Emodine-geladen stearinezuur-g-chitosanoligosaccharide nanomicellen: Ontwerp, karakterisering, en antitumoractiviteit

Samenvatting

Het doel van deze studie was om emodine-geladen stearinezuur-g-chitosanoligosaccharide (CSO-SA/EMO) te bereiden en te karakteriseren en de antitumoractiviteit ervan in vitro te evalueren. In deze studie werd stearinezuur-g-chitosanoligosaccharide gebruikt als drager en de fysicochemische eigenschappen ervan werden bepaald door verschillende methoden. Celopnamegedrag werd onderzocht met behulp van FITC-gelabelde stearinezuur-g-chitosanoligosaccharide. CSO-SA/EMO werd bereid met ultrasone en dialyse. Deeltjesgrootte, oppervlaktepotentieel, insluitefficiëntie, en medicijnvrijgevingsgedrag werden in vitro bestudeerd. De effecten van CSO-SA/EMO op maagkankercellen werden onderzocht met MTT-assay en stroomcytometrie. Resultaten toonden aan dat de deeltjesgrootte van CSO-SA/EMO groter was en het potentieel kleiner dan die van stearinezuur-g-chitosanoligosaccharide. De 12-uurs micellaire opname door MGC803 en BGC823 cellen was voldoende, en de micellen konden rijkelijk accumuleren bij letselplaatsen in muizen, dus een goede passieve EPR-targeting bereiken. MTT- en celcyclusarrest-assays toonden aan dat CSO-SA/EMO de antitumoractiviteit significant verhoogde ten opzichte van MGC803 en BGC823 cellen vergeleken met die van vrije emodine. Tumorvolume, hematoxyline-en-eosine-kleuring, en terminale deoxynucleotidyl-transferase dUTP nick-end labeling assay bewijzen dat CSO-SA/EMO een significante antitumor-effect had op tumorweefsels in vivo. Concluderend, leverde de ultrasone-dialyse methode een eenvoudige en effectieve methode voor het bereiden van CSO-SA/EMO. De levering van emodine met een micelsysteem verbeterde de antitumor-effecten ervan effectief.

Inleiding

Emodine (EMO) is een natuurlijke anthrachinoon-derivaat dat voornamelijk geëxtraheerd wordt uit traditionele Chinese kruiden zoals rhabarber, cuspidatum, en multiflorum. Traditionele Chinese geneeskunde (TCM) wordt breed gebruikt in klinisch onderzoek vanwege de lage toxiciteit, weinig bijwerkingen en lage kosten.

Studies hebben aangetoond dat EMO brede farmacologische activiteit heeft, waaronder immuun-onderdrukking, anti-hoest, anti-hypertensief, anti-inflammatoir, antibacterieel, en antikanker activiteiten. EMO is gevonden om de groei van kankercellen te remmen en gerelateerde genen te reguleren om tumorcelapoptose, tumorvorming, celproliferatie, invasie, en metastase te controleren. Studies hebben aangetoond dat EMO diverse kankercellen kan remmen, zoals humane colorectale adenocarcinoomcellen, hepatocarcinoomcellen, lymfoïde leukemiecellen, en humane tongkanker SCC-4. EMO kan de proliferatie van tumorcellen in maag-, borst-, en prostaatkanker remmen. Echter, EMO vertoont geen cytotoxische effecten op normale cellen zoals normale humane gingivale fibroblasten, humane bronchiale epitheelecellen, en humane mammacellen. Dit toont aan dat EMO selectieve cytotoxiciteit vertoont ten opzichte van tumorcellen vergeleken met normale cellen.

Chitosaan, een natuurlijk polysacharide, is de gedesetyleerde vorm van chitine. Dit natuurlijke polymer heeft uitstekende wateroplosbaarheid, bio-functionaliteit, bloedcompatibiliteit, en microbiele afbreekbaarheidskenmerken, en is bekend om zijn diverse biomedische toepassingen. We degradeerden hoog molecuulgewicht chitosaan (450 kDa) met chitosaanase onder zuure omstandigheden om laag molecuulgewicht chitosanoligosaccharide (CSO, 18 kDa) te verkrijgen. CSO kan sterkt celmembranen penetreren en stearinezuur (SA) kan de kern binnen via de glycoproteine-route. CSO werd hydrofob gemodificeerd met SA met behulp van carbodiimide (EDC) als koppelingsmiddel om amfipathische stearinezuur-g-chitosanoligosaccharide (CSO-SA) te synthetiseren.

Hoewel EMO uitgebreide biologische activiteit heeft, is de anthrachinoon-structuur slecht oplosbaar in water. Omdat therapeutische geneesmiddelen getransporteerd worden door de bloedstroom, beïnvloedt hun oplosbaarheid hun absorptie en distributie direct. CSO-SA greften kunnen zich in een waterige oplossing zelf-assembleren tot nanomicellen die hydrofoob zijn binnenin en hydrofiel aan de buitenkant. We dispergeerden de nanomicellen uit de verzamelde toestand met een ultrasone-probe. Omdat zowel EMO als CSO hydrofoob waren, werd EMO geencapsuleerd in het centrum van de micellen.

Verscheidene modelgeneesmiddelen worden toegepast op CSO-SA, wat molecuulgewicht, structuur, en hydrofobiciteit van modelgeneesmiddelen vereist. Bestaande studies omvatten curcumine, doxorubicicine, lamivudine stearaat, en oxaliplatine die de antitumor-effecten significant kunnen verbeteren. We verkenden optimale beladingscondities van CSO-SA/EMO. CSO-SA/EMO creëert nieuwe doseringsvormen met hogere oplosbaarheid en benuttingsefficiëntie. CSO-SA/EMO kan ideeën bieden voor het selecteren van modelgeneesmiddelen of dragers, en klinische toepassing van micellen.

Experimentele Materialen en Methodes

Experimentele Materialen

BALB/C+/nu manlijke naakte muizen werden verkregen van het Zhejiang Universiteit Experimenteel Dierencentrum. Laag-differentiatie maagkankercellijnen MGC803 en BGC823 werden gekocht van de ATCC celbank. RPMI-1640 kweekmedium en FBS werden verkregen van Hangzhou Holly Leaf Biotechnologie Bedrijf. EMO, MTT, FITC, Hoechst 33342, DiR, trinitrobenzeen sulfonzuur, en pyreen werden geleverd door Sigma Aldrich. Zhejiang Universiteit leverde CSO-SA. Overige reagentia gekocht waren van AR-graad.

Bepaling van de CMC en ¹H NMR Spectra van CSO-SA

In dit rapport werd de kritische micelconcentratie (CMC) van CSO-SA bepaald door fluorescentiespectrofotometrie met pyreen als fluorescentieprobe. Verscheidene concentraties CSO-SA oplossing werden toegevoegd aan een pyreen-acetonoplossing waarna de aceton overnacht verdampte. De emissiespectra en piekwaarden van pyreen in CSO-SA oplossingen van verschillende concentraties werden geanalyseerd door fluorescentiespectrofotometrie. De eerste piek (I₁ = 374 nm) en de derde piek (I₃ = 385 nm) van het spectrum werden vastgelegd. We plotteerden de logaritmische concentratie (Log C) als abscis en I₁/I₃ als ordinaten en berekenden de CMC voor de polymere micellen.

CSO en CSO-SA werden opgelost in D₂O bij een concentratie van 10 mg/ml. ¹H NMR spectra werden vastgelegd, vergeleken, en geanalyseerd voor karakteristieke CSO en CSO-SA pieken.

Detectie van Aminesubstitutiegraad

De aminesubstitutiegraad (SD%) werd gedetecteerd met behulp van de trinitrobenzeen zwavelzuur (TNBS) methode.

Verschillende concentraties CSO en CSO-SA oplossingen werden bereid waarna 4% NaHCO₃ en 0,1% TNBS successief werden toegevoegd. Na incubatie bij 37 °C gedurende 2 uur in een waterbad, werd 2 mol/L zoutzuur toegevoegd. Absorbantie werd gemeten bij 344 nm door ultraviolet-zichtbare spectrophotometrie na 30 min ultrasone. Een standaardcurve werd getekend en de SD% van CSO-SA monster werd berekend.

CSO-SA Deeltjesgrootte en Potentieel

Een 1,0 mg/ml CSO-SA oplossing werd bereid en micellen volledig gedispergeerd met een ultrasone celverstorer-probe. De deeltjesgrootte en potentieel van CSO-SA werden bepaald met deeltjesgrootte- en oppervlaktepotentieel-analysator.

Celopname van CSO-SA

FITC en CSO-SA oplossingen werden gemengd, overnacht gerold, en overgebracht naar een dialysezak. On-gereageerde FITC en absolute ethanol werden verwijderd door dialyse met gedemineraliseerd water voor 24 uur. Ten slotte werd FITC-gelabelde CSO-SA (FITC-CSO-SA) oplossing met een concentratie van 1,0 mg/ml verkregen.

MGC803 en BGC823 cellen werden gebruikt als doelcellen om celopname van CSO-SA te onderzoeken. Gebaseerd op celproliferatiesnelheid, werden cellen gezaaid in 24-put platen en overnacht gekweekt tot ze volledig gehecht waren. Tachtig μl FITC-CSO-SA oplossing werd dan toegevoegd op een ingesteld tijdstip. Cellen werden geïncubeerd met 10 μl Hoechst 33342 (1 mg/ml) voor 15 min om celkern te kleuren. Opname van CSO-SA door FITC-CSO-SA werd gedetecteerd door laserscanning confocal microscopie.

In Vivo Distributie van CSO-SA

De distributie van CSO-SA in vivo werd bepaald door DiR fluorescentiekleuring. CSO-SA/DiR oplossing werd bereid door dialyse.

Zes-weken-oude manlijke naakte muizen werden gebruikt als experimenteel model. Naakte muizen werden subcutaan geïnculeerd met 1 × 10⁸/ml MGC803 cellen. CSO-SA/DiR werd toegediend via de staartvliet bij een tumorcelvolume van ongeveer 200 mm³. De muizen werden vervolgens geanesthetiseerd op ingestelde tijdstippen. Getijde distributie van CSO-SA/DiR in vivo werd vastgelegd met behulp van een klein-dier live-body imager (golfengtebereik, 580-700 nm, bloottijd 1000 ms).

Detectie van EMO Concentratie door HPLC

EMO concentratie werd bepaald door HPLC. EMO werd toegepast op een Eclipse XDB-C18 gepakte kolom (4,6 × 250 mm, 5 μm) met een beschermingskolom (4,6 × 10 mm, 5 μm). Kolomtemperatuur was ingesteld op 30 °C, stroomsnelheid was 1,0 ml/min, detectiegolflengte was 254 nm, en injectievolume was 20 μl. De mobiele fase was methanol/0,1% fosforzuur (85:15, v/v). EMO concentratie werd geplottet als abscis en de piekoppervlakte als ordinaten. Standaardcurven van EMO werden getekend om het optimale lineaire bereik te bepalen. Alle HPLC-geïnjecteerde monsters werden gefilterd door een 0,45-μm organisch filter om de kolom te beschermen.

Bereiding van CSO-SA/EMO

In deze studie werd EMO geencapsuleerd met een ultrasone-probe. Een initiële formulatieverhouding van 10% (EMO: CSO-SA, w/w) werd gebruikt als startpunt. De EMO-oplossing werd langzaam in een druppelgewijze manier toegevoegd aan de micellaire oplossing in een ijskast. De ultrasone-probe werd vervolgens toegepast voor 20 cycli (400 W, werk 2 s, stop 3 s).

De medicijn-geladen micellen werden overgebracht naar een dialysezak (MWCO, 3,5 kDa) en gedialyseerd tegen gedemineraliseerd water voor 24 uur om ethanol uit het oplosmiddel te verwijderen. Zuivere CSO-SA/EMO werd verkregen door centrifugatie van het dialysaat om vrije EMO te verwijderen.

Eigenschappen van CSO-SA/EMO (Deeltjesdiameter Potentieel, TEM, EE%)

De deeltjesgrootte en oppervlaktepotentieel van CSO-SA/EMO werden gemeten met deeltjesgrootte- en oppervlaktepotentieel-analysator.

Een 0,1 mg/ml CSO-SA/EMO oplossing werd druppelgewijs toegevoegd op een koolstoffilm bedekte koperdraad, gekleurd met 2% fosfortungstenzuur en gedroogd. De morfologie en deeltjesgrootte van CSO-SA/EMO werden waargenomen door transmissie-elektronenmicroscopie.

Insluitefficiëntie (EE%) en medicijnlading (DL%) van CSO-SA/EMO werden gedetecteerd door organisch oplosmiddel extractie en HPLC. Aan een 200 μl monster van CSO-SA/EMO micellaire oplossing, werd 1,8 ml methanol toegevoegd om de micellen te disperseren en het medicijn te extraheren. De EMO-concentratie werd gemeten als C_EMO. Een andere 400 μl CSO-SA/EMO micellaire oplossing werd in een ultrafiltratie-centrifugebuisje geplaatst en gecentrifugeerd (12.000 toer/min, 5 min) om het supernataant te verkrijgen. De EE% en DL% werden berekend volgens de volgende formules: EE% = (10 × C_EMO − C) × V / M_EMO × 100%, DL% = (10 × C_EMO − C) × V / [(10 × C_EMO − C) × V + M_CSO-SA] × 100%, waar C_EMO de concentratie van EMO in micellen is, C de EMO-concentratie van de medicijn-geladen micellen na ultrafiltratie-centrifugatie, V het volume van medicijn-geladen micel onderwerp aan dialyse, M_EMO de hoeveelheid EMO toegediend tijdens medicijnlading, M_CSO-SA de massa van CSO-SA.

Evaluatie van Medicijnvrijgiving In Vitro

Medicijnvrijgiving van CSO-SA/EMO werd onderzocht met behulp van PBS (pH 7,2) als vrijgivingsmedium. Een milliliter medicijn-geladen miceloplossing werd in een 3,5 kDa dialysezak geplaatst, verzegeld aan beide uiteinden, en vervolgens in een geschikt vrijgivingsmedium-bevattende buis geplaatst. De dialysezak werd in een 37 °C horizontale thermostaat-schuddere geplaatst. Monsters werden genomen op ingestelde tijdstippen en vervangen met hetzelfde volume van vers vrijgivingsmedium. De inhoud van EMO in de monsters werd bepaald door HPLC en de cumulatieve hoeveelheid EMO vrijgegeven werd berekend.

Cytotoxiciteit van CSO-SA/EMO

De overlevingspercentages van maagkankercellen behandeld met CSO-SA/EMO, CSO-SA, en EMO werden gedetecteerd door MTT-assay. Cellen werden gezaaid in 96-put platen bij een concentratie van ongeveer 10⁵/ml. CSO-SA/EMO, CSO-SA, en EMO werden toegevoegd bij verschillende concentraties. Na incubatie voor verschillende tijdsperioden, werd 20 μl MTT-werklopende oplossing toegevoegd. Na 4 uur incubatie, werd 200 μl DMSO toegevoegd en de optische dichtheid (OD) van de oplossing bij 570 nm werd gemeten door microplaat-lezer.

Effect van CSO-SA/EMO op de Celcyclus

Cellen van de twee cellijnen werden gezaaid in een 6-put plaat bij een dichtheid van 10⁵/ml. Na 12 uur kweek, werden CSO-SA, CSO-SA/EMO, en EMO toegevoegd en geïncubeerd voor 24 uur. De cellen werden vervolgens verteerd, verzameld, en gewassen. Een 500 μl PI-kleurstofoplossing werd dan aan elk celmonster toegevoegd, het celpellet werd langzaam heropgelost, en de cellen werden geïncubeerd in het donker bij 37 °C voor 30 min. Rode fluorescentie werd gedetecteerd door stroomcytometer bij een excitatiegolflengte van 488 nm. DNA-inhoud werd geanalyseerd door de FlowJo-software.

Antitumor-effecten van CSO-SA/EMO Geëvalueerd door In Vivo en Histologische Analyses

Dierproeven werden uitgevoerd volgens de Richtlijnen voor Dierenzorg en Gebruik Commissie, Zhejiang Universiteit. MGC803 cellen (1 × 10⁶) werden subcutaan geïnjecteerd in de rechter voorste flank van manlijke naakte muizen van 5 tot 6 weken oud. Tumorenden werden toegestaan te groeien tot een diameter van ongeveer 5 mm. Op dat moment werden de muizen willekeurig verdeeld in een controle-groep, een EMO-injectie-groep en een CSO-SA/EMO-injectie-groep, met 3 dieren in elke groep. Alle muizen werden intraveneuze geïnjecteerd met de relevante reagentia via de staartvliet eenmaal per dag gedurende 2 weken. Een elektronische schuifmaat werd gebruikt om de lange (a) en korte (b) diameters van de tumor (b) te meten. Het tumorvolume werd berekend volgens de formule V = a × b²/2. Het lichaamsgewicht van elke muis werd vastgelegd waarna de tumoren verzameld werden voor histologische analyse. Tumorremmingsratio werd bepaald in de tumorweefsels na hematoxyline-en-eosine (HE) kleuring. Terminale deoxynucleotidyl-transferase dUTP nick-end labeling (TUNEL) werd uitgevoerd om cellulaire apoptose in terminale ileum-weefsel te detecteren met behulp van een in situ celdood-detectiekit volgens de instructies van de fabrikant.

Resultaten en Discussie

CMC en ¹H NMR Spectra van CSO-SA

Amfiphiele polymeren zelf-assembleerden tot micellen in hydrofiel medium. Lagere CMC resulteerde in grotere micelvorming. Dit was gunstig voor het handhaven van micelstructuur na intraveneuze toediening. Toen CSO-SA micellen vormde, kon de pyreen-fluorescentieprobe gemakkelijk het hydrofoobe kern van de micellen binnengaan wat de fluorescentie-intensiteit van het geladen pyreen verhoogde wat de intensiteit van het emissiespectrum verhoogde. Op dit moment, nam I₃ significant sneller toe dan I₁, dus nam de I₁/I₃ fluorescentie-intensiteitsverhouding abrupt af. Een significante breukpunt kon waargenomen worden in de I₁/I₃ plot en Log C waarden (Fig. 1). Inflectiepunt-berekeningen toonden aan dat CMC 179,02 μg/ml was. Hoe kleiner de CMC, hoe sterker de vermogen om micellen te vormen en hoe sterker de weerstand tegen verdunning wat de micelstructuurbescherming na intraveneuze toediening verbeterde.

EDC werd gebruikt als een kruis-koppelingsmiddel om te reageren met de carboxylgroep van SA en de actieve intermediaire -OO-acyl-isourea-derivaat te vormen. Dit kan reageren met de primaire aminegroep van CSO om een amide-binding te vormen. De structuur van CSO-SA werd bepaald en bevestigd op basis van het kernmagnetische-resonantie-proton-spectrum. ¹H NMR (400 MHZ, D₂O) δ 1,06 (m, CH₂), 1,02 (m, CH₃) corresponderen respectievelijk met het methylene-proton en methyl-proton van SA.

Substitutiegraad van Aminogroep

De SD% van CSO-SA is het percentage stearinezuur-gesubstitueerde aminogroepen op chitosaan. TNBS reageerde met vrije aminogroepen op chitosaan en vormde trinitrobenzeen-derivaten met een UV-absorptie bij 344 nm. De standaardcurve van het trinitrobenzeen-derivaat van chitosaan werd bepaald door UV-absorptie bij 344 nm. De SD% van CSO-SA werd berekend op 9,3 ± 8%. Dit bevestigde dat CSO en SA met succes gekoppeld waren gebaseerd op hun greftverhouding.

CSO-SA, CSO-SA/EMO Deeltjesgrootte en Potentieel

Tabel 1 toont dat de Z-gemiddelde van CSO-SA 139,3 ± 2,2 nm was. PDI was 0,179 ± 0,03 wat een relatief uniforme dispersie aangeeft. Vergeleken met CSO-SA, namen de Z-gemiddelde en PDI van CSO-SA/EMO toe. Na het laden van EMO, was het oppervlaktepositieve lading van CSO-SA/EMO hoger dan die van CSO-SA.

Celopname

FITC beïnvloedde de fysicochemische eigenschappen van CSO-SA niet. We verkreg FITC-CSO-SA door fluoresceïne FITC in CSO-SA te greften. Na de cellen gekleurd waren met Hoechst 33342, werd de opname van FITC-CSO-SA cellen waargenomen met behulp van confocale laserscanning microscopie. We vonden dat de opname van MGC803 geleidelijk toename met toenemende tijd en FITC-fluorescentie geleidelijk toename. De micellaire opname van BGC823 was vergelijkbaar met MGC803 op een tijds-afhankelijke manier. FITC-CSO-SA had goede celpenetratievermogen en werd gelijkmatig verdeeld in het cytoplasma van maagkankercellen (Fig. 2).

Distributie van CSO-SA In Vivo

Bijna-infrarood (NIR) imaging-technologie is voordelig voor het penetreren van biomaterialen en weefsels. Na CSO-SA/DiR was geïnjecteerd in de staartvliet van naakte muizen, werd de distributie van CSO-SA/DiR waargenomen en vastgelegd op verschillende tijden met behulp van een klein-dier levend-lichaam imager. Zoals getoond in Fig. 3, was de distributie van CSO-SA/DiR vergelijkbaar met andere micellen na 4 uur na staartvliet-injectie en hoofdzakelijk verdeeld in de lever, milt, en tumorweefsels. De distributie van nanomicellen in tumor nam geleidelijk toe in intensiteit met toenemende tijd. Dit duidde erop dat CSO-SA greft een goede passieve targetingsvermogen had, hoofdzakelijk door het EPR-effect van nanomicellen (Fig. 3).

Bereiding van CSO-SA/EMO

De Invloed van Verschillende pH Omgevingen op Medicijnlading

We bereidden een CSO-SA oplossing en pasten de pH van de CSO-SA aan om het effect van pH op medicijnlading te onderzoeken. Zoals getoond in Fig. 4, had CSO-SA een goede medicijnladingscapaciteit en vertoonde een parabolische trend in het pH 6,4-6,8 bereik. Het hoogste niveau van medicijnlading werd gezien bij pH 6,6, wat deze waarde de optimale pH voor medicijnlading maakt (Fig. 4).

Insluitefficiëntie, TEM, en Medicijnlading

CSO-SA zelf-assembleert tot schil-kern nanocomposiet micellen. De hydrofobe moiety's vormen spontaan hydrofoobe kernstructuren om het hydrofiele medium af te stoten. Deze structuur biedt een sleutelvoertuig voor medicijnlading omdat EMO gemakkelijk geencapsuleerd kan worden in de hydrofoobe kern door zijn hydrofoobe structuur. We onderzochten het effect van CSO-SA op de ladingscapaciteit van EMO door de dosering van EMO te variëren. Zoals getoond in Fig. 5, met toenemende EMO-dosering, nam de hoeveelheid medicijnlading toe. De ladingsratio van CSO-SA bereikte zo hoog als 21,16% toen de verhouding 30% was (Fig. 5).

CSO-SA/EMO werd 30.000 keer vergroot met een transmissie-elektronenmicroscoop. Nanomicellen vorm en grootte werden waargenomen en vastgelegd.

EMO Vrijgiving van CSO-SA/EMO

De medicijn-geladen miceloplossing werd toegevoegd aan een 3,5 kDa dialysezak met PBS (pH 7,2) als vrijgivingsmedium. Elke keer dat een monster werd verwijderd, werd het vervangen met hetzelfde volume van vers vrijgivingsmedium.

De concentratie van EMO op verschillende tijdstippen werd bepaald door HPLC, waarna het cumulatieve vrijgiftingspercentage werd berekend. Zoals getoond in Fig. 6, vertoonde CSO-SA/EMO een significante sustained-release effect vergeleken met vrije EMO. Deze resultaten tonen aan dat het vrijgiftingspercentage van vrije EMO 38,4% was bij 0,5 uur terwijl het vrijgiftingspercentage van EMO uit CSO-SA/EMO ongeveer 6,6% was. Bij 4 uur was het vrijgiftingspercentage van vrije EMO 83,7% en het vrijgiftingspercentage van CSO-SA/EMO was ongeveer 32,5%. Binnen 72 uur bereikte de vrijgiving van vrije EMO 97,2% terwijl de vrijgiving van EMO uit CSO-SA/EMO 78,4% was. EMO werd vrijgegeven uit CSO-SA/EMO medicijn-geladen micellen op twee hoofdmanieren: door EMO-dissociatie van de micellaire kern en door penetratie van de micelkern in het vrijgivingsmedium.

Toxiciteit van CSO-SA/EMO voor Maagkankercellen

De MTT-assay is een standaardmethode voor het detecteren van cellevensvatbaarheid. De cytotoxiciteit van vrije EMO, CSO-SA, en CSO-SA/EMO voor MGC803 en BGC823 maagkankercellen werd gemeten met behulp van de MTT-assay. Het toonde aan dat EMO en CSO-SA/EMO MGC803 en BGC823 cellen konden remmen op een dosis- en tijdsafhankelijke manier. Echter, bij dezelfde concentratie, had CSO-SA/EMO een hogere remmende werking op MGC803 en BGC823 cellen vergeleken met de vrije EMO-oplossing. De IC₅₀-waarden (Tabel 2) van EMO en CSO-SA/EMO voor maagkankercellen werden berekend. De IC₅₀ van CSO-SA/EMO was significant lager dan die van EMO op elk tijdstip (24 uur, 48 uur, 72 uur). De IC₅₀-waarden van CSO-SA toonden aan dat CSO-SA een veilige biologische drager was met weinig biologische toxiciteit wat bevestigde dat de cytotoxiciteit van CSO-SA/EMO veroorzaakt werd door EMO (Fig. 7).

Tabel 2 en Fig. 7 toonden aan dat de cytotoxiciteit van CSO-SA/EMO medicijnleveringssysteem significant hoger was dan die van vrije EMO. Echter, toen de vrijgiving van CSO-SA/EMO en vrije EMO in een in vivo omgeving gesimuleerd werd, bereikte de vrijgiving van vrije EMO 38,4% bij 0,5 uur terwijl de vrijgiving van CSO-SA/EMO slechts 6,6% was. Over het algemeen was de concentratie van vrije EMO hoger dan die van CSO-SA/EMO op elk tijdstip.

Dit fenomeen is gemakkelijk te verklaren. Hoewel CSO-SA/EMO EMO relatief langzaam vrijgaf, vertraagt of daalt het antitumor-effect van CSO-SA/EMO niet. Veel studies hebben aangetoond dat nanomedicijn-leveringssystemen de antitumor-activiteit van chemotherapeutische geneesmiddelen kunnen verbeteren.

Allereerst, hoewel vrije EMO een initiële uitbarsting van activiteit vertoont, kan EMO niet efficiënt worden opgenomen door de cellen terwijl CSO-SA de celopname aanzienlijk versnelde door endocytose of fagocytose.

Tweedens, wanneer CSO-SA/EMO dicht bij celmembranen komt, kan de interactie tussen nanopartikels en celmembranen de structuur en eigenschappen van nanomicellen alsmede de functie van biologische macromoleculen zoals ionenkanalen beïnvloeden. Daarom resulteert de heching van CSO-SA/EMO aan de celmembranen niet in een eenvoudige fysische adsorptie, maar kan de dynamische balans van de cel veranderen en daarmee de cytotoxiciteit van CSO-SA/EMO verder bevorderen.

Ten slotte, heeft vrije EMO een hydrofoob anthrachinoon-structuur wat resulteert in slechte distributie in bloed. Het CSO-SA/EMO medicijnleveringssysteem verhoogt de oplosbaarheid van EMO en verbetert de oplossing wat leidt tot een hogere moleculaire concentratie in omringende cellen.

Detectie van Celcyclusarrest door FCM

Celcyclusanalyse is een belangrijk aspect van de klinische behandeling van maligne tumoren. Toepassing van cyclus-specifieke geneesmiddelen op tumorcellen tijdens geneesmiddel-gevoelige periodes is aangetoond om grote effectiviteit te hebben. Hoewel ethidiumbromide-analogen geen normale cellen kunnen penetreren, kunnen ze celkernen kleuren door beschadigde celmembranen te penetreren. PI-ingebedde dubbele-streng DNA produceert rode fluorescentie en de fluorescentie-intensiteit is evenredig aan het niveau van dubbele-streng DNA. DNA-inhoud werd bepaald door stroomcytometrie (FCM) na DNA-kleuring met PI. Celcyclusdistributie en apoptose werden geanalyseerd op basis van DNA-inhoudsdistributie.

Studies hebben aangetoond dat EMO de celcyclusdistributie beïnvloedt. FCM-analyse toonde aan dat CSO-SA/EMO en EMO MGC803 en BGC823 cellen konden blokkeren in de G2/M-fase van de celcyclus.

MGC803 cellen werden blootgesteld aan dezelfde concentratie (20 μM) van CSO-SA, vrije EMO en CSO-SA/EMO oplossing voor 24 uur. Het percentage MGC803 cellen in G2/M-fase werd respectievelijk 8,95%, 15,29%, en 23,12% gevonden. Controle-groep percentage was 6,47%. De percentages van BGC823 cellen in G2/M behandeld met 20 μM CSO-SA, vrije EMO, of CSO-SA/EMO onder dezelfde omstandigheden waren respectievelijk 14,25%, 16,79%, en 35,71% wat hogere waarden waren dan in de controle-groep (13,66%). Deze gegevens toonden aan dat CSO-SA/EMO de G2/M-fase van MGC803 en BGC823 cellen efficiënter en significanter blokkeerde dan vrije EMO bij dezelfde concentratie. De CSO-SA toonde geen verschil met de controles (Fig. 8).

Antitumor-effect van CSO-SA/EMO In Vivo

Om het antitumor-effect van CSO-SA/EMO verder te bestuderen, werden de tumorinhibitieratio en cellulaire apoptose-niveaus in vivo geëvalueerd. De resultaten toonden aan dat zowel CSO-SA/EMO als EMO een opmerkelijke remmende werking hadden op tumorgroei (Fig. 9a). De tumorinhibitieratio van de CSO-SA/EMO-groep was drie keer die van de EMO-groep (Fig. 9d). Het gewicht van muizen in elke groep veranderde niet significant (Fig. 9b). Dit toonde aan dat zowel CSO-SA/EMO als EMO relatief veilig waren. Morfologische veranderingen en apoptose in tumorweefsels van elke groep toonden aan dat CSO-SA/EMO significante antitumor-effecten had (Fig. 9e, f).

Conclusies

In deze studie detecteerden we structuur, CMC, SD%, deeltjesgrootte, en potentieel van CSO-SA met verschillende methoden. Resultaten bewijzen dat amfiphiele CSO-SA goed presteerde als drager. Fluorescentie-intensiteit van maagkankercellen toonde aan dat CSO-SA snel was opgenomen binnen 12 uur. Naakte muizen werden gebruikt als model om de distributie van CSO-SA binnen 72 uur te bestuderen. In de loop van de tijd werd de CSO-SA-distributie in letsel meer geconcentreerd, wat een goed passieve targetingeffect vertoonde.

CSO-SA/EMO werd bereid met ultrasone-dialyse methode. CSO-SA had sterke medicijnladingscapaciteit. Wanneer omgevings-pH was ingesteld op 6,6, bereikte het niveau van medicijnlading 21,6% bij een 30% formulatieverhouding. Vergeleken met CSO-SA, had CSO-SA/EMO grotere deeltjesgrootte en zeta-potentieel. De vorm van CSO-SA/EMO kon direct worden vastgelegd met TEM. De vrijgiving van EMO uit CSO-SA/EMO was 78,4% binnen 72 uur, wat een gladde en continue procedure in het lichaam aangeeft. Overwegend het antitumor-effect van CSO-SA/EMO vergeleken met vrije EMO, bevestigden we dit met verscheidene experimenten.

CSO-SA toxiciteit voor maagkankercellen werd gedetecteerd door MTT-assay. De resultaten toonden aan dat CSO-SA een veilige biologische drager was. Vergeleken met die van vrije EMO, verhoogde CSO-SA/EMO de antitumoractiviteit tegen maagkankercellen significant. MGC803 en BGC823 celcyclus kon effectiever in de G2/M-fase worden gearresteerd door CSO-SA/EMO. Tumorvolume, HE-kleuring, en TUNEL-assay bewijzen meer significante antitumor-effect van CSO-SA/EMO dan vrije EMO.

Gebaseerd op bovenstaande resultaten, is CSO-SA zowel biocompatibel als veilige drager. CSO-SA/EMO in deze studie gebruikt een nieuwe en effectieve doseringsformulering voor de behandeling van kanker en vertoont een goed passieve targetingeffect in vivo.

Beschikbaarheid van Data en Materialen

Alle data gegenereerd of geanalyseerd tijdens deze studie zijn opgenomen in dit gepubliceerde artikel.

Afkortingen

CSO-SA:

Chitosanoligosaccharide-stearinezuur

EMO:

Emodine

FITC:

Fluoresceïne-isothiocyaan

MTT:

Thiazolyl-blauw-tetrazolium-bromide

TEM:

Transmissie-elektronenmicroscoop

¹H NMR:

Proton-kernmagnetische-resonantie

EPR:

Verhoogde permeabiliteit en retentie

TCM:

Traditionele Chinese geneeskunde

CMC:

Kritische micelconcentratie

Log C:

Logaritme van concentratie