Geavanceerde PAMAM-Quantum Dot Complexen voor Snelle Klinische Immunoassays

Samenvatting

We rapporteren een groep complexen gebruikt in klinische immunoassays. De complexen omvatten een PAMAM-geconjugeerde geit anti-konijn IgG en een QDs-geconjugeerde geit anti-muis IgG. Wanneer konijn anti-antigen en muis anti-antigen worden toegevoegd, zal het corresponderende antigen gedetecteerd worden. Het experiment, met behulp van de complexen, is eenvoudig, gemakkelijk, kort in tijd en kort in stappen. Het is ook toepasbaar op verschillende experimentmethoden, zoals te gebruiken met FCM (stroomcytometrie), ICC (immunocytochemie) en IHC (immunohistochemie) om veel soorten antigenen te detecteren.

Inleiding

Quantum dots (QDs) worden breed gebruikt als luminoforen vanwege hun hoge fluorescente quantum yields, hoge fotostabiliteit en lage fotobleaching eigenschappen. Ze worden ook breed gebruikt als organische fluoroforen in cellulaire beeldvorming en biotechnologische toepassingen. In het bijzonder hebben cadmium-bevattende QDs (namelijk CdSe en CdTe) significante voordelen omdat onder bestraling van dezelfde golflengte binnen het bereik van 430–660 nm, ze een grootte-afhankelijke emissie elektromagnetisch spectrum hebben. Daarom zijn antistof-geconjugeerde QDs de meest veelbelovende sondes voor moleculaire beeldvorming.

Het polyamidoamine dendrimer (PAMAM), als een van de meest uitgebreid en diepgaand bestudeerde dendritische macromoleculen, heeft de volgende kenmerken: een groot aantal oppervlaktefunctionele groepen, een groot aantal kaviteiten binnen de moleculen, een nanoschaal grootte, en hoge biocompatibiliteit. Wanneer geconjugeerd met medicijnen en antilichamen, kunnen deze dendrimers de oplosbaarheid en systemische circulatie van een medicijn verbeteren maar niet de biologische activiteit van het medicijn belemmeren. Daarom worden antilichamen gemodificeerd met PAMAM vaak gebruikt in klinische immunisatie.

Klinische immunoassays omvatten veel methoden, zoals WB, ELISA, IHC (immunohistochemie), ICC (immunocytochemie) en FCM (stroomcytometrie). Onder hen voert FCM, die gebruikmaakt van specifieke antistof-sondes, een snelle analyse uit van enkele cel of andere biologische deeltjes op cel- en moleculair niveau. Daarom is FCM een van de meest gebruikte immunoassays. Als celscreening wordt uitgevoerd, is het gebruik van de corresponderende antistof-sonde voldoende; echter, als screening van kleine biologische moleculen gewenst is, zoals die van een klein eiwit, virus of cytokiene, moet de CBA (cytometrische kralen-array) methode worden aangenomen omdat FCM niet direct kleine cytocinen kan detecteren. De CBA-methode gebruikt kleurstof-gelabelde kralen geconstrueerd met specifieke vangstantilichamen op het oppervlak. Wanneer CBA-kralen worden gemengd met het monster en corresponderende kleurstof-gelabelde antilichamen, zullen sandwich-complexen vormen zoals in ELISA, en het kleine antigen kan worden gedetecteerd door FCM.

In deze studie presenteren we een groep complexen inclusief een PAMAM-geconjugeerde geit anti-konijn IgG en een QDs-geconjugeerde geit anti-muis IgG. Deze groep complexen kan worden gebruikt voor FCM, ICC en IHC. Wanneer konijn anti-antigen en muis anti-antigen worden toegevoegd, zal het corresponderende antigen gedetecteerd worden. Dit model kan veel typen antigenen detecteren, inclusief kleine eiwitten, virussen en cytocinen wanneer de corresponderende muis en konijn antilichamen aanwezig zijn. Schema 1 toont de complexen gebruikt in FCM, we nemen HSP27 als voorbeeld. HSP27 is ook bekend als HSPB1 (hitteshock-eiwit familie B nummer 1) en is een belangrijk eiwit betrokken bij medicijnresistentie, celdeling, apoptose, tumorontstaan en metastasering, etc. In dit model fungeert de PAMAM-geconjugeerde geit anti-konijn IgG als drager en vangst, vergelijkbaar met de CBA (cytometrische kralen-array) kralen, waardoor de kleine moleculaire antigenen gedetecteerd kunnen worden door FCM. De QDs-geconjugeerde geit anti-muis IgG fungeert als fluorescente sonde. Als de antigenen membraaneiwitten of intracellulaire eiwitten zijn, kunnen we de traditionele FCM-methode gebruiken om de antigenen te detecteren. We hoeven alleen de QDs toe te voegen en niet het PAMAM-deel. Voor intracellulaire eiwitten en membraaneiwitten kunnen cellen worden beschouwd als doelen die direct gedetecteerd kunnen worden door FCM-methode; ze hebben het PAMAM-deel niet nodig om een pseudocel te vormen. Daarom kunnen we de complexen splitsen en ze afzonderlijk gebruiken.

Resultaten en Discussie

De groep complexen omvat twee delen, een PAMAM-deel en een QDs-deel. Het PAMAM-deel is een PAMAM-geconjugeerde geit anti-konijn IgG. We gebruikten vijfde generatie amino-getermineerde PAMAM-dendrimers (G5 PAMAM) als een oppervlakte-stabiliserend middel om oplosbaarheidskenmerken ideaal voor waterige omgevingen te bieden, maar deze dendrimer heeft een sterke positieve lading die schadelijk is voor antistofbinding. Om de positieve lading te neutraliseren, losten we PAMAM op in DMSO en voegden succinezuuraanhydride (dihydro-2,5-diketotetrahydrofuran) toe om de PAMAM-amino-groep te neutraliseren. De amino-groep in PAMAM reageert met succinezuuraanhydride om amide-bindingen te vormen. Na de reactie werd het product gedialyseerd, lyofiliseerd, geweegen en heropgelost, het product is bijna neutraal en we noemden het product "N-PAMAM", wat in staat is om te conjugeren met geit anti-konijn IgG. PAMAM, met name G5 PAMAM, bevat een groot aantal kaviteiten, en de IgG kan geencapsuleerd worden binnen de lege ruimtes van G5 PAMAM. Geit anti-konijn IgG werd eerst opgelost in MES-buffer (0,1 mol/L, pH 6,0), daarna werden EDC en sulfo-NHS (bij een molaire verhouding van 1:1) toegevoegd, en het mengsel werd 15 min geïncludeerd. Ten slotte werd N-PAMAM (neutraal PAMAM) toegevoegd gevolgd door incubatie bij 4 °C in een schudbed overnachten. Deze polymere zelfassemblage in waterige oplossing om polymere micellen te vormen die de anders onoplosbare lage moleculaire gewicht gasten encapsuleerden; na de reactie was dialyse vereist om de niet-gereageerde materialen te verwijderen. Daarna werd het product lyofiliseerd, geweegen en heropgelost in bewaerbuffer, en ten slotte werd de N-PAMAM-geconjugeerde geit anti-konijn IgG gemaakt.

De fluorescente en UV-vis-spectra van N-PAMAM-IgG (geit anti-konijn) in MES zijn getoond in Fig. 1. In vergelijking met N-PAMAM (neutraal PAMAM) en IgG, was de fluorescente emissiepiek van N-PAMAM-IgG de laagste intensiteit. Het UV-vis-spectrum toont dat in vergelijking met IgG, MES-buffer, PAMAM en N-PAMAM, alleen N-PAMAM-IgG een absorptiepiek had bij een golflengte van 200 nm. Of het nu de fluorescente spectrum of UV-vis-spectrum is, N-PAMAM-IgG toont verschillende kenmerken in vergelijking met N-PAMAM en IgG, wat indirect bewijst dat N-PAMAM en IgG gecombineerd zijn in plaats van simpelweg gemengd. Om de antistofactiviteit van N-PAMAM-IgG te detecteren, werd ELISA uitgevoerd. Zoals getoond in Fig. 2, was de IgG (geit anti-konijn) antistofweerstand niet verloren bij koppeling met N-PAMAM.

Het QDs-deel is een QDs-geconjugeerde geit anti-muis IgG. Antistof-geconjugeerde QDs worden meestal gevormd door kruiskoppelingsreacties, waarbij antistofmoleculen binden aan functionele groepen zoals carboxylgroepen of aminogroepen op het QDs-oppervlak. In deze studie gebruikten we kern/schil CdSe/ZnS wateroplosbare quantum dots gestabiliseerd met carboxyl-liganden en de carbodiimide-koppelingsreactie met behulp van EDC (1-ethyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride). Deze methode is een van de meest populaire methoden voor het conjugeren van een antistof aan het oppervlak van QDs. De CdSe/ZnS QDs-micellen werden eerst geïncludeerd in de aanwezigheid van EDC en sulfo-NHS inboraatbuffer (5 mM BS, pH 7,2). Daarna werd geit anti-muis IgG toegevoegd, en het mengsel werd geïncludeerd bij 4 °C in een schudbed overnachten in het donker. Ten slotte werd 10% BSA (rundveeserumalbumine) toegevoegd om de niet-gereageerde QDs te blokkeren, en het product werd gezuiverd door opeenvolgende centrifugatie en heroplossen om de niet-gereageerde materialen te verwijderen. De antistofactiviteit van de QDs-geconjugeerde IgG (geit anti-muis) kan 3 maanden bewaard blijven na opslag bij 4 °C in het donker.

De deeltjesgrootte van de QDs-IgG (geit anti-muis) en QDs in bewaerbuffer (2,5 mM BS, pH 8,0, 0,1% BSA) zijn getoond in Fig. 3a. Na de koppelingsreactie, nam de diameter van de producten duidelijk toe, en de producten hadden goede homogeniteit en stabiliteit. Deze kenmerken zijn de sleutel tot hun gebruik als detectiesonde. De fluorescente spectra van de QDs-IgG en QDs zijn getoond in Fig. 3b, en zoals getoond in Fig. 3a, toont de toename van de productdiameter aan dat de IgG gecombineerd was met de QDs, maar de QDs-IgG fluorescente emissiepiek was dezelfde als die van de QDs. Dit resultaat betekent dat de koppeling van IgG en QDs de optische kenmerken van de QDs niet veranderde, wat nuttig is voor hun toepassing in immunoassays. Om de antistofactiviteit van de QDs-IgG te detecteren, gebruikten we een ELISA-methode met een PVDF-membraan. De muis anti-AKT antistof werd gedilueerd tot concentraties van 1 μg/ml, 10 μg/ml, 100 μg/ml en 200 μg/ml, en de vier concentratiegradient-antigenen werden gehybrideerd met QDs-IgG (geit anti-muis) bij dezelfde concentratie van 0,1 mg/ml. Na hybridisatie gedurende 40 min bij 37 °C in het donker, werd het PVDF-membraan gewassen met PBST (pH 6,0, 0,1% Tween 20) 3 keer, en het PVDF-membraan werd bestraald met UV-licht. De fluorescente intensiteit werd getoond in Fig. 3c, de fluorescente intensiteit nam toe met toenemende antigenconcentratie, wat aangeeft dat QDs-IgG een hoge antistofactiviteit heeft.

Deze sectie introduceert hoe deze groep complexen in FCM te gebruiken. Zoals hierboven vermeld, kunnen we veel typen antigenen detecteren, zoals kleine eiwitten, virussen en cytocinen, en we gebruikten het HSP27-eiwit als voorbeeld, laten we nu het proces in detail overlopen. HSP27 bevindt zich in het cytoplasma en wordt in grote hoeveelheden gesecreteerd in tumorcellen, met name in longkanker, pancreaskanker, urineweefselkanker, nierkanker, borstkanker en melanomahuidkanker. Omdat een klein deel van HSP27 extracellulair wordt gesecreteerd, moeten we de cel lyseren om het eiwit te extraheren. In dit experiment selecteerden we twee cellijnen, MCF-7 (humane borstkankercellen) als de testgroep en L02 (normale humane levercellen) als de controlegroep. De cellen werden gelyseerd om de intracellulaire eiwitten te extraheren. De totale eiwitten werden verzameld, daarna werden konijn anti-HSP27 en muis anti-HSP27 toegevoegd volgens de eiwitconcentratie, gevolgd door incubatie bij 37 °C gedurende 50 min. Vervolgens werd N-PAMAM-IgG toegevoegd aan het mengsel, het mengsel werd geïncludeerd bij 37 °C gedurende 30 min, en vervolgens verdeeld in twee gelijke groepen: een testgroep en een PAMAM-groep. Ten slotte werd QDs-IgG toegevoegd aan de testgroep en geïncludeerd bij 37 °C gedurende 30 min in het donker. Figuur 4 toont de fluorescente analyse voor de twee groepen cellen door stroomcytometrie. De fluorescente intensiteit van de testcurve was veel hoger dan die van de PAMAM-curve in de MCF-7-groep, terwijl in de L02-groep de twee curves bijna overlappend waren. Wanneer HSP27 bestaat in cellextracten, zullen N-PAMAM-IgG en QDs-IgG indirect samen binden om een sandwichcombinatie te vormen in de aanwezigheid van konijn anti-HSP27 en muis anti-HSP27. Als HSP27 niet bestaat, zal slechts een kleine hoeveelheid QDs-IgG binden aan N-PAMAM-IgG door niet-specifieke adsorptie. Daarom, als de fluorescente intensiteit van de testcurve hoger is dan die van de controle PAMAM-curve, is HSP27 in het monster enthalten. Figuur 4 toont dat MCF-7-cellen meer HSP27-eiwit secreteerden dan L02-cellen.

Zoals hierboven vermeld, kunnen deze complexen gesecreteerde intracellulaire eiwitten detecteren door FCM; in principe kunnen deze complexen toegepast worden op elk type antigen. Verder kunnen de twee delen van de combinatie apart worden gebruikt. Als het antigen dat we willen detecteren in de cel of op het celoppervlak ligt, kunnen we alleen het QDs-deel gebruiken. Bijvoorbeeld, β-actine is een van de hoofdbestanddelen van het cytoskelet gelegen in cellen en breed aanwezig in eukaryotische cellen. Figuur 5a toont de fluorescente analyse alleen met QD-deel voor β-actine in HeLa-cellen door FCM. HeLa-cellen werden gewassen en behandeld met methanol om de penetratie van het celmembraan te verbeteren en vervolgens verdeeld in twee gelijke groepen. De β-actine-groep werd geïncludeerd met muis anti-β-actine bij 37 °C gedurende 30 min, en de controlegroep werd geïncludeerd met BSA. Na wassen met PBS, werden beide groepen geïncludeerd met QDs-IgG (geit anti-muis) bij 37 °C gedurende 30 min. Na tweemaal wassen met PBS, werden beide groepen gedetecteerd door FCM. De fluorescente intensiteit van de β-actine-curve was veel hoger dan die van de controlecurve, wat aangeeft dat de HeLa-cellen het β-actine-eiwit bevatten.

Daarnaast kunnen deze complexen ook toegepast worden op ICC. Echter, voor ICC is het vereist dat het doelantigen in de cel of op het celoppervlak ligt en in grote hoeveelheden aanwezig is; anders zal het experimentele doel moeilijk te onderscheiden zijn van de achtergrond. We namen het β-actine-eiwit als voorbeeld en zaaiden HeLa-cellen in een 10 cm celplaat en plaatsten een microscoop-dekglas erin, gebruikten methanol om cellen te immobiliseren. De cellen werden vervolgens geïncludeerd met muis anti-β-actine (PBS, 1% BSA) bij 37 °C gedurende 1 uur, tweemaal gewassen met PBST, en geïncludeerd met QDs-IgG (geit anti-muis) bij 37 °C gedurende 1 uur in het donker. Na tweemaal wassen met PBST en kleuren van de celkern met DAPI, werd de fluorescente gedetecteerd met een fluorescencemicroskoop. Figuur 5b toont de fluorescencemicroskoopafbeeldingen van de HeLa-cellen. Het voordeel van QDs als fluorescente kleurstof is dat het QDs-signaal en het DAPI-signaal tegelijkertijd waargenomen kunnen worden onder bestraling van het ultraviolette kanaal; daarom, volgens de kern, kan het doel duidelijk gelokaliseerd worden. In dit experiment is β-actine cytoskeleteiwitten rond de celkern en kan duidelijk waargenomen worden.

Conclusies

Concluderend, hebben we de toepassing van de complexen gebruikt in klinische immunoassays gedemonstreerd, zoals FCM en ICC. De groep complexen omvat een PAMAM-geconjugeerde geit anti-konijn IgG en een QDs-geconjugeerde geit anti-muis IgG. Wanneer konijn anti-antigen en muis anti-antigen werden toegevoegd, werd het corresponderende antigen gedetecteerd. Deze complexen zijn voordelig vanwege hun brede spectrum, hoge biocompatibiliteit, hoge lichtstabiliteit en lage biologische toxiciteit. Dit complex is een universeel model dat alleen de corresponderende primaire antilichamen vereist te veranderen. In dit artikel gebruikten we de complexen om HSP27 en β-actine te detecteren, maar in theorie kan dit proces toegepast worden op elk type antigen. Verder kunnen we de detectiemethode kiezen volgens de kenmerken van de antigenen, en we kunnen de complexen ook splitsen en afzonderlijk gebruiken volgens de werkelijke behoeften. Deze methode stelt ook kleine moleculen, zoals kleine eiwitten en virussen, in staat om gedetecteerd te worden door stroomcytometrie. We geloven dat met geschikte verbetering, het ook toegepast kan worden op andere methoden, zoals immunofluorescentie (IF), western blot (WB) en laterale-stroom immunochromatografische strip (LCS).

Methoden/Experimenteel

Materialen

CdSe/ZnS quantum dots (wateroplosbare QDs met carboxylgroepen, cas nr. N/A) werden aangeschaft bij NEPQD, China. PAMAM (vijfde generatie amino-getermineerd, Lot nr. CYD-150A) werd aangeschaft bij CYD, China. Geit anti-konijn IgG (ab6702) en muis anti-β-actine (ab8226) werden aangeschaft bij Abcam, VK; muis anti-HSP27 (BF0624) en konijn anti-HSP27 (AF6082) werden aangeschaft bij Affinity, VS; geit anti-muis IgG (bs0296G) werd aangeschaft bij Bioss, China; EDC en sulfo-NHS werden aangeschaft bij Thermo Fisher; DMEM en foetale kalverseerum werden aangeschaft bij Gibco; en PVDF-membranen (0,2 μm) werden aangeschaft bij Millipore. Alle overige chemische reagentia waren van analytische reactie-kwaliteit.

Preparatie van N-PAMAM-IgG (geit anti-konijn)

1. a)

   Preparatie van N-PAMAM (neutraal PAMAM): PAMAM (G5 amino-getermineerd, gemiddelde MW 28826) (60 mg, 2,081 mM) werd opgelost in DMSO (2 ml) en succinezuuraanhydride (dihydro-2,5-diketotetrahydrofuran) (0,266 g, 2,66 mM) werd toegevoegd om de aminogroepen te neutraliseren. Omdat één mol G5 PAMAM-macromoleculen 128 mol aminogroepen heeft, bevat 60 mg PAMAM 0,266 mM aminogroepen, en de molaire verhouding voor PAMAM-aminogroepen en succinezuuraanhydride is ongeveer 1:10. Daarna werd het mengsel gemengd in een schudbed bij 100 rpm gedurende 4 uur, waarna de oplossing gedialyseerd werd door een 3500 MWCO dialysemembraan gedurende 24 uur, en N-PAMAM werd verkregen na lyofilisatie.

2. b)

   Preparatie van N-PAMAM-IgG (geit anti-konijn): geformuleerde MES-buffer (100 mM, pH 6,0), neem dan 100 μl MES-buffer in een buis, voeg 20 μM EDC en 20 μM sulfo-NHS toe en roer met een vortex op lage snelheid. Voeg 35,7 μl IgG (pH, 0,5 μM) toe en roer met vortex, daarna voeg 19 μg N-PAMAM toe en incubeer bij 4 °C overnachten, ten slotte zal de oplossing gedialyseerd worden door een 3500MWCO en een 8000MWCO dialysemembraan gedurende 3 dagen, na lyofilisatie zal de N-PAMAM-IgG verkregen worden.

Preparatie van QDs-IgG (geit anti-muis)

1. a)

   Formulering van BS-buffer:

1. 1.

   Bereid borax-buffer (50 mM): weeg 19,07 g borax en los op in 1 L ultrazuiver water.

2. 2.

   Bereid boorzuur-buffer (50 mM): weeg 3,09 g boorzuur en los op in 1 L ultrazuiver water.

3. 3.

   pH 8,0 BS-buffer en pH 7,2 BS-buffer werden bereid door de bovenstaande twee oplossingen te mengen.

4. 4.

   Wasbuffer, ook gebruikt als bewaerbuffer, werd bereid door de pH 8,0 BS-buffer te verduenen tot een concentratie van 5 mM en 0,1% Tween 20 toe te voegen.

5. 5.

   Activatieoplossing werd bereid door de pH 7,2 BS-buffer te verduenen tot een concentratie van 5 mM en 0,1% Tween 20 toe te voegen.

6. 6.

   EDC-buffer werd gemaakt door 0,27 g EDC op te lossen in 5 ml activatieoplossing, en sulfo-NHS-buffer werd gemaakt door 0,378 g sulfo-NHS op te lossen in 5 ml activatieoplossing.

1. b)

   Preparatie van QDs-IgG (geit anti-muis):

Eerst werd 450 μl QDs (CdSe/ZnS, 5 mg/ml) opgelost in 2,25 ml activatieoplossing, daarna werden 150 μl EDC-buffer en 150 μl sulfo-NHS-buffer toegevoegd, en de oplossing werd 5 min op ijs geultrasoniseerd. Tweedens werd de oplossing gecentrifugeerd bij 12.000 rpm gedurende 5 min om het supematant te verwijderen, en het neerslag werd opgelost in 1,2 ml wasbuffer. Na 30 min ultrasoonmengen, werd 100 μg IgG-antistof toegevoegd, daarna werd de oplossing overnachten geïncludeerd in een schudbed bij een temperatuur van 4 °C. Derde, 150 μl 10% BSA werd toegevoegd gevolgd door incubatie bij 30 °C gedurende 30 min en centrifugatie bij 12.000 rpm gedurende 2 min om supematant te verwijderen. Het neerslag werd heropgelost in 1 ml wasbuffer en gecentrifugeerd bij 12.000 rpm gedurende 2 min, deze stap werd herhaald en ten slotte het neerslag opgelost in 1 ml bewaerbuffer. Aan het einde werd 10% BSA toegevoegd; het mengsel werd gemengd met volledige ultrasoonschokmenging en gecentrifugeerd bij 820 g/min om het neerslag te verwijderen, met het supematant bevattend QDs-IgG. QDs-IgG moet bewaard worden bij 4 °C in het donker gedurende 3 maanden. Het moet worden opgemerkt dat de monsters alleen bij 4 °C bewaard kunnen worden, en niet bevroren mogen worden zelfs met glyzerine; anders zal het een groot aantal quantum dots veroorzaken die in clusters samenkomen, neerslag vormend die niet weggespoeld kan worden met PBST, wat leidt tot ernstige achtergrondfluorescentie.

FCM-analyse voor HSP27-eiwit

HSP27 bevindt zich in het cytoplasma en wordt in grote hoeveelheden gesecreteerd in tumorcellen. In dit experiment selecteerden we twee cellijnen, MCF-7 (humane borstkankercellen) als de testgroep en L02 (normale humane levercellen) als de controlegroep. De twee groepen cellen werden gezaaid in een 10 cm cultuurschaal en geïncludeerd in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) met 10% foetale kalverseerum (FBS) bij 37 °C. Toen cellen 80% van de schaal bedekten, werden de cellen verteerd met trypsin en tweemaal gewassen met PBS. Vervolgens werden de cellen heropgelost in 1 ml PBS. Getelde de cellen met een hematocytometer, T-PER cellysisebuffer werd toegevoegd volgens de celconcentratie, waarna het intracellulaire eiwit geëxtraheerd werd uit het cellysaat. Vervolgens werd het cellysaat gecentrifugeerd bij 14000 rpm gedurende 10 min om het supematant te verzamelen, en de eiwitconcentratie werd gemeten door de BCA-methode, volgens de eiwitconcentratie, werden konijn anti-HSP27 en muis anti-HSP27 toegevoegd en geïncludeerd bij 37 °C gedurende 50 min. In dit experiment was de eiwitconcentratie van L02 ongeveer 0,2 mg/ml en MCF-7 0,25 mg/ml, en het volume van beide was 500 μl. De twee antilichamen, konijn anti-HSP27 en muis anti-HSP27, werden aan de cellen toegevoegd (0,625 μl aan MCF-7 en 0,5 μl aan L02-cellen).

Vervolgens werd 1 mg/ml N-PAMAM-IgG toegevoegd aan de mengsels gevolgd door incubatie bij 37 °C gedurende 30 min; 6,25 μl werd toegevoegd aan de MCF-7-groep, en 5 μl werd toegevoegd aan de L02-groep. Na incubatie werd het product verdeeld in twee gelijke groepen, de testgroep en de PAMAM-groep. Ten slotte werd QDs-IgG toegevoegd aan de testgroep, die geïncludeerd werd bij 37 °C gedurende 30 min in het donker. Vervolgens werden de twee groepen cellen geanalyseerd door stroomcytometrie.

FCM-analyse voor het β-actine-eiwit

β-actine is een intracellulair eiwit dat een van de hoofdbestanddelen is van het cytoskelet en breed voorkomt in eukaryotische cellen. HeLa-cellen werden gezaaid in een 10 cm cultuurschaal en geïncludeerd in DMEM met 10% FBS bij 37 °C gedurende 2 dagen, daarna werd het supematant verwijderd en de cellen tweemaal gewassen met PBS. De cellen werden verteerd met trypsin, waarna de cellen gecentrifugeerd werden bij 800 rpm gedurende 3 min om het supematant te verwijderen, en 1 ml koud methanol werd toegevoegd om de cellen herop te lossen. Na 5 min werden de cellen gecentrifugeerd bij 800 rpm gedurende 3 min om het supematant te verwijderen, en de cellen werden heropgelost in 1 ml PBS. Deze stap werd herhaald, en de HeLa-cellen werden verdeeld in twee gelijke groepen. De testgroep werd geïncludeerd met muis anti-β-actine bij 37 °C gedurende 30 min, en de controlegroep werd geïncludeerd met BSA (rundveeserumalbumine). In dit experiment werd muis anti-β-actine opgelost in PBST (1% BSA, 5 μg/ml), en 100 μl IgG werd toegevoegd aan 300 μl van de testgroep, en een equivalent hoeveelheid BSA werd toegevoegd aan de controlegroep. Na een half uur incubatie, werden beide groepen geïncludeerd met QDs-IgG (geit anti-muis) bij 37 °C gedurende 30 min. Na tweemaal wassen met PBS, werden beide groepen beoordeeld door FCM.

ICC-analyse voor het β-actine-eiwit

HeLa-cellen werden gezaaid in een 10 cm cultuurschaal en geïncludeerd in DMEM met 10% FBS bij 37 °C gedurende 1 dag. Vervolgens werden verschillende gesteriliseerde dekglazen in de celschotel geplaatst, en de cellen werden verder gekweekt gedurende 2 dagen. De dekglazen werden verwijderd en tweemaal gewassen met PBS, daarna werden de dekglazen geïncludeerd in 400 μl methanol gedurende 20 min bij kamertemperatuur. De dekglazen werden 3 keer gewassen met PBS. Dan werd blokkeringsbuffer bereid met PBST (0,1% Tween 20), 22,52 mg/ml glycine en 10% BSA. Een dekglas werd in blokkeringsbuffer geplaatst en geïncludeerd gedurende 30 min bij kamertemperatuur. Vervolgens werd de blokkeringsbuffer verwijderd, en een dekglas werd geïncludeerd met muis anti-β-actine (PBS, 1% BSA) bij 37 °C gedurende 1 uur, tweemaal gewassen met PBST, en geïncludeerd met QDs-IgG (geit anti-muis) bij 37 °C gedurende 1 uur in het donker. Na tweemaal wassen met PBST en kleuren van de celkern met DAPI gedurende 2 min, werd het dekglas een keer gespoeld met PBS en een keer met water voor visualisatie onder een fluorescencemicroskoop.