Gerichte Ultrasound Imaging & Therapie van Ovarium Tumoreren met pH-Gevoelige Perfluorpentaan Proteïne Nanodeeltjes

Samenvatting

In deze studie hebben we een multifunctioneel ultrasound (US) therapeutisch middel ontwikkeld dat perfluorpentaan (PFP) inketelt in ferritine (FRT) en het tumor-gerichte molecuul foliumzuur (FA) conjugateert (FA-FRT-PFP). De bereide FA-FRT-PFP had een gemiddelde deeltjesdiameter van 42,8 ± 2,5 nm, een zeta-potentiaal van −41,1 ± 1,7 mV en toont goede stabiliteit in fysiologische oplossing en temperaturen. FRT is een pH-gevoelig kooieiwit dat, bij pH 5,0, ontbindt om poriën te vormen die PFP kunnen laden. De aanpassing naar neutraal pH sluit de poriën en inkapselt de PFP binnen de FRT om nanodeeltjes te vormen. Bij pH 5,0 versterkte 3 min lage-intensiteit gefocuste ultrasound (LIFU, 2 W/cm²) het US signaal van FA-FRT-PFP significant door het akoestische druppel verdamping (ADV) effect. Onder identieke omstandigheden veroorzaakte 4 min LIFU bestraling dat de bellen gegenereerd door FA-FRT-PFP braken. FA-FRT-PFP kon efficiënt gericht worden in ovarium kankercellen en versterkte het US contrast van FA-FRT-PFP significant na 3 min LIFU bestraling. Na 4 min LIFU bestraling, daalde de celviabiliteit significant door necrose, waarschijnlijk door de FA-FRT-PFP gemedieerde vrijgave van PFP in de zuur omgeving van lysosomen na binnengaan in de tumorcellen. PFP wordt dan getransformeerd in bellen die barsten onder LIFU bestraling, vormende fysieke schokgolven die leiden tot de vernietiging van de celstructuur en necrose, wat tumorbehandeling bereikt. Samen genomen toont dit aan dat FA-FRT-PFP zowel een nieuwe als veelbelovende US theranostica middel is voor toekomstige klinische toepassing.

Inleiding

Ovariumkanker is een van de dodelijkste vrouwelijke kankers wereldwijd [1,2,3]. De behandeling van ovariumkanker blijft klinisch afhankelijk van stralingstherapie, chemotherapie, chirurgie, en andere aanverwante therapieën [4,5,6]. Echter, tekortkomingen in deze strategieën blijven verbeteringen in de overlevingskansen van patiënten belemmeren. Om deze tekortkomingen te overwinnen, zijn meer effectieve en veiligere diagnostische methoden vereist. In recente jaren is de integratie van imaging en therapeutica in een enkel behandelplatform uitgegroeid tot een hot topic [7,8,9].

Ultrasound (US) technologie, vanwege zijn non-invasieve, non-stralende, lage kosten, en specifieke kenmerken, wordt breed gebruikt in klinische diagnose en tumorbehandelingen [10,11,12]. In recente decennia is een akoestisch respons platform (ARP) met US imaging en therapeutische mogelijkheden ontwikkeld voor effectieve tumor diagnose en behandeling [13,14,15,16]. ARP omvat voornamelijk microbellen of nanobellen (MB of NB) en nanopartikelen (NP) gebaseerde platforms [16, 17]. Onder deze ARPs tonen MB of NB goede akoestische respons mogelijkheden, maar door hun grote grootte is in vivo weefselpenetratie zwak en monsterstabiliteit slecht. NP toont sterkere weefselpermeabiliteit en een langere farmacokinetische cyclus door zijn kleine grootte. Echter, de akoestische respons mogelijkheden van NPs zijn beperkt. Het is daarom dringend om ARPs te ontwerpen van kleine grootte, met hoge stabiliteit en sterke responsiviteit.

Vloeibare fluorocarbonen ondergaan vloeistof-fase gas-fase overgang in reactie op externe stimulatie [18, 19]. Natalya en collega's ontwikkelden een nano-emulsie met vloeibare fluorocarbonen die akoestische druppel verdamping (ADV) effecten produceerden onder lage-intensiteit gefocuste ultrasound (LIFU) [20,21,22]. De emulsies vormden bellen en triggerten gelijktijdig medicijnvrijgave, waardoor tumorbehandeling mogelijk werd. Echter, een laag van afdichtingsmateriaal om de vloeibare fluorocarbonen leidde tot een toename in de intensiteit en tijd van de ultrasound vereist voor tumorbehandeling, wat resulteerde in schade aan het omringende gezonde weefsel. Verdere optimalisatie van de vloeibare fluorocarbonen drager is daarom vereist.

In deze studie hebben we een ferritine (FRT) nanopartikel geladen met vloeibare fluorocarbonen perfluorpentaan (PFP) ontwikkeld, wat verder gecombineerd werd met het tumor-doelwit molecuul foliumzuur (FA) om FA-FRT-PFP te vormen. Ferritine is een hoog biocompatibel endogeen kooieiwit dat pH-gevoeligheid vertoont [23,24,25]. Het eiwit kan ontbinden in een zuur milieu en kan herassembleren in een alkalisch milieu. Dit stelt de gecontroleerde lading en vrijgave van ferritine in reactie op pH-veranderingen toe [26,27,28]. PFP is een frequent gebruikte fase-transformatie materiaal dat een kooktemperatuur van 29 °C vertoont. De lage kooktemperatuur vergemakkelijkte de eenvoudige fase-transformatie door LIFU wat veiliger was dan HIFU. De PFP werd geladen in ferritine en de resulterende FA-FRT-PFP had een diameter van ~ 47,3 ± 2,8 nm met hoge stabiliteit in fysiologische oplossingen en temperaturen. Volgens de resultaten had FA-FRT-PFP de volgende voordelen: (1) PFP kon eenvoudig in FRT geladen worden door de pH te veranderen van zuur naar neutraal; (2) onder lage-intensiteit gefocuste ultrasound (LIFU, 2 W/cm², 3 min) en pH = 5,0, geeft FA-FRT-PFP PFP vrij en ondergaat faseveranderingen om US imaging signalen te versterken door akoestische druppel verdamping (ADV); 3) Onder langdurige LIFU bestraling (4 min) en pH = 5,0, explodeerde de PFP vrijgegeven van FA-FRT-PFP en produceerde een fysieke schokgolf die effectief tumorcellen kon vernietigen door necrose. Onze kennis naar is dit het eerste voorbeeld van PFP laden in FRT als tumor US theranostica. Deze resultaten wijzen erop dat FA-FRT-PFP + LIFU een nieuwe strategie is voor geïntegreerde tumor diagnose en behandeling.

Materialen en Methodes

Materialen

Agarose gel, ferritine (FRT), foliumzuur (FA), en perfluorpentaan (C₃F₈, PFP) werden gekocht van Sigma (St. Louis, MO, VS). NH₂-PEG₂₀₀₀-FA en NH₂-PEG₂₀₀₀-COOH werden geleverd door Xi'an Ruixi Biotechnology Co., Ltd. (China). 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) en N-hydroxysuccinimide (NHS) werden gekocht van Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, VS). Cel teller kit-8 (CCK-8) werden verkregen van Dojindo Laboratories (Kumamoto, Japan). Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM), fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS), penicilline-streptomycine, trypsin-EDTA, en foetaal kalfserum (FBS) werden gekocht van Gibco (Grand Island, NY, VS).

Celcultuur

Humane ovarium kankercel lijn SK-OV-3 werd verstrekt door het Shanghai Institute of Cell Biology, Chinese Academy of Sciences. Normale ovarium epitheelcellen HUM-CELL-0088 werden verkregen van PriCells, Wuhan, China. De cellen werden gekweekt in DMEM media met 10% foetaal kalfserum en 1% penicilline-streptomycine oplossing. De cellen werden onderhouden in een broeikast met een vervoigtte atmosfeer met 5% CO₂ bij 37 °C.

Bereiding van FA-FRT-PFP

Eerst werd doelwit molecuul FA geconjugeerd met FRT door de esterificatie reactie [29]. Kortom, NH₂-PEG₂₀₀₀-FA (10 mg) en FRT oplossing werden gemengd in de aanwezigheid van EDC (5 mg/mL) en NHS (20 mg/mL). Na 3 uur reactie bij kamertemperatuur met lichte roering, werd het mengsel gezuiverd door dialyse tegen gedestilleerd water (MW afsnij = 1,2 kDa) gedurende 24 uur. De resulterende oplossing was FA-FRT nanodeeltjes. Ten tweede werd de lading van PFP in de caviteit van FRT bereid met het proces van denaturering en hernaturering van eiwit [30]. Kortom, FA-FRT werd vervaagd in 5 mL PBS om 2 mg/mL te zijn en aangepast tot pH = 5,0 met 30 min lichte roering bij kamertemperatuur om volledige dissociatie van de FRT te waarborgen. Daarna werd 500 μl PFP toegevoegd aan de oplossing in een ijsbad en werd onderworpen aan puls sonicatie met 5 s aan en 5 s pauze voor een totaal van 5 min bij 80 W in ijsbad. Na de sonicatie werd de pH-waarde van het mengsel aangepast naar neutraal (pH = 7,4). Aangezien PFP olie staat was en onoplosbaar in water, werd de overmatige PFP eenvoudig verwijderd door vloeistofscheiding om FA-FRT-PFP te zijn. FRT-PFP werd bereid met een vergelijkbare methode behalve het veranderen van NH₂-PEG₂₀₀₀-FA in NH₂-PEG₂₀₀₀-COOH.

Karakterisering van FA-FRT-PFP

De groottes en zeta-potentialen van de nanodeeltjes werden getest door een Zeta Sizer (Malvern, NanoZS, UK). De morfologie van FA-FRT-PFP werd waargenomen door transmissie elektronenmicroscopie (TEM, Hitachi, Japan) en geïnverteerde fluorescentiemicroscopie (Olympus, Japan). De chemische structuur van de nanodeeltjes werd gedetecteerd door een Fourier transform infrarood spectroscopie (Bruker Tensor 27, Bruker Optik, Ettlingen, Duitsland). De cellulaire opname van de FA-FRT-PFP werd gedetecteerd door confocale laserscanning microscopie (LEXT OLS4100, Olympus, Japan). De FITC/PI dubbele-kleuring cellen werden geanalyseerd door stroomcytometrie (BD, Franklin Lakes, NJ, VS).

De Prestaties van pH en Ultrasound Responsieve Gas-Generatie

FA-FRT-PFP in pH = 5,0 en 7,5 conditie werden bestraald met verschillende akoestische intensiteit van LIFU (1,5 en 2,0 W/cm²) en voor verschillende totale tijd (1, 2, 3, en 4 min) in het agarose gel model, toen US afbeeldingen werden waargenomen door US apparatuur (Esaote Mylab 90, Italië) met frequentie van 5–12 MHz en mechanische index (MI) van 0,06. Daarna werd de verschijning van FA-FRT-PFP waargenomen door lichtmicroscopie in de tijd. De US intensiteit van het interessegebied in US afbeelding werd geanalyseerd door ImageJ software.

Cellulaire Opname

Kortom, 1 mg FITC werd opgelost in 1 mL DMSO en daarna gemengd met FRT-PFP en FA-FRT-PFP voor 30 min met zachte roering. Vervolgens werd de gemengde oplossing overnacht gedialyseerd in gedemineraliseerd water om vrije FITC en DMSO te verwijderen om FITC-gelabelde nanodeeltjes te verkrijgen. Vervolgens werden SK-OV-3 en normale ovarium cellen (HUM-CELL-0088) gekweekt in het medium voor 24 uur, en daarna werden vrije FITC, FITC-gelabelde FRT-PFP en FA-FRT-PFP geco-incubeerd met SK-OV-3 cellen voor 5 uur. Daarnaast werd FITC-gelabelde FA-FRT-PFP geïncubeerd met FA-vooraf behandelde SK-OV-3 cellen voor 5 uur. De cellen werden 3 keer gewassen met PBS en gefixeerd met 4% paraformaldehyde en gekleurd met 0,2 mg/mL DAPI oplossing voor 10 min. Cellen werden gebeeld door confocale laserscanning microscopie om fluorescente afbeeldingen vast te leggen. Het fluorescente signaal werd gekwantificeerd door een stroomcytometer.

Ultrasound Imaging In Vitro

SK-OV-3 cellen werden 24 uur gekweekt in FA-vrij medium, en daarna werden PBS, FRT-PFP en FA-FRT-PFP, en FA-FRT-PFP + FA geïncubeerd met de SK-OV-3 cellen voor 6 uur. De cellen werden verzameld en gemengd met agarose gel, en daarna werden de cellen bestraald met of zonder LIFU voor 3 min (1 s aan en 1 s pauze voor een totaal van 3 min; 1 MHz; 2,0 W/cm²). Ten slotte werden US afbeeldingen vastgelegd.

In Vitro Antikanker Effectiviteit

SK-OV-3 cellen wurden gezaaid in een 96-put plaat bij een dichtheid van 1 × 10⁴ cellen/put, en toegelaten om te hechten voor 24 uur. Voor de cytotoxiciteit van FA-FRT, werden verschillende concentraties (0, 20, 40, 100, 200, en 500 μg/mL) van FA-FRT gekweekt met SK-OV-3 cellen. Na 24 uur behandeling, werden de cellen behandeld door DMEM media met 10% CCK-8 voor 20 min in een broeikast. De absorbantie van de cellen bij 450 nm golfengte werd gedetecteerd door een Multimode Plaat Lezer (Thermo Scientific) om de celviabiliteit te karakteriseren. Daarnaast werden de SK-OV-3 cellen en normale ovarium cellen (HUM-CELL-0088) behandeld met PBS, FRT-PFP, en FA-FRT-PFP en FA-FRT-PFP + FA voor 3 uur, en daarna bestraald door LIFU (1 s met een 1 s pauze voor een totaal van 4 min; 1 MHz; 2,0 W/cm²). De behandelde cellen werden nog 21 uur geïncubeerd. Als controle, zonder LIFU, werden de cellen behandeld met PBS, FRT-PFP, en FA-FRT-PFP en FA-FRT-PFP + FA voor 24 uur. Daarna werd de viabiliteit van de behandelde cellen gedetecteerd door CCK-8 assay.

Cel Dood Analyse

Om het type celdood te beoordelen, werden SK-OV-3 cellen gezaaid in 6-put platen bij een dichtheid van 5 × 10⁴ cellen/mL. Na 24 uur, werden de cellen behandeld met PBS, FRT-PFP, en FA-FRT-PFP en FA-FRT-PFP + FA voor 3 uur, dan bestraald met LIFU (1 s, gepauzeerd voor 1 s voor een totaal van 4 min; 1 MHz; 2,0 W/cm²). De behandelde cellen werden nog 23 uur geïncubeerd. Als controle, werden cellen behandeld met PBS, FRT-PFP, en FA-FRT-PFP en FA-FRT-PFP + FA voor 24 uur in de afwezigheid van LIFU. De cellen werden getrypsiniseerd, gecentrifugeerd bij 1500×g voor 3 min, 3 keer gewassen met ijskoud PBS, en daarna geresuspendeerd in 200 mL bindingsbuffer. Daarna werden 5 μL annexine V-FITC en 10 μL PI toegevoegd en geïncubeerd met de cellen voor 15 min in het donker. De gekleurde cellen werden geanalyseerd met behulp van een stroomcytometer.

Western Blotting

De western blotting werd uitgevoerd volgens eerdere literatuur. De cellen werden behandeld met 40 μg/mL van PBS (controle), FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA, en FA-FRT-PFP gecombineerd met of zonder LIFU bestraling (2,0 W/cm², 4 min) en verdere 21 uur incubatie. En daarna werden de behandelde cellen gelyseerd in RIPA buffer (Sigma). Vijftig microgram van elk eiwit met Laemmli monsterbuffer werden gekookt voor 5 min en onderworpen aan SDS-PAGE. De eiwitten werden overgebracht op PVDF membraan (Bio-Rad Laboratories) met behulp van semi-droge Trans-Blot (Bio-Rad Laboratories). Blots werden eerst geïncubeerd in TBS blokkeringsbuffer met ofwel 2% melk of 2% BSA (voor fosfo-specifieke antilichamen) voor 1 uur bij kamertemperatuur en daarna met de respectieve primaire antilichamen vervaagd in TBST (bevattend 0,1% Tween20 en 2% BSA) overnacht bij 4 °C. Vervolgens werden blots gewassen en geïncubeerd met geschikte secundaire antilichamen (Santa Cruz) in TBST en gedetecteerd met SuperSignal West Pico Chemiluminescente Substraat (Thermo).

Statistische Analyse

Alle gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaarddeviatie. Statistische analyses werden uitgevoerd met Student's t-test. *P < 0,05, **P < 0,01 werden beschouwd als statistisch significant.

Resultaten en Discussie

Bereiding en Karakterisering van FA-FRT-PFP

FA-FRT-PFP werd gesynthetiseerd en gebruikt voor tumortherapie (Fig. 1). Fase-transformatie druppels werden geladen in FRT door de pH-geïnduceerde reversibele ontbinding en herassemblage van FRT. De PFP met LIFU-geïnduceerde akoestische druppel verdamping (ADV) werd in cellen geleverd en fungeerde als een ultrasound imaging agent. Figuur 2a–c toont TEM afbeeldingen van FRT, FRT-PFP, en FA-FRT-PFP, die sferische morfologie vertoonden. De gemiddelde deeltjesgroottes van FRT, FRT-PFP, en FA-FRT-PFP waren respectievelijk 6,9 ± 0,3 nm, 43,8 ± 1,6 nm, en 47,3 ± 2,8 nm (Fig. 2d), wat aantoont dat PFP lading en FA conjugatie de grootte van FRT vergrooten. Het gemiddelde zeta-potentiaal van FRT en FA-FRT-PFP waren respectievelijk −43,2 ± 3,1 mV, −46,9 ± 2,2 mV, en −41,5 ± 2,7 mV (Fig. 2e). Bovendien werd de conjugatie van FA met FRT gekarakteriseerd door FT-IR zoals getoond in Bijlage 1: Figuur S1. Het FT-IR spectrum toonde absorptiebanden bij ~ 1110 cm⁻¹ die kunnen corresponderen met de trilling C–O–C ether binding van PEG; absorptiepieken bij ~ 1601 cm⁻¹ en ~ 1710 cm⁻¹ behoren tot trilling C=O bindingen van PEG en FRT alsook van –COOH en –CONH₂ van FA en FRT; de banden bij ~ 2820 cm⁻¹, ~ 2920 cm⁻¹, en ~ 2950 cm⁻¹ corresponderen met asymmetrische en symmetrische C–H rektrillingen van –CH₂ van FA en PEG; absorptiepieken bij ~ 1440 cm⁻¹ zijn geassocieerd met de fenylring van FA. Het resultaat bevestigt de succesvolle conjugatie van FA met FRT. Over de 28 dagen opslagperiode, bleven de grootte en PDI van FA-FRT-PFP in water, PBS, zoutoplossing, en FBS geen significante verandering (Fig. 3a, b), wat aangeeft dat FA-FRT-PFP uitstekende stabiliteit vertoont. Figuur 3c toont de grootteverandering van FA-FRT-PFP bij verschillende temperaturen variërend van 25 °C tot 45 °C. De grootte van FA-FRT-PFP was bijna onveranderd toen de temperatuur werd verlaagd tot 25–40 °C, wat aangeeft dat FA-FRT-PFP hoge stabiliteit vertoont onder 40 °C. Toen de temperatuur 45 °C bereikte, varieerde de grootte van FA-FRT-PFP van 42,1 nm tot 6 nm, waarschijnlijk door de PFP in FA-FRT-PFP die ernstige vergassing onderging, wat leidde tot breuk van de nanodeeltjes. De vergassingstemperatuur van FA-FRT-PFP steeg van 29 °C (vergassingstemperatuur van PFP onder normale druk) tot 45 °C, waarschijnlijk door de bedekking van de FRT schil [21, 31,32,33].

pH en LIFU Responsieve US Versterking

US phantom experimenten van FA-FRT-PFP werden uitgevoerd bij verschillende pH-waarden en LIFU vermogensintensiteit. Zoals getoond in Fig. 4a, in de afwezigheid van LIFU bestraling (pre), was het US signaal zwak in alle groepen. Bij pH 7,5 na 3 min LIFU bestraling, toonde FA-FRT-PFP een laag US signaal zowel bij 1,5 als 2,0 W/cm², terwijl bij pH = 5,0 onder dezelfde LIFU bestralingstijd, FA-FRT-PFP een sterkere US signaalintensiteit had. Dit toonde aan dat FA-FRT-PFP tijd- en akoestische intensiteit-afhankelijke ADV effecten vertoonde. Dit was omdat, bij pH = 5,0, FA-FRT-PFP ontbond en PFP vrijgaf waardoor het gemakkelijker fase-transformatie onderging. Interessant, toen de LIFU bestralingstijd werd verlengd tot 4 min, had FA-FRT-PFP bij pH = 5,0 en 2,0 W/cm² LIFU een zwakkere US signaalintensiteit vergeleken met die bij een lagere bestralingstijd, waarschijnlijk omdat de LIFU bij deze conditie te sterk is wat de bellen doet barsten. Deze resultaten toonden aan dat FA-FRT-PFP PFP kon vrijgeven, fase-transformaties en explosie genereren bij 2,0 W/cm² LIFU bestraling bij pH = 5,0. De resultaten van US intensiteit worden getoond in Fig. 4b, c. Figuur 4d–g toont de morfologie van FA-FRT-PFP oplossingen na 3 min LIFU bestraling (2,0 W/cm²) en bij pH = 7,5 en 5,0. FA-FRT-PFP bij pH = 5,0 en 2,0 W/cm² LIFU genereerde grote bellen, wat onze bevindingen verder valideert.

Cel Opname

Figuur 5 toont de cellulaire opnamecapaciteit van FA-FRT-PFP. Vrije FITC-behandelde cellen toonden verwaarloosbare fluorescente, maar na labelen op FA-FRT-PFP, was een sterk fluorescente signaal evident, wat aangeeft dat FA-FRT-PFP sterke cellulaire opnamecapaciteit heeft. FRT-PFP-behandelde en FA-FRT-PFP-behandelde cellen voor-geïncubeerd met FA toonden zwakkere FITC fluorescente. Dit toonde verder aan dat FA de actieve targeting van nanodeeltjes verbetert. Daarnaast toonde FA-FRT-PFP een vergelijkbaar opnamegedrag als FCM (Fig. 5c, d). De opnamesnelheden van FA-FRT-PFP waren 46,5 ± 2,8%, wat significant hoger was dan die van vrije FITC (controle), FRT-PFP en FA-FRT-PFP + FA. Bovendien toont Bijlage 1: Figuur S2 de cellulaire opname van nanodeeltjes in normale ovariumcellen. Er zijn geen significante verschillen tussen FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA, en FA-FRT-PFP groepen in cellulaire opname. Dit is waarschijnlijk omdat de normale ovariumcellen (HUM-CELL-0088) lage FA receptor expressie hebben vergeleken met SK-OV-3 cellen.

In Vitro Ultrasound Imaging

Ter bevestiging dat FA-FRT-PFP ultrasound imaging verbetert door ADV in vitro, werden nanodeeltjes geïncubeerd met de cellen voor 5 uur en bestraald met of zonder LIFU (2,0 W/cm²). Zoals getoond in Fig. 6a in de afwezigheid van LIFU bestraling, toonden cellen in alle geteste groepen geen versterkte ultrasound signalen, terwijl na LIFU bestraling, FA-FRT-PFP-behandelde cellen hoge US intensiteiten toonden vergeleken met controle FRT-PFP en FA-FRT-PFP + FA groepen, respectievelijk. Voor ultrasound imaging, werd kwantitatieve analyse van de grijswaarden berekend met ImageJ software. De resultaten waren consistent met de US imaging data (Fig. 6b) die toonden dat de US intensiteit van FA-FRT-PFP behandelde cellen versterkt werd na bestraling door LIFU bij 2,0 W/cm² voor 3 min. FA-FRT-PFP gaat in cellen en in de zuur omgeving van lysosomen (pH = ~ 5,0) ontbindt en geeft PFP vrij in het cytoplasma [34, 35]. Na LIFU bestraling, genereerde de PFP gemakkelijk fase-transformaties van druppels naar gas, wat de US intensiteit versterkte.

In Vitro Antikanker Effectiviteit en Cel Dood Analyse

Figuur 7a toont de cytotoxiciteit van FA-FRT-PFP bij concentraties tot 0,5 mg/mL. In de afwezigheid van LIFU bestraling, toonde FA-FRT-PFP geen duidelijke onderdrukking van viabiliteit in SK-OV-3 cellen. CCK-8 assays werden gebruikt om de antikanker effectiviteit van FA-FRT-PFP gecombineerd met LIFU te analyseren. Zoals getoond in Fig. 7b, in de afwezigheid van LIFU bestraling, toonden FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA, en FA-FRT-PFP geen opmerkelijke cytotoxiciteit vergeleken met controlegroepen. Wanneer gecombineerd met 4 min LIFU bestraling, toonde FA-FRT-PFP significante cytotoxiciteit wat hoger was dan die van FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA, met piek cel inhibitie percentages benaderend 90% bij 40 μg/mL. Dit kan zijn omdat FA-FRT-PFP gemakkelijker wordt opgenomen in het cytoplasma en dan lysosomen vergeleken met FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA. In de zuur omgeving van lysosomen, gaf FA-FRT-PFP PFP vrij in het cytoplasma. Onder 4 min LIFU bestraling, vergaste de vrijgegeven PFP, wat cavitatie en barsting veroorzaakte, genererend een reeks fysieke schokkrachten die de doodende effecten van de tumoren aanzienlijk versterkten [36,37,38]. Bovendien toont Bijlage 1: Figuur S3 de cytotoxiciteit van nanodeeltjes in normale ovariumcellen. Er zijn geen significante verschillen tussen FRT-PFP, FA-FRT-PFP + FA, en FA-FRT-PFP groepen in cytotoxiciteit wanneer ze gecombineerd zijn met LIFU. Het resultaat kan zijn omdat HUM-CELL-0088 cellen lage FA receptor expressie hebben die geen FA targeting effect toonden.

Zoals getoond in Fig. 8a, b, in de afwezigheid van LIFU bestraling, toonden cellen minimale celdood in alle groepen. Na 4 min LIFU bestraling, toonden FA-FRT-PFP-behandelde cellen significante necrose (~ 91,6%) vergeleken met andere groepen door de fysieke schokgolven gegenereerd door LIFP-geïnduceerde PFP cavitatie of belbarsting. Verder, Bijlage 1: Figuur S4 toont de TNF eiwit expressie niveau van cellen. Zonder LIFU, drukten de cellen nauwelijks TNF eiwit uit. Terwijl met LIFU, hebben de cellen in FA-FRT-PFP groep een hoog niveau van TNF expressie, vergeleken met die in FRT-PFP en FA-FRT-PFP + FA groepen, wat aangeeft dat het TNF eiwit een vitaal FA-FRT-PFP + LIFU-geïnduceerd dood-gerelateerd eiwit was [39]. Gebaseerd op de uitstekende in vitro kankertherapie effect [40,41,42], is FA-FRT-PFP veelbelovend voor toekomstige kankertherapie in vivo.

Conclusie

Samengevat, hebben we succesvol FRT-gebaseerde en PFP-geladen fase-transformatie nanodeeltjes ontwikkeld gemodificeerd met een FA doelwit molecuul (FA-FRT-PFP). Als een nieuwe gerichte US theranostica, had FA-FRT-PFP meerdere voordelen: (1) FA-FRT-PFP had een nanoschaal deeltjesgrootte; (2) FRT werd gebruikt als drager, wat kon ontbinden en herassembleren om PFP druppels te uploaden en vrij te geven bij zuur en neutrale condities, respectievelijk; (3) onder 3 min LIFU hulp en zuur condities, gaf FA-FRT-PFP PFP vrij en genereerde fase-transformaties door ADV, wat zijn US contrast aanzienlijk kon verhogen; (4) onder 4 min bestraling door LIFU en een zuur milieu, kon de vrijgegeven PFP gemakkelijk een intracellulaire "explosie effect" induceren, resulterend in fysieke antitumor eigenschappen. Deze resultaten tonen aan dat FA-FRT-PFP met LIFU hulp een nieuwe strategie biedt voor ultrasound moleculaire imaging en tumortherapie.

Beschikbaarheid van Gegevens en Materialen

De conclusies in dit manuscript zijn gebaseerd op de gegevens die allemaal gepresenteerd en getoond worden in dit artikel.

Afkortingen

ADV:

Akoestische druppel verdamping

ARP:

Akoestisch respons platform.

CCK-8:

Cel teller kit-8

EDC:

1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide

FA:

Foliumzuur

FBS:

Foetaal kalfserum

FITC:

Fluoresceïne isothiocyaan

FRT:

Ferritine

LIFU:

Lage-intensiteit gefocuste ultrasound

NHS:

N-hydroxysuccinimide

PFP:

Perfluorpentaan

US:

Ultrasound