Snelle, groene synthese van PDMAEMA-gebaseerde zilver-bevattende copolymeer micellen met verbeterde in vitro antibacteriële effectiviteit

Samenvatting

Wel-gedefinieerde polymere micellen met een kern-schelp architectuur dienen als effectief platform voor het stabiliseren van zilver nanopartikels (AgNPs) en het leveren van antimicrobiële middelen. Deze studie presenteert een rationele, groene en schaalbare synthese van AgNP-gedecoreerde copolymeer micellen gebaseerd op poly(2-dimethylamino-ethyl methacrylate) (PDMAEMA) en evalueert hun fysicochemische en antibacteriële eigenschappen. Twee copolymeer topologieën - lineair en vier-arm ster - werden bereid met identieke moleculaire gewichten en polymerisatiegraad. De tertiaire amine groepen van PDMAEMA coördineren simultaan Ag⁺ en reduceren het in situ, terwijl de hydrofiele PHEMA en PEGMA schilpen sterische stabilisatie in aqueuze media bieden. Computationele modellering en experimentele karakterisering (UV-Vis, TEM, DLS, FTIR, XRD) bevestigden dat beide architecturen monodisperse, sferische AgNPs produceren. Ster-vormige micellen leverden kleinere deeltjes, superieure colloidale stabiliteit en hogere antibacteriële potentie tegen Escherichia coli DH5α vergeleken met lineaire micellen. Cytotoxiciteitsassays met HepG2 cellen toonden >90% levensvatbaarheid bij concentraties tot 400 µg mL⁻¹, wat goede biocompatibiliteit aangeeft. Deze bevindingen tonen een veelzijdige, één-pot benadering voor het fabriceren van topologie-geafstemde, zilver-beladen micellen met potentie voor breed-spectrum antibacteriële toepassingen.

Inleiding

Traditionele antimicrobiële middelen worden steeds meer uitgedaagd door de snelle opkomst van multi-drug-resistente pathogenen, een dreiging gerankt onder de top drie door de Wereldgezondheidsorganisatie. Zilver nanopartikels (AgNPs) zijn lang gewaardeerd voor hun breed-spectrum activiteit, lage zoogdiertoxiciteit en beperkte neiging om resistentie te induceren. Hun antimicrobiële mechanisme omvat membraanontwrichting, intracellulaire proteïne denaturatie en interferentie met DNA replicatie. Echter, AgNPs' hoge oppervlakte-energie drijft aggregatie, wat hun effectiviteit en stabiliteit ondermijnt. Encapsulatie in polymere matrices - met name micellen - biedt een praktische oplossing door sterische hindering en gecontroleerde vrijgifte te bieden. Veelvoorkomende stabilisatiestrategieën vertrouwen op externe reductanten (bijv. NaBH₄, ascorbijnzuur) die giftige bijproducten introduceren en zuivering bemoeilijken. Integendeel, amine-rijke polymeren kunnen simultaan Ag⁺ coördineren en in situ reduceren, wat externe reductanten overbodig maakt. Toch blijft de invloed van polymertopologie op AgNP nucleatie, groei en antibacteriële prestaties onderbelicht, met name voor ster-vormige architecturen die verbeterde sterische afscherming kunnen bieden. Dit werk adresseert die kloof door lineaire en vier-arm ster PDMAEMA-gebaseerde triblock copolymeer micellen te ontwikkelen, hun vermogen om monodisperse AgNPs in situ te genereren te evalueren, en antibacteriële activiteit en cytocompatibiliteit te beoordelen.

Materiaal en Methoden

Materialen

Alle reagentia werden als ontvangen gebruikt tenzij anders aangegeven. Sleutelmonomeren omvatten DMAEMA (>98%), HEMA (99%) en PEGMA (Mn = 300 Da, 99%) (Aldrich). Pentaerythritol, EBiB en BIBB werden gezuiverd door alumina kolom chromatografie. Zilver nitraat (AgNO₃, 99,9%) werd gebruikt als Ag⁺ bron.

Algemene Karakterisering en Instrumentatie

¹H NMR spectra werden opgenomen op een Bruker 400 MHz spectrometer in CDCl₃ of D₂O bij 25°C. FTIR spectra werden verkregen met een Nicolet Nexus spectrophotometer (4000-400 cm⁻¹, 32 scans, 8 cm⁻¹ resolutie). Zeta potentiëlen werden gemeten op een Malvern Zetasizer Nano S. TEM beelden werden verkregen op een FEI Tecnai-G20 (200 kV). UV-Vis spectra werden opgenomen op een Shimadzu UV-2450. Thermogravimetrische analyse (TGA) werd uitgevoerd met een NETZSCH STA409PC onder stikstof (25-600°C, 10°C min⁻¹).

Synthese van PDMAEMA-b-PHEMA-b-PPEGMA

Polymerisatie werd uitgevoerd via ARGET ATRP in tolueen (70°C) met CuBr₂/HMTETA als katalysator, Sn(Oct)₂ als reductiemiddel en EBiB als initiator. DMAEMA, HEMA en PEGMA werden achtereenvolgens gepolyemeriseerd om een triblock copolymeer te verkrijgen met Mn ≈ 19 kDa (DMAEMA), 12 kDa (PHEMA) en 25 kDa (PPEGMA). Het product werd geprecipiteerd in koud n-hexaan, gefiltreerd en gedroogd onder vacuüm (48 uur, 35°C).

Synthese van (PDMAEMA-b-PHEMA-b-PPEGMA)₄

Een vier-arm ster initiator werd bereid door pentaerythritol te esterificeren met BIBB in THF/TEA, wat een tetrabromeerde kern opleverde. daaropvolgende ARGET ATRP, volgens dezelfde condities als het lineaire copolymeer, produceerde het ster-vormige triblock copolymeer. Opbrengst en zuiverheid werden bevestigd door ¹H NMR en SEC.

Voorbereiding van AgNPs met Lineaire of Ster-vormige Copolymeer Micellen

Copolymeer oplossingen (4,8 mM DMAEMA) werden 4 uur in aceton (5 mL) geroerd, vervolgens gedilueerd met water (20 mL) en overnachten geroerd om micellen te vormen. AgNO₃ (220 µL, 48 mM) werd druppelgewijs toegevoegd, en het mengsel werd 48 uur bij 25°C in het donker geroerd. Micellen gestabiliseerd met AgNPs werden geïsoleerd door centrifugatie, vriesgedroogd en opgeslagen bij -20°C.

Antibacteriële Assay

Groei-inhibitie tegen E. coli DH5α werd beoordeeld door 1×10⁵ CFU mL⁻¹ bacteriën te mengen met seriële verdunningen van micellen of micellen-gestabiliseerde AgNPs. Na 16 uur incubatie bij 37°C werd optische dichtheid bij 600 nm (OD₆₀₀) gemeten met een microplaatlezer. Zes replicaten werden uitgevoerd per concentratie.

Cel Levensvatbaarheid Evaluatie

HepG2 cellen werden gezaaid in 96-put platen (1×10⁴ cellen mL⁻¹) en 24 uur gecultiveerd. Testoplossingen (10-400 µg mL⁻¹) werden 24 uur toegevoegd, gevolgd door MTT assay (4 uur incubatie met 5 mg mL⁻¹ MTT, 200 µL DMSO). Absorptie bij 570 nm kwantificeerde cel levensvatbaarheid. Experimenten werden in zesvoud uitgevoerd.

Dissipatieve Deeltjes Dynamica Simulatie

Grofgkorrel DPD simulaties (Materials Studio 8.0) modeleerden copolymeer en AgNP interacties bij een PDMAEMA/Ag⁺ verhouding van 1:1. Een 30×30×30 r_c³ doos met 100.000 stappen (0,05 ns) ving micel zelf-assemblage en AgNP encapsulatie. Interactieparameters werden genomen uit eerdere werk.

Statistische Analyse

Data werden geanalyseerd met two-sample Student's t-test (ongelijke variantie); p < 0,05 werd significant geacht.

Resultaten en Discussie

Synthese en Karakterisering van Lineaire/Ster Copolymeren

Zowel lineaire als ster triblock copolymeren werden succesvol gesynthetiseerd door ARGET ATRP. ¹H NMR bevestigde de verwachte blok samenstelling: PDMAEMA₁₉,₃-b-PHEMA₁₂,₅-b-PPEGMA₂₄,₆ en (PDMAEMA₅,₀-b-PHEMA₅,₆-b-PPEGMA₅,₀)₄. De sterkern (pentaerythritol) was volledig gebromeerd, zoals bewijs door het verdwijnen van het -CH₂-OH signaal en het verschijnen van nieuwe bromeer-dragende methylene pieken.

Voorbereiding en Karakterisering van de Lineaire/Ster Copolymeer Micellen Gestabiliseerde AgNPs

In aqueuze media assembleerden de triblock copolymeren zichzelf tot kern-schelp micellen. De PDMAEMA kern bindt Ag⁺ via tertiaire amine coördinatie en reduceert het in situ, wat Ag atomen genereert die nucleeren tot nanopartikels. De hydrofiele PHEMA/PPEGMA schil biedt sterische bescherming, wat aggregatie voorkomt. DPD simulaties toonden aan dat Ag korrels snel lokaliseren binnen micelkernen, wat efficiënte encapsulatie bevestigt. UV-Vis spectra toonden een oppervlakte plasmon resonantie (SPR) piek bij 437 nm voor lineaire micellen en 422 nm voor ster micellen, wat monodisperse, bijna-sferische AgNPs aangeeft. TEM beelden onthulden deeltjesdiameters van 11,1 nm (lineair, 1:1 verhouding) en 3,7 nm (ster, 1:1 verhouding), uitbreidend tot 25,7 nm en 6,4 nm respectievelijk bij een 6:1 verhouding. Zeta potentiëlen varieerden van +15 mV tot +23 mV, toenemend met Ag inhoud, wat succesvolle oppervlaktebedekking reflecteert.

Stabiliteit van de Lineaire/Ster Copolymeer Micellen Gestabiliseerde AgNPs

UV-Vis monitoring over 30 dagen toonde verwaarloosbare verschuiving voor ster micellen zelfs na 1:3 verdunning, terwijl lineaire micellen een bescheiden rode verschuiving vertoonden, wat minder robuuste colloidale stabiliteit suggereert. TGA gaf aanvang degradatietemperaturen van 213°C voor ster micellen en 172°C voor lineaire micellen met AgNPs, wat de superieure thermische veerkracht van de ster architectuur benadrukt.

Antibacteriële Activiteit en Cel Levensvatbaarheid

OD₆₀₀ metingen onthulden concentratie-afhankelijke inhibitie van E. coli groei door micellen-gestabiliseerde AgNPs. Ster micellen bereikten >90% inhibitie bij 50 µg mL⁻¹, terwijl lineaire micellen 200 µg mL⁻¹ vereisten voor vergelijkbaar effect, toeschrijfbaar aan kleinere deeltjesgrootte en hogere oppervlakte. Cytotoxiciteitsassays met HepG2 cellen toonden levensvatbaarheid boven 90% over alle geteste concentraties, wat lage zoogdiertoxiciteit bevestigt.

Conclusie

Deze studie toont aan dat PDMAEMA-gebaseerde lineaire en ster triblock copolymeer micellen gebruikt kunnen worden als dubbele-functie platforms - simultaan reducerend en stabiliserend zilver nanopartikels - via een enkele, groene synthetische stap. Ster-vormige micellen produceren kleinere, stabielere AgNPs en vertonen superieure antibacteriële activiteit terwijl ze uitstekende biocompatibiliteit behouden. De topologie-geafstemde benadering biedt een veelzijdige strategie voor het ontwerpen van geavanceerde antimicrobiële nanomaterialen.

Beschikbaarheid van Data en Materialen

De datasets gebruikt en/of geanalyseerd tijdens de huidige studie zijn beschikbaar bij de corresponderende auteur op redelijke verzoek.

Afkortingen

AgNPs:

Zilver nanopartikels

DMAEMA:

2-(dimethylamino) ethyl methacrylate

HEMA:

2-hydroxyethyl methacrylate

PEGMA:

Poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate

CuBr₂:

Cupric bromide

¹H NMR:

Proton nucleaire magnetische resonantie

FTIR:

Fourier-transformatie infrarood spectroscopie

KBr:

Kalium bromide

UV-Vis:

Ultraviolet-zichtbare spectroscopie

MTT:

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromide

HepG2:

Lever hepatocellulaire carcinoom cel lijn

DPD:

Dissipatieve deeltjes dynamica

SPR:

Oppervlakte plasmon resonantie

XRD:

Röntgendiffractie