Temperatuur- en pH-responsieve PNIPAM-gebaseerde nanogels voor dubbele-stimuli gecontroleerde afgifte van β-lapachon

Samenvatting

Poly-N-isopropylacrylamide (PNIPAM) nanogels werden gecopolymeriseerd met acrylzuur (AAc) om de lagere kritische oplossingstemperatuur (LCST) af te stemmen. De resulterende PNIPAM-co-AAc nanogels vertonen twee distincte volume-fasetransities, waarbij de LCST stijgt naarmate de AAc-inhoud toeneemt. Bij lading met β-lapachon (β-LP) wordt medicijnafgifte beheerst door zowel temperatuur als pH, en sterk beïnvloed door de AAc-ratio. Opvallend behoudt de PNIPAM-co-AAc20 formulering <10% medicijnafgifte bij zuur-neuter pH en lichaamstemperatuur, terwijl >70% wordt vrijgegeven bij basisch pH. Deze bevindingen tonen aan dat temperatuur- en pH-responsieve PNIPAM-nanogels veelbelovende dragers zijn voor darm-specifieke medicijnafgifte via orale toediening.

Inleiding

Stimuli-responsieve nanodragers worden steeds vaker ingezet in medicijnafgifte, imaging en diagnostiek. Onder de gebruikte triggers - pH, temperatuur, redox, magneetveld, licht - blijven temperatuur en pH de meest uitgebuiten voor gecontroleerde afgifte. PNIPAM, een thermo-responsief polymere, kollabteert boven zijn LCST (~32 °C) door hydrophobe interacties, terwijl gedepotoneerde carboxylgroepen in AAc additionele elektrostatische afstoting introduceren die de LCST naar boven verschuift. Copolymerisatie van PNIPAM met AAc biedt dus een afstembaar platform dat kan reageren op zowel temperatuur als pH. β-Lapachon, een natuurlijke anti-kankeragent, heeft een beperkt therapeutisch window vanwege snelle metabolisme en off-target toxiciteit; encapsulatie in responsieve nanogels kan deze nadelen mitigeren. In deze studie rapporteren we de synthese van PNIPAM-co-AAc nanogels met varierende AAc-inhoud, hun dubbele-stimuli medicijnafgifte-gedrag, en hun cytotoxische effectiviteit in fibroblastencellen.

Methodes

Materialen

NIPAM (97%, Sigma-Aldrich), N,N'-methylenebisacrylamide (MBA), AAc, gedemineraliseerd water, EtOH, kaliumpersulfaat (KPS, 98%, Dae Jung), β-LP (Natuurlijke Producten), en PBS waren analytische graad en werden zo ontvangen gebruikt.

Synthese van PNIPAM-co-AAc Nanogels

In een 500 mL kolven werden 2,26 g NIPAM, 0,154 g MBA, en 0-0,145 g AAc opgelost in 200 mL water bij 75 °C. Na stikstof-purging werd 37,5 mg KPS toegevoegd en de mengsel 10 min gerefluxeerd, wat een troebel oplossing opleverde. Het polymere werd gedialyseerd (12-14 kDa) gedurende 7 dagen, bevroren in vloeibare stikstof, en 3 dagen vriesgedroogd om droge nanogels op te leveren (PNIPAM, PNIPAM-co-AAc5, PNIPAM-co-AAc10, PNIPAM-co-AAc20).

β-LP Lading

1 mg gedroogde nanogel werd opgelost in 1 mL EtOH, en 0,1 mg β-LP werd toegevoegd. De mengsel werd overnachts in het donker geroerd, daarna gedialyseerd (6-8 kDa), bevroren, en vriesgedroogd. De resulterende β-LP-geladen nanogels werden bij 4 °C opgeslagen.

Karakterisatie

Morfologie werd onderzocht met TEM (200 kV) en FE-SEM (15 kV). FT-IR spectra werden opgenomen op een Nicolet 6700 spectrometer. Medicijnlading en -afgifte werden gekwantificeerd door UV-Vis spectroscopie (200-800 nm). LCST werd bepaald door dynamische lichtverstrooiing (DLS) bij 1 °C stappen van 30 tot 50 °C.

Medicijnafgifte Studies

10 mL van β-LP-geladen nanogels werden in 3,5 kDa dialysebuizen geplaatst en geïncludeerd bij 24 °C en 37 °C in PBS bij pH 2, 4, 7,4, en 8,0. Op gespecificeerde tijdstippen (0-12 uur) werden 2 mL aliquotes onttrokken en geanalyseerd door UV-Vis. Cumulatieve afgifte werd berekend relatief tot de totaal geladen β-LP.

Cellevensvatbaarheidstesten

NIH3T3 fibroblasten (2×10⁴ cellen/put) werden behandeld met vrije β-LP, PNIPAM-co-AAc5-β-LP, of PNIPAM-co-AAc20-β-LP bij 0-20 µg/mL. Na 3 uur werden MTT-assay (595 nm) en LIVE/DEAD® kleuring uitgevoerd om cytotoxiciteit te beoordelen.

Resultaten en Discussie

Bereiding en Morfologie

TEM en SEM beelden (Fig. 1) onthulden monodisperse nanogels met gemiddelde diameters van ~250 nm voor PNIPAM-co-AAc5. Zeta-potentialen daalden van -13,6 mV (PNIPAM) naar -23,6 mV (PNIPAM-co-AAc20), wat de toegenomen oppervlakte-carboxylgroepen reflecteert.

Temperatuur-responsief Gedrag

DLS metingen (Fig. 2) toonden twee distincte zwel-kollaps transities. De eerste transitie begon bij ~30 °C, en de tweede verscheen bij ~40 °C, verschuvend naar 45 °C voor PNIPAM-co-AAc20. Dus, LCST stijgt met AAc-inhoud, consistent met eerdere rapporten.

Dubbele-stimuli Medicijnafgifte

Bij 37 °C gaf PNIPAM-co-AAc20 slechts ~61% β-LP vrij binnen 6 uur, terwijl PNIPAM en PNIPAM-co-AAc5 ~80% vrijgaf. Bij pH 8,0 nam de afgifte van PNIPAM-co-AAc20 met ~10% toe vergeleken met neutrale of zure pH (Fig. 3). Deze resultaten bevestigen dat medicijnafgifte synergistisch wordt versterkt door basisch pH en verhoogde temperatuur.

In-vitro Cytotoxiciteit

Vrije β-LP verlaagde cellevensvatbaarheid meer dan de nanogel-formuleringen. PNIPAM-co-AAc20 toonde hogere cellevensvatbaarheid bij 20 µg/mL, gecorreleerd met zijn lagere medicijnafgifte bij 37 °C. Live/dead kleuring (Fig. 4) toonde duidelijke cytotoxiciteit voor PNIPAM-co-AAc5-β-LP na 3 uur, terwijl PNIPAM-co-AAc20-β-LP grotendeels niet-toxisch bleef tot 6 uur bij pH 8,0, waar synergistische celdood werd waargenomen.

Conclusies

We hebben met succes PNIPAM-co-AAc nanogels ontworpen wiens LCST kan worden afgestemd door AAc-inhoud. De hoge-AAc (20%) formulering vertoont minimale β-LP afgifte bij fysiologische temperatuur maar geeft het medicijn efficiënt vrij bij basisch pH, wat de omgeving van de dunne darm weerspiegelt. Deze dubbele-stimuli responsieve nanogels vertegenwoordigen dus een overtuigend platform voor orale, darm-gerichte afgifte van β-lapachon.