Polymeer micel levering van olezuur: verbeterde oplosbaarheid en bewezen anti-rimpel effectiviteit

Samenvatting

Olezuur is tot nu toe alleen gebruikt als hulpstof in cosmetische producten. De doelstelling van de studie is het effect van olezuur als actieve ingrediënt voor het verlichten van rimpels in mensen te tonen en een polymere micel formulering te ontwikkelen die slecht oplosbaar olezuur in staat stelt als hoofdingrediënt in cosmetische producten voor rimpelreductie te worden gebruikt. De oplosbaarheid van olezuur werd geëvalueerd in oplosmiddelen, surfactanten en polymeren. De deeltjesgroottes en -vormen van polymere micellen die olezuur bevatten werden geëvalueerd door electroforetische lichtverstrooiing spectrophotometrie en scanning elektronen cryomicroscopie. Encapsulatie-efficiëntie en huiddoorlatendheid werden gemeten door HPLC. Stabiliteit van de polymere micellen bewaard bij 40 °C gedurende 3 maanden werd geëvalueerd door visuele observatie, deeltjesgrootte meting en olezuur inhoud meting. Polymere micellen in finale product ampoule vorm werden rond de ogen van 23 vrouwelijke proefpersonen toegepast gedurende 8 weken. Vijf huidparameters werden geëvalueerd door optische profilometrie elke 4 weken gedurende 8 weken. Daarnaast maakten professionals visuele observaties van de huid en werd een humane huidirritatiestudie uitgevoerd. Polymere micellen van olezuur met een deeltjesgrootte van minder dan 100 nm werden bereid met Capryol 90® en poloxamer. De huiddoorlatendheidssnelheid van het olezuur in de polymere micellen was hoger dan die in de andere oplossingen gemaakt van olezuur gedispergeerd in 2 verschillende surfactanten. Geen significante veranderingen in deeltjesgrootte, kleur of olezuur inhoud werden waargenomen, en de polymere micellen bewaard bij 40 °C gedurende 3 maanden ondergingen geen fase-scheiding. Na 8 weken toepassing had zich geen huidirritatie ontwikkeld en waren alle vijf parameters geëvalueerd door optische profilometrie alsook de visuele evaluatiescores significant verbeterd. Deze studie toonde aan dat de polymere micellen van olezuur bereid in deze studie stabiel en effectief waren bij het verlichten van rimpels in mensen als de belangrijkste actieve ingrediënt. Op basis van deze bevindingen wordt verwacht dat polymere micellen van olezuur breed gebruikt kunnen worden in cosmetische toepassingen.

Inleiding

Huidveroudering omvat zakt (laxiteit), verdunning en rimpels. Het kan versneld worden door infectie, roken, UV-licht, trauma, hormonale onbalans, stress en/of pro-oxidanten zoals hydrolasen waaronder elastinase of collagenase. Reactieve zuurstofsoorten of vrije radicalen gegenereerd door de bovengenoemde oorzaken schaden buurcellen en resulteren in verminderde hudeelasticiteit en verdunning. Met name UV-licht is bekend om de generatie van reactieve zuurstofsoorten te triggeren, die membraanlipiden, cellulaire eiwitten en DNA schaden, en daarmee de ontwikkeling van expressie rimpels, pigmentvlekken en melasma versnellen. Olezuur is een effectieve component van natuurlijke plantaardige oorsprong geëxtraheerd uit verschillende plantensoorten en gebruikt als een belangrijke medische en cosmetische ingrediënt. Het wordt ook gevonden in vruchten zoals appels of peren. Als een soort hydroxy pentacyclische terpeen, werd olezuur voor het eerst geïsoleerd uit olijf (Olea europaea) bladeren en is wijdverspreid in planten waaronder Oosterse swertia (Eugenia jambos) en gele gentiën (Gentiana lutea). Het bevordert anti-verouderingsfuncties via de synthese van niet alleen pro-collageen, wat belangrijk is voor collageensynthese, maar ook ceramiden en filaggrine, en ook door het remmen van de activiteit van MMP-1, een enzym dat eiwitten zoals collageen afbreekt. Op basis van deze bevindingen kan aangenomen worden dat olezuur een dubbele anti-verouderingseffect heeft door niet alleen collageenproductie te bevorderen maar ook collageenafbraak te voorkomen. Als resultaat is olezuur een heel veelbelovende anti-veroudering ingrediënt voor cosmetische producten. Echter, het gebruik van olezuur in cosmetische producten als hoofdingrediënt wordt beperkt door zijn slechte waterige oplosbaarheid; daarom zijn slechts kleine hoeveelheden olezuur als onderdeel van een geëmulsificeerde formulering gebruikt als hulpstof in cosmetische producten. De fysicochemische eigenschappen gerelateerd aan huidabsorptie omvatten het smeltpunt, molecuulgewicht, scheidingscoëfficiënt en hydrofiliciteit. Het smeltpunt is hoger dan 300 °C, wat aangeeft dat het een hoog kristallijn materiaal is. Hoog kristallijne materialen vereisen meer energie voor oplossing, tonen slechte biobeschikbaarheid door hun beperkte oplosbaarheid en worden daardoor slecht geabsorbeerd. Daarnaast is bekend dat hoog hydrofiele of lipofiele verbindingen, of verbindingen met hoog molecuulgewicht niet gemakkelijk de huid doorlaten. De meest frequente methode om de huiddoorlatendheid van dergelijke moleculen te verbeteren is de synthese van precursors of het gebruik van colloïdale drager systemen. In dit opzicht zijn liposomen, emulsies en polymere micellen actief bestudeerd.

Polymere micellen zijn zelf-samengestelde nano-schaal aggregaten die kern-schelp structuren vormen in waterige oplossing. Polymere micellen worden vaak gemaakt van di-blok of tri-blok copolymeren die een hydrofoob innerste kern en hydrofiel buitenste schil kunnen vormen. Polymere micellen worden beschouwd als fysiek stabieler dan surfactant micellen aangezien de eigenschappen van polymere micellen variëren afhankelijk van het type en de verhouding van polymere monomeren in een blokcopolymeer en relatief lage kritische micel concentraties hebben.

In deze studie bereidden we polymere micellen van olezuur en evalueerden hun deeltjesgrootte en -vorm, en de resulterende encapsulatie-efficiëntie en huiddoorlatendheidssnelheid van olezuur. De fysieke stabiliteit van olezuur in deze vorm werd ook geëvalueerd gedurende 3 maanden. Het humane anti-rimpel effect van olezuur in daadwerkelijke cosmetische productformulering werd ook onderzocht.

Materialen en Methodes

Materialen

Olezuur, Tween 80, Tween 20 en Tween 60 werden gekocht bij TCI (Tokio, Japan). PEG 400, Pluronic F127 en Pluronic F68 werden verkregen van BASF (Ludwigshafen, Duitsland). Propyleenglycol, PEG 300 en PEG 200 werden verkregen van JUNSEI (Tokio, Japan). TRANSCUTOL P, LABRASOL, LAUROGLYCOL FCC, LABRAFAC, Capryol® 90 en Capryol™ PGMC werden gekocht bij Gattefossé (Lyon, Frankrijk). Disodium EDTA (Daejung Chemical & Metals Co., Ltd., Siheung, Korea), allantoïne (Sigma Aldrich, St. Louis, MI, VS), dipropyleenglycol (Daejung Chemical & Metals Co., Ltd., Siheung, Korea), propanediol (DuPont Tate & Lyle Bio Products Company, LLC, Loudon, VS), carbomeer (The Lubrizol Corporation, Ohio, VS) PEG/PPG/polybutyleenglycol-8/5/3 glycerine (NOF Corporation, Tokio, Japan), natriumhyaluronaat (TCI, Tokio, Japan), bêta-glucan (SK Bioland, Cheonan, Korea), fenoxyethanol (Daejung Chemical & Metals Co., Ltd., Siheung, Korea), caprylylglycol (J TWO K BIO CO., Ltd., Cheongju, Korea) en ethylhexylglycerine (J TWO K BIO CO., Ltd., Cheongju, Korea) werden gebruikt voor het bereiden van het cosmetische product met olezuur. HPLC graad acetonitril werd verkregen van Burdick & Jackson (Muskegon, MI, VS). Driedestilleerd water werd gebruikt, en andere oplosmiddelen en reagentia waren EP en GR graad. Crlori:SKH1-hr kaal vrouwelijke muizen werden gekocht bij OrientBio (Seongnam, Korea).

HPLC Analyse

Olezuur werd geanalyseerd met behulp van Shimadzu LC-30 series HPLC (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan). Een Kromasil 100 C18 250 mm × 4,6 mm, 5 μm, analytische kolom (Teknokroma, Barcelona, Spanje) werd gebruikt bij kamertemperatuur. De mobiele fase bestond uit acetonitril en water (85:15, v/v), de stroomsnelheid was 1 mL/min en de injectievolume 10 μL. Olezuur werd geanalyseerd bij UV λ = 210 nm. Alle metingen werden bij kamertemperatuur genomen.

Oplosbaarheid en Formulering Optimalisatie Studie

Een afgemeten hoeveelheid olezuur werd aan een oplosmiddel toegevoegd, geroerd bij 60 °C gedurende 48 uur en 5 minuten gesonicatieerd met een ultrasoon reiniger. De suspensie werd gecentrifugeerd bij 2000 rpm met een Universal 320R centrifuge (Hettich, Tuttlingen, Duitsland), en het supernatant werd vervolgens verzameld. Vervolgens werd het supernatant gefiltreerd door een 0,45 μm PVDF membraan filter (Whatman, Kent, VK). De oplosbaarheid van olezuur in het corresponderende oplosmiddel werd geschat door het gewicht van overgebleven vaststoffen af te trekken van de som van de initiële gewichten van het olezuur en het oplosmiddel (Tabel 1).

De formulering optimalisatie studie werd uitgevoerd met poloxamer 188, poloxamer 407, Tween 60 en Tween 80. Verschillende verhoudingen van amphiphiele polymeren en surfactanten werden geprobeerd zoals samengevat in Tabel 2. Elk van olezuur en Capryol® 90 werd afgewogen, verhit en geroerd bij boven 60 °C tot heldere oplossingen waargenomen werden. De polymeren/surfactanten getoond in Tabel 2 werden dan aan de heldere oplossing toegevoegd en geroerd bij boven 60 °C tot heldere oplossingen waargenomen werden. De oplossingen werden vervolgens gedispergeerd in gedestilleerd water (Fig. 1). De resulterende oplossing werd ongeveer 48 uur gelaten en een visuele inspectie werd vervolgens gemaakt om de optimale formulering te selecteren. De resultaten van de visuele inspecties van elke formulering in Tabel 2, inclusief observaties van neerslag, fase-scheiding, transparantie en gelvorming, zijn samengevat in Tabel 3.

Bereiding van Polymere Micellen van Olezuur

Polymere micellen van olezuur (PMO) werden bereid met de formuleringen G en H in Tabel 2 met de methode getoond in Fig. 1. PMO-G en PMO-H werden gebruikt voor volgende experimenten en PMO-H in de cosmetische producten voor de klinische proeven.

Kleurtest

Polymeer micellisatie wanneer formulering G of formulering H in water werd gedispergeerd werd bevestigd door visuele observatie, d.w.z. transparantie. PMO vorming (PMO-G of PMO-H) werd ook bevestigd door een kleurtest. Methylene blauw werd toegevoegd aan de mengsels van water en Capryol® 90, water, Capryol® 90, PMO-G en PMO-H en de kleur van de oplossingen werden visueel geobserveerd en gefotografeerd.

Deeltjesgrootte Meting

De ELS (electroforetische lichtverstrooiing) techniek meet verstrooiingsintensiteitsfluctuaties van de deeltjes als functie van tijd wanneer de deeltjes zowel willekeurige Browniaanse beweging als georiënteerde elektroforetische beweging vertonen in een goed gedefinieerd elektrisch veld. Deeltjes elektroforetische mobiliteit wordt gemeten door de ELS techniek en stelde de deeltjesgrootte van zowel PMO-G als PMO-H in staat te worden geëvalueerd met behulp van een electroforetische lichtverstrooiing spectrophotometer (ELS-Z, Photal, Otsuka Electronics, Japan).

Scanning Elektronen Cryomicroscopie (Cryo-SEM) Analyse

Cryogene scanning elektronenmicroscopie of scanning elektronen cryomicroscopie (cryo-SEM) is een krachtige techniek voor het visualiseren van de toestand van de microstructuur of nanostructuur van colloïdale polymere suspensies of dispersies nadat ze geïmmobiliseerd zijn door snel invriezen en gefractureerd voor imaging. De fractuur wordt gemaakt en onderzocht bij -196 °C, het normale kookpunt van vloeibare stikstof en ver beneden de glasovergangstemperatuur van zowel bulk als volledig samengevoegde deeltjes. Cryo-SEM beelden onthullen een reeks reacties van deeltjes op fracturen die langs hen door ijs voortschrijden. Scanning elektronen cryomicroscopie (Tescan Mira 3 LMU FEG/Quorum Technologies PP3000T Cryo-SEM Monster Voorbereiding Systeem) werd gebruikt om de vorm van de PMO's te observeren.

Encapsulatie Efficiëntie

De encapsulatie-efficiëntie van de olezuur polymere micellen werd geëvalueerd. PMO werd gecentrifugeerd bij 2000 rpm gedurende 15 min, en het supernatant werd verzameld en geanalyseerd door HPLC. De encapsulatie-efficiëntie werd berekend als de hoeveelheid olezuur in de polymere micellen gedeeld door de hoeveelheid olezuur initieel toegevoegd (mg) tijdens PMO bereiding.

Stabiliteit van PMO-H

De fysieke stabiliteit van PMO-H werd geëvalueerd door het te bewaren bij 40 °C gedurende 3 maanden. Kleurveranderingen, fase-scheiding, aanwezigheid van neerslag en troebelheidsveranderingen werden visueel geëvalueerd. PMO-H monsters genomen op regelmatige tijdstippen werden geanalyseerd door HPLC om de hoeveelheden overgebleven olezuur te bepalen en door een ELS-Z om de PMO-H deeltjesgrootte te bepalen. De resultaten worden gepresenteerd in Fig. 9

In Vitro Huiddoorlatendheidstest

Een in vitro huiddoorlatendheidstudie werd uitgevoerd met behulp van een Franz diffusie cel om de verbetering in huiddoorlatendheid van olezuur te onderzoeken. De test werd uitgevoerd op PMO-G, PMO-H, het mengsel van olezuur en Tween 80 gedispergeerd in gedestilleerd water, en het mengsel van olezuur en propyleenglycol gedispergeerd in gedestilleerd water. De huid van een 6-weken oude vrouwelijke kaal muis werd in stukjes van de vereiste grootte gesneden. Verticale Franz cellen werden gebruikt en de huid werd tussen de twee kamers gefixeerd met de stratum corneum naar boven gericht. 330 μl van de geselecteerde formulering werd op de huid aangebracht en de Franz cellen werden bedekt met parafilm. De receptor werd gevuld met PBS oplossing (pH 7,4) en ethanol in een 9:1 (v/v) verhouding. De receptoroplossing werd bij elke bemonsteringstijd bijgevuld met verse PBS oplossing. Monsters werden onttrokken op 2, 4, 6, 8, 10, 20 en 24 uur en geanalyseerd door HPLC. Na 24 uur werd de overgebleven formulering op de huid verwijderd met Kimwipes (Kimberly-Clark professional, NSW, Australië). De huid gebruikt in de doorlatendheidstudie werd gereinigd met PBS oplossing en het olezuur overgebleven in de huid werd gemeten door HPLC. Alle doorlatendheidsexperimenten werden in driedubbel uitgevoerd.

Statistiek van de Studie

De experimenten zijn in driedubbel onafhankelijk uitgevoerd en de resultaten van deze studie werden gerapporteerd als gemiddelde ± SD. Statistische analyse werd geverifieerd door onafhankelijke t-toets, en de waarde van p < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd.

Ampoule Bereiding met PMO-H

Voor de klinische test werd PMO-H gebruikt als testproduct. PMO-H, zuiver water, disodium EDTA, allantoïne, dipropyleenglycol, propanediol, carbomeer en PEG/PPG/polybutyleenglycol-8/5/3 glycerine werden toegevoegd en 10~15 min geroerd met een magnetische roerder, en daarna werd potassiumhydroxide toegevoegd en het mengsel verder 5~10 min geroerd. Zodra de ingrediënten homogeen gemengd waren, werden natriumhyaluronaat en bêta-glucan toegevoegd en verder 2~5 min geroerd, en daarna werden fenoxyethanol, propanediol, caprylylglycol en ethylhexylglycerine toegevoegd en 2~5 min geroerd. De finale formule werd aan een ampoule toegevoegd als testproduct. De ampoule luchtbellen werden verwijderd met een vacuüm droogoven voor testgebruik. Een controle werd bereid volgens dezelfde methode voor het testproduct behalve dat olezuur werd uitgesloten.

Humane Toepassingstesten

Humane Huidirritatiestudie

Een huidplaktest van het cosmetische product, dat PMO-H in een ampoule bevatte, werd uitgevoerd op 25 mannelijke en vrouwelijke proefpersonen van 22 tot 56 jaar die instemden om deel te nemen aan een humane huidirritatietest. Elke teststof werd op de bovenarm gedroogd en gefixeerd met een plak. De plak werd 24 uur bevestigd en de graad van stimulatie werd geobserveerd door 2 professionals 30 min, 24 uur en 48 uur na plakverwijdering volgens de criteria van de International Contact Dermatitis Research Group (ICDRG).

Klinische Proef voor Rimpelverbetering

Polymere micellen met olezuur in een ampoule als finale productvorm werden rond de ogen van 23 vrouwelijke proefpersonen van 30 tot 65 jaar toegepast die instemden om deel te nemen aan rimpelverbeteringstest. De proefpersonen voldeden aan de inclusiecriteria en geen van de exclusiecriteria en instemden om deel te nemen aan de humane toepassingstest. De dubbelblinde methode werd gevolgd door zowel onderzoekers als testproefpersonen. De test werd 8 weken uitgevoerd en de evaluatie werd elke 4 weken gedaan. De dubbelblinde methode en willekeurige toewijzing werden gebruikt. Het testproduct en de controle werden apart willekeurig toegepast aan de linker of rechter kant van het gezicht van dezelfde proefpersoon. Vijf parameters werden geëvalueerd door optische profilometrie met Skin Visiometer SV 700 (Courage + Khazaka electronic GmbH, Keulen, Duitsland) elke 4 weken gedurende 8 weken—gemiddelde ruwheid (R3) was de primaire eindpunt, en de vier parameters van huidruwheid (R1), maximale ruwheid (R2), gladheidsdiepte (R4) en rekenkundige gemiddelde ruwheid (R5) waren de secundaire eindpunten. Toe- of afnames van de vijf parameters op hetzelfde gebied van de proefpersoon werden in de loop van de tijd gemeten en de gemiddelde waarden van toename of afname van de vijf parameters werden berekend en vergeleken tussen controle en testproduct behandelingen. Daarnaast werd een visuele observatie van de huid gemaakt door professionals. Foto's van oogrimpels werden gemaakt met Janus 1 Mark II (PIE Co., Ltd., Suwon, Korea). De criteria gebruikt om de visuele evaluatiescores te bepalen zijn getoond in Fig. S1 en de visuele resultaten worden gepresenteerd in Fig. 13. De parameters werden vergeleken en geanalyseerd met behulp van een paired-samples t-toets bij een betrouwbaarheid van 95%.

Resultaten en Discussie

Bepaling van Oplosmiddel, Surfactant en Polymeer

De oplosbaarheid van olezuur in biocompatibele oplosmiddelen, specifiek surfactanten en polymeren, zijn getoond in Tabel 1. Olezuur neigt te zijn oplosbaar in hydrofobe oliën met lage hydrofiel-lipofiele balans (HLB). Capryol® 90 heeft een iets hogere HLB waarde in vergelijking met algemene oliën. Echter, olezuur toont relatief hoge oplosbaarheid in Capryol® 90. Daarnaast kan Capryol® 90 gemakkelijk gestabiliseerd worden als de innerste kern van micellen. Na het selecteren van Capryol® 90, werden verschillende typen surfactanten of poloxamers gescreend voor het schil deel van de olezuur micellen. De olezuur micel composities getoond in Tabel 2 zijn degenen die direct na verdunning met gedestilleerd water transparant waren. Echter, sommige composities waren onstabiel en ondergingen neerslag, fase-scheiding of gelvorming binnen 24 uur. Vertegenwoordigende beelden van neerslag, fase-scheiding, transparante vloeistof en gel toestanden zijn getoond in Fig. 2. De finale toestand van elke formule is samengevat in Tabel 3. Composities G en H bleven transparant zelfs na 24 uur. Hoewel compositie I helder bleef, was het een gel in plaats van een vloeistof. Composities A tot D bleken na 24 uur wazig met neerslag. Gegeven deze resultaten, werden composities G en H geselecteerd voor verdere ontwikkeling.

Kenmerken van de Polymere Micellen van Olezuur

De structuren van de polymere micellen van olezuur werden onderzocht door kleurtest. Figuur 3 toont de beelden van het mengsel van Capryol® 90 en gedestilleerd water, Capryol® 90, gedestilleerd water en de polymere micellen van compositie G (PMO-G) en van compositie H (PMO-H), na het toevoegen van methylene blauw aan de oplossing. Duidelijke fase-scheiding trad op voor het mengsel van Capryol® 90 en gedestilleerd water. Neerslag van methylene blauw werd waargenomen in het geval van Capryol® 90. Gedestilleerd water werd donkerblauw na toevoeging van methylene blauw. PMO-G en PMO-H werden ook blauw wat aangeeft dat de polymere micellen bestonden uit een olie-fase innerste kern en waterige fase buitenste schil. Met andere woorden, een amphiphiel polymeer, poloxamer 407 in composities G en H, fungeert als buitenste schil en helpt om polymere micellen van olezuur met succes te vormen door de innerste kern van Capryol® 90 met olezuur te encapsuleren.

Deeltjesgrootte, grootteverdeling en vorm kunnen goede indicatoren zijn voor het voorspellen van de fysieke stabiliteit van micel formuleringen. De gemiddelde deeltjesgrootte van PMO-G was 80,4 nm en die van PMO-H was 57 nm (Fig. 4). De histogrammen van PMO-A, G en H zijn getoond in Fig. 5 om de grootteverdelingen beïnvloed door fase toestand te vergelijken. Zoals getoond in Tabel 3, is PMO-A wazig door neerslag en PMO-G en H zijn transparant. De deeltjesgrootte van PMO-A is meer dan 100 nm en PMO-A toont een bredere grootteverdeling dan PMO-G en H (Fig. 5). PMO-H toont een smalle deeltjesgrootteverdeling dan PMO-G en vertoont een vloeibaarheid geschikt voor cosmetische producten.

Encapsulatie-efficiëntie voor zowel PMO-G als PMO-H was 99 tot 100%, wat aangeeft dat bijna 100% van het olezuur geencapsuleerd was in de innerste kern van PMO (Fig. 6).

De vorm van PMO-G en PMO-H werd onderzocht door scanning elektronen cryomicroscopie (Cryo-SEM). Cryo-SEM toonde aan dat zowel PMO-G als PMO-H sferische vorm polymere micellen waren. Echter, PMO-H polymere micellen waren meer consistent in grootte en vorm dan PMO-G polymere micellen (Fig. 7).

In Vitro Huiddoorlatendheidstudie van PMO

De totale hoeveelheid olezuur overgebleven in de huid en de totale hoeveelheid olezuur door de huid gediffundeerd als functie van tijd werden gemeten met behulp van de huid van een 6-weken oude vrouwelijke kaal muis. Vier verschillende formuleringen, PMO-G, PMO-H, het mengsel van olezuur en Tween 80 gedispergeerd in gedestilleerd water (OTw) en het mengsel van olezuur en propyleenglycol gedispergeerd in gedestilleerd water (OPG) werden vergeleken in termen van huiddoorlatendheidsefficiëntie van olezuur. De totale hoeveelheden olezuur door de huid gediffuneerd na 24 uur waren 29,49 ± 4,00% voor PMO-H, 21,39 ± 5,91% voor PMO-G, 13,66 ± 0,81% voor OTw en 5,90 ± 2,47% voor OPG. Zoals getoond in Fig. 7, was de eerste detectie van olezuur in het geval van zowel PMO-G als PMO-H mogelijk na 8 uur, terwijl de eerste detectie van olezuur in OTw mogelijk was na 10 uur en OPG na 20 uur. De fracties olezuur overgebleven in de huid waren 56,22 ± 13,50% voor PMO-H, 36,74 ± 0,72% voor PMO-G, 27,44 ± 7,02% voor OTw en 26,28 ± 5,42% voor OPG. PMO-H toonde de grootste hoeveelheid zowel olezuur door de huid gediffuneerd als olezuur overgebleven in de huid (Fig. 8). Deze resultaten wijzen erop dat PMO's sneller en meer kunnen diffunderen dan formuleringen die geen micellen vormen.

Stabiliteit van Vloeibare Olezuur Polymere Micellen

Op basis van de karakterisering en in vitro doorlatendheidsstudies werd PMO-H uiteindelijk geselecteerd voor ampoule bereiding. Voor ampoule bereiding werd de stabiliteit van ONM-H geëvalueerd. Voor de stabiliteitsstudie werd PMO-H in flaconen bewaard onder versnelde stabiliteitsstudiereomstandigheden bij 40 °C/75% RV gedurende 3 maanden. Neerslag, fase-scheiding, kleurveranderingen en transparantie werden dan visueel geëvalueerd. De fractie olezuur werd dan gemeten met HPLC en veranderingen in deeltjesgrootte werden ook gecontroleerd. Stabiliteit werd in de loop van de tijd gecontroleerd. PMO-H bleef transparant zonder neerslag of fase-scheiding en de kleur veranderde niet gedurende 3 maanden onder de versnelde stabiliteitscondities. De fractie olezuur gemeten door HPLC en de deeltjesgrootteveranderingen in de loop van de tijd zijn getoond in Fig. 9. De olezuur fractie bleef boven 98% en de deeltjesgrootte van 49,6 ± 5 nm bleef bijna constant gedurende de 3 maanden stabiliteitsstudieperiode. Deze resultaten tonen aan dat PMO-H fysiek en chemisch stabiel is gedurende 3 maanden onder de versnelde stabiliteitscondities.

Klinische Test

Humane Irritatietest

Voordat de klinische proef, werd een humane irritatietest uitgevoerd op 25 gezonde vrouwelijke en mannelijke vrijwilligers van 22~56 jaar. Het testproduct werd op de bovenarm van de proefpersonen geplakt gedurende 24 uur en de huidirritatie-index werd gemeten 30 min, 24 uur en 48 uur na plakverwijdering. Irritatie werd niet waargenomen met de cosmetische ampoule formule met PMO-H na 1 uur of 48 uur na plakverwijdering.

Klinische Proef

De klinische proef werd uitgevoerd op 23 vrouwelijke proefpersonen van 30~65 jaar met rimpels rond hun ogen; met uitzondering van de 3 uitvallers, voltooiden 20 proefpersonen de proef door zowel het testproduct, de PMO-H ampoule, als de controle apart toe te passen aan de linker of rechter kant van hun gezicht gedurende 8 weken. Huidveranderingen werden geëvalueerd volgens vijf parameters—gemiddelde ruwheid (R3) als primair eindpunt en vier additionele parameters als secundaire eindpunten, namelijk huidruwheid (R1), maximale ruwheid (R2), gladheidsdiepte (R4) en rekenkundige gemiddelde ruwheid (R5). De visuele evaluatiescore voegde een verder secundair eindpunt toe. Resultaten zijn samengevat in Tabel 4.

Het primaire eindpunt R3 was gedaald met 0,673% na 4 weken testproductgebruik en statistisch significant met 7,835% na 8 weken gebruik (p = 0,006). Met controle toepassing was R3 toegenomen met 5,127% na 4 weken gebruik en statistisch significant met 9,971% na 8 weken gebruik (p = 0,010). Het verschil in R3 waarde tussen de gebieden behandeld door het testproduct en die behandeld door de controle was statistisch significant na 8 weken gebruik (p = 0,000) maar niet statistisch significant na 4 weken gebruik, misschien door inter-proefpersoon variatie (Fig. 10).

De analyse van het secundaire eindpunt R1 toonde aan dat de waarde was gedaald met 4,629% na 4 weken testproductgebruik en statistisch significant met 9,973% na 8 weken gebruik (p = 0,017). Met controle toepassing was R1 toegenomen met 8,037% na 4 weken gebruik en 4,799% na 8 weken gebruik. Het verschil in R1 waarden tussen de gebieden gebruikmakend van het testproduct en de controle was niet statistisch significant na 4 weken gebruik maar wel na 8 weken gebruik (p = 0,024). Het secundaire eindpunt R2 was gedaald met 1,048% na 4 weken testproductgebruik en 5,803% na 8 weken. Met controle toepassing was het toegenomen met 7,261% na 4 weken en 9,536% na 8 weken. Het verschil in R2 waarde tussen de gebieden behandeld door het testproduct en die behandeld door de controle was statistisch significant na 8 weken gebruik (p = 0,016) maar niet na 4 weken gebruik. Het secundaire eindpunt R4 was significant gedaald met 8,594% (p = 0,039) na 4 weken testproductgebruik en met 9,747% na 8 weken gebruik. Met de controle was R4 toegenomen met 10,764% na 4 weken gebruik en 3,491% na 8 weken gebruik. Interessant was dat het verschil in R4 waarde tussen de gebieden gebruikmakend van het testproduct en de controle statistisch significant was na 4 weken gebruik (p = 0,008) maar niet na 8 weken. Het secundaire eindpunt R5 was gedaald met 6,333% na 4 weken testproductgebruik en 8,556% na 8 weken gebruik. Het verschil in R5 waarde tussen de gebieden van gebruik van het testproduct en de controle was niet statistisch significant na 4 weken of zelfs 8 weken gebruik.

De analyse van het verdere secundaire eindpunt, de visuele evaluatie van rimpels, toonde aan dat de visuele evaluatiescore was gedaald met 2,917% na 4 weken testproductgebruik en statistisch significant gedaald met 8,333% na 8 weken gebruik (p = 0,034). Met toepassing van de controle was de visuele evaluatiescore toegenomen met 1,667% na 4 weken en 4,167% na 8 weken. Het verschil van de visuele evaluatiescore tussen de gebieden behandeld door het testproduct en door de controle was statistisch significant na 8 weken gebruik (p = 0,046) maar niet na 4.

Samengevat, de analyse van het gerimpelde gebied rond de ogen toonde aan dat het verschil in de primaire eindpuntwaarde R3 tussen de gebieden behandeld door het testproduct en door de controle statistisch significant was na 8 weken gebruik. In termen van de secundaire eindpunten waren alle waarden gedaald na testproductgebruik en toegenomen na controle gebruik. Het verschil in R4 waarden tussen de gebieden behandeld door het testproduct en die behandeld door de controle was statistisch significant na 4 weken gebruik, maar het verschil van de R1 en R2 waarden waren statistisch significant alleen na 8 weken gebruik (Fig. 11). De visuele evaluatiescore door professionals toonde aan dat alle gemiddelde visuele evaluatiescores voor rimpels waren gedaald na 4 weken en 8 weken testproductbehandeling vergeleken met de controle (Tabel 5). Het verschil in de visuele evaluatiescore tussen de gebieden behandeld door het testproduct en door de controle was statistisch significant na 8 weken gebruik (Fig. 12). Over het algemeen, volgens alle eindpunten, werd de cosmetische formule met PMO-H als primaire ingrediënt gevonden om rimpels te helpen verbeteren na 8 weken gebruik (Fig. 13).

Conclusies

Surfactanten zijn veelvoorkomende hulpstoffen in cosmetische producten om de oplosbaarheid van slecht oplosbare materialen te verbeteren. Een waarschuwing zou de hoeveelheid zijn die in het product opgenomen wordt. Surfactanten moeten in voldoende hoeveelheid worden toegevoegd om slecht oplosbare materialen op te lossen zonder neerslag. Alleen een minimaal bedrag moet worden toegevoegd om veiligheidsredenen. Micel formulering kan de oplossing voor dit probleem zijn. Polymere micellen van olezuur ontwikkeld in deze studie verbeteren de oplosbaarheid van olezuur met een minimaal hoeveelheid surfactanten en verbeteren de doorlatendheid van olezuur door de huid. Stabiele polymere micellen van olezuur werden ontwikkeld met Capryol 90 en poloxamer. De polymere micellen van olezuur ontwikkeld in deze studie waren stabiel, dat wil zeggen, ze toonden geen neerslag, fase-scheiding of degradatie bij 40 °C na 3 maanden. De klinische proef toonde aan dat, als hoofdingrediënt, het olezuur in de polymere micel formulering effectief is voor het verlichten van humane rimpels. Op basis van deze bevindingen kan geconcludeerd worden dat olezuur, dat slecht oplosbaar is in water en daardoor onbruikbaar in een native vorm als hoofdingrediënt voor het verlichten van huidrimpels, kan worden geformuleerd in toepasbare polymere micellen. Bovendien wordt verwacht dat de polymere micellen van olezuur ontwikkeld in deze studie zich zullen bewijzen zeer nuttig voor het verlichten van humane rimpels en zullen blijken breed toepasbaar in cosmetische toepassingen.