future clinical trials.

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

Niet van toepassing.