Pullulan-gebaseerde nanodeeltjes-HSA-complexvorming en geneesmiddelafgifte beïnvloed door oppervlaktelading

¹ HNMR-spectra voor CHP (a), CHSP (b) en CHAP (c) NP's

waar A _δ2.53 is het spectrumgebied onder de karakteristieke absorptiepiek van methyleen (waterstof), en A _δ4.74 en A _δ5.01 zijn het spectrumgebied onder de karakteristieke absorptiepieken voor respectievelijk alfa-1,6- en alfa-1,4-glycosidebindingen.

Van de ¹ H NMR-spectra in CHP, de substitutiegraad van cholesterolsuccinaat (CHS) was 4,50%. Voor CHSP NP's zijn de methyleengroepen (–CH₂ CH₂ –) omvatte twee aspecten:barnsteenzuuranhydride en CHS. De substitutiegraad was 12,34% voor methyleengroepen (–CH₂ CH₂ –) en 7,84% voor carboxylgroepen. Voor CHAP NP's zijn de methyleengroepen (–CH₂ CH₂ –) omvatte twee aspecten:ethyleendiamine en CHS. De substitutiegraad was 18,6% voor methyleengroepen (–CH₂ CH₂ –) en 14,1% voor de aminogroepen.

Eigenschappen van CHP, CHSP en CHAP NP's

Amfifiele polymeren kunnen door dialyse zelf worden geassembleerd om kern-schil NP's te vormen met een hydrofiele schil en hydrofobe kern, die kunnen worden geladen met geneesmiddelen tegen kanker om met medicijnen geladen NP's te vormen. De NP-eigenschappen zoals oppervlaktelading en grootte speelden een vitale invloed op de werkzaamheid van de behandeling als drager van geneesmiddelen [39, 40]. De grootteverdeling en het zeta-potentieel van CHP-, CHSP- en CHAP-NP's gemeten door DLS worden weergegeven in Fig. 4. De gemiddelde grootte van NP's was respectievelijk 73,1, 116,9 en 156,9 nm voor CHP, CHAP en CHSP. De zeta-potentiaal was respectievelijk -0,698, +-12,9 en -15,4 mV (tabel 1).

Zeta-potentieel (a ) en maatverdeling (b ) van WKK NP's ( ), CHAP NP's ( ), en CHSP-NP's ( )

Voor pullulan NP's met dezelfde hydrofobe groep was de grootte groter voor negatief geladen CHSP en positief geladen CHAP dan neutrale CHP NP's. De geladen groep interfereert dus met het zelfassemblagegedrag van NP's en vormt grotere NP's met een losse structuur in een waterige oplossing. De zeta-potentialen van CHP NP's, CHAP en CHSP NP's waren respectievelijk -0,698 mV, +-12,9 mV en -15,4 mV. De amino- en carboxylgroepen in het polymeer zouden dus NP's met verschillende oppervlakteladingen kunnen creëren en zo de oppervlakte-eigenschappen kunnen veranderen.

Thermodynamische analyse

De thermodynamische analyse werd uitgevoerd met behulp van ITC met HSA-titratie naar CHP-, CHSP- en CHAP NP-oplossingen. Als HSA-titratie naar pullulan NP-oplossing met verschillende ladingen, hebben we de veranderingen van warmte bepaald, de verbindingseigenschappen van drie soorten materialen, verbinding en verbindingsaantal moleculen aangepast. Het oorspronkelijke spectrum van de isotherme titratiethermometer weerspiegelt de verandering in warmte. De opwaartse piek geeft een warmte-afgevende reactie aan, en de neerwaartse piek geeft een warmte-absorberende reactie aan [41, 42]. Wanneer CHP-, CHAP- en CHSP-NP's werden getitreerd met HSA, nam de vrijgekomen warmte van de combinatie in de loop van de tijd geleidelijk af (Fig. 5). In totaal werden 26 druppels HSA-oplossing getitreerd in CHP NP-oplossing, en de pieken van het spectrum waren naar boven gericht, wat de exotherme aard van de reactie aangeeft. Hetzelfde fenomeen werd waargenomen wanneer de HSA-oplossing werd getitreerd in de CHSP NP-oplossing. Toen de HSA-oplossing echter werd getitreerd in de CHAP NP-oplossing, waren de pieken van het spectrum voor de eerste vier druppels omhoog, terwijl vanaf de vijfde druppel de pieken naar beneden gingen, wat wijst op een endotherme reactie. De HSA-absorptie van CHP en CHSP NP's was exotherm, dus de reactie was spontaan. De HSA-absorptie van CHAP NP's was gedeeltelijk endotherm en gedeeltelijk exotherm, wat mogelijk verband houdt met de positieve lading van CHAP.

Isotherme titratiecalorimetriegegevens voor HSA-titratie in a CHP, b CHSP, en c CHAP NP's bij 25 °C. De NP-concentratie in de cel (250 L) was 12 M en de eiwitconcentratie in de spuit was 230 M. Bovenste grafieken tonen onbewerkte gegevens en onderste grafieken tonen geïntegreerde heats

De enthalpiewaarde weerspiegelt de warmte die vrijkomt door de combinatie van HSA en NP's. De enthalpieveranderingen van CHP, CHSP en CHAP NP's door HSA waren respectievelijk 42,827, 80,3712 en 22,3951 KJ/mol (Tabel 2). Gecombineerd met de enthalpieverandering, de exotherme reactie, de chemische structuur van de amfifiele NP's en de negatieve lading van HSA, kan de hydrofobe interactie voornamelijk de HSA-interactie met CHP en CHSP NP's aansturen. Merk op dat in de HSA-titratie van CHAP de hitte een negatieve waarde bevatte. HSA-moleculen bevatten een hydrofobe pocket die kan worden gecombineerd met het hydrofobe centrum van de NP [43], dus de interactie die wordt veroorzaakt door de eerste vier druppels HSA en CHAP wordt voornamelijk aangedreven door hydrofobe krachten. Hoewel HSA negatief geladen is en CHAP positief geladen is, is er vanaf de vijfde druppel ook een ladingskracht tussen HSA en CHAP vanwege de endotherme aard van de reactie.

De waarde van entropieverandering kan de moeilijkheid van de reactie tussen HSA en NP's weerspiegelen. De entropieën van HSA en CHP, CHSP en CHAP NP's waren respectievelijk 0,251, 2,775 en 0,201 KJ/mol K (Tabel 2), dus CHP en CHAP NP's zijn gemakkelijker te binden aan HSA, terwijl CHSP NP's moeilijker te binden zijn. binden aan HSA.

De dekking van HSA en CHP, CHSP en CHAP NP's was respectievelijk 1,17, 0,404 en 0,845. De concentratie van NP's wordt berekend op basis van de concentratie van het polymeer in plaats van het aantal deeltjes. We weten niet hoeveel afzonderlijke polymeerdeeltjes een enkele NP bevatten, dus we kunnen niet precies bepalen hoeveel van elke NP door HSA wordt geadsorbeerd, maar op basis van de dekkingswaarde kunnen we concluderen dat WKK-NP's de hoogste adsorptie van HSA hebben.

In eerdere experimenten hebben we aangetoond dat de affiniteitswaarde, K _A , weerspiegelt de sterkte van de bindende kracht tussen NP's en HSA [32]. Hoe sterker de hydrofobiciteit van WKK NP's, hoe sterker de affiniteit [44]. De bindingsconstante van HSA en CHP was 27,7 × 10 ⁴ M ⁻¹ , die van HSA en CHSP was 1,41 × 10 ⁴ M ⁻¹ , en die van HSA en CHAP was 412 × 10 ⁴ M ⁻¹ . Dus de combinatie van HSA en positief geladen CHAP was het sterkst, gevolgd door neutraal geladen CHP en negatief geladen CHSP. De sterkste combinatie van HSA en CHAP kan worden toegeschreven aan de hydrofobe kracht, een wederzijdse aantrekking van de ladingskracht en waarschijnlijk een wederzijds uitsluitende lading tussen HSA en CHSP.

Fluorescentiespectroscopie

Met fluorescentiespectra hebben we de interactie tussen HSA en de drie NP's met verschillende oppervlakteladingen bestudeerd. HSA bevat 585 aminozuurresiduen, met slechts één Trp-residu op 214 (Trp214), en het fluorescentiespectrum ervan domineert in het UV-gebied. Wanneer andere moleculen een interactie aangaan met HSA, kan het fluorescentiespectrum van Trp veranderen, afhankelijk van de interactie tussen HSA en andere moleculen. Wanneer de drie NP's werden gemengd met HSA, onderging de maximale emissiepiek van het HSA-fluorescentiespectrum geen chemische verschuiving; alleen de intensiteit was tot op zekere hoogte verzwakt (figuur 6A). De maximale emissiepiek van HSA werd waargenomen wanneer HSA werd gecombineerd met CHAP NP's.

A Fluorescentiespectra voor HSA (1,5 × 10 ^− 5 mol/L) zonder (a) en met (b) CHSP, (c) CHP en (d) CHAP NP's met dezelfde concentratie (4,2 × 10 ^− 6 mol/l). B HSA-emissie-intensiteit met CHSP, CHP en CHAP NP's bij 343 nm in de tijd

Experimenteel onderzoek toonde aan dat het combineren van HSA en pullulan NP's een complex proces vertoonde [45]. We voegden de drie NP's toe aan de HSA-oplossing en ontdekten dat de fluorescentie-intensiteit van de drie NP-HSA-complexen geleidelijk afnam (figuur 6B). Het evenwicht werd bereikt voor HSA-CHSP bij 556,3 nm na 12 uur, voor CHP-HSA bij 534,3 nm na 10 uur en voor CHAP-HSA bij 512,3 nm na 8 uur. De vereiste tijd wanneer de fluorescentie-intensiteit van verschillende NP-HSA-complexen in evenwicht is, is gerelateerd aan de lading die door de NP wordt gedragen. De langste tijd die nodig was om evenwicht te bereiken werd waargenomen op negatief geladen CHSP-HSA, gevolgd door ongeladen CHP-HSA.

De snelle vermindering van de initiële fluorescentie-intensiteit van de drie NP-HSA-complexen (getoond in Fig. 6A) is te wijten aan de snelle adsorptie van NP's en HSA. De daaropvolgende fluorescentie-intensiteit vertoont een langzame afname tot de constante status omdat de interactie van NP's met HSA een langzaam proces van combinatie is. De constante fluorescentie-intensiteit weerspiegelt de verzadigingsstatus van de complexering. De interactie tussen de drie verschillend geladen NP's en HSA onderging een vroeg snel recombinatieproces en een later langzaam recombinatieproces. De combinatie van negatief geladen HSA met negatief geladen CHSP vergde een langere tijd om complexe verzadiging te bereiken in vergelijking met ongeladen CHP. Negatief geladen HSA gecombineerd met positief geladen CHAP vergde de kortste tijd om complexe verzadiging te bereiken.

Figuur 7A-C toont de spectra van HSA gecombineerd met verschillende concentraties CHSP, CHP en CHAP NP's om NP-HSA-complexen te vormen. Met toenemende concentratie van NP's nam de maximale absorptiepiek van het NP-HSA-complex af, wat een omgekeerde correlatie vertoont.

Fluorescentiespectra van HSA (1,5 × 10 ^− 5 mol/L) met CHSP (A ), WKK (B ), en CHAP (C ) bij verschillende concentraties (a) 0, (b) 2.07 × 10 ⁻⁷ , (c) 3.31 × 10 ⁻⁷ , (d) 4.14 × 10 ⁻⁷ , (e) 8,28 × 10 ⁻⁷ , (f) 20,7 × 10 ⁻⁷ , (g) 33.1 × 10 ⁻⁷ , en (h) 41,4 × 10 ⁻⁷ mol/L. D Percelen (n = 7) voor F ₀ /(F ₀ − F) vs 1/[Q ], V is de concentratie van CHSP (–◆–), CHP (–■–) en CHAP (–▲–), respectievelijk

De positief geladen CHAP-HSA vertoonde de kortste tijd om evenwicht te bereiken.

We gebruikten een aangepaste Stern-Volmer-vergelijking om de fluorescentie-uitdovingsgegevens te analyseren:

waar f _een is de contactfractie van de fluorescerende stof met de quencher, K _q is de uitdovingsconstante van Stern-Volmer, F ₀ is de fluorescentie-intensiteit bij 342 nm zonder de quencher, F is de fluorescentie-intensiteit bij 342 nm met de quencher, en [Q ] is de concentratie van quencher.

Van de functionele afbeelding van F ₀ /(F ₀ − F ) paar 1/[Q ], we can obtain the values of f _een and K _q from the slope and the intercept (Fig. 7D). Assuming that the observed fluorescence intensity changes mainly due to the interaction between NPs and HSA, the quenching constant can be seen as a binding constant for the formation of complexes. The binding constants for HSA and CHSP, CHP, and CHAP molecules were 2.02, 2.99, 4.72 × 10 ⁵ M ⁻¹ , respectievelijk. In the previous study, we discussed the interaction between HSA and CHP NPs with different hydrophobicity substitutions [30]. The hydrophobic interaction between HSA molecules and CHP cholesterol played an important role in the formation of CHP–HSA. The greater the hydrophobic substitution of CHP, the greater the binding constant of CHP and HSA.

In the present study, we found that the value of the binding constant (K _b ) is related to the electrical properties of the NP. A surface with a positive charge, such as CHAP, has the largest K _b , and a surface without a charge, such as CHP, has the second largest K _b . The K _b for CHSP, with a negative charge, was the lowest. Therefore, in addition to the hydrophobic interaction between NPs and HSA, the electrostatic interaction between them also plays an essential part in the formation of NP–HSA complexes.

In addition, the f _een values for CHSP, CHP, and CHAP NPs were 0.269, 0.288, 0.38, respectively, so part of the Trp residue was involved in this reaction. Furthermore, the amount of HSA was too much at a given NP/HSA concentration, so free HSA molecules presented in the reaction system.

CD Spectrum Analysis

Figure 8A shows the CD spectra (a) free HSA, (b) CHSP–HSA, (c) CHAP–HSA, and (d) CHP–HSA in solution at 25 °C. The samples were complex I. There are two negative bands at 208 and 222 nm of the UV region in HSA spectra, which are the characteristic peaks of the α -helical structure. The α -helical content of free HSA was 55%. At the beginning of the complex, with the recombination of HSA and CHSP, CHAP, and CHP NPs, the α -helical content of HSA was reduced to 52.0%, 48.57%, and 48.0%, respectively.

A CD spectra for (a) free HSA, (b) CHSP–HSA, (c) CHAP–HSA, and (d) CHP–HSA in solution at 25 °C. The samples were complex I. B CD spectra for (a) free HSA, (b) CHSP–HSA, (c) CHAP–HSA, and (d) CHP–HSA in solution at 25 °C. The samples were complex II. C Ellipticity at 208 nm for HSA interacting with CHSP (–▲–), CHAP (–●–) and CHP (–■–) over time

Figure 8C shows that the ellipticity changes of the three samples at 208 nm over time. The ellipticity of HSA combined with CHAP and CHP NPs increased from 0 to 12 h and leveled off at 12 h, but that of HSA with CHSP NPs increased faster, i.e., the ellipticity increased from 0 to 9 h and leveled off at 9 h. Therefore, the ellipticity of the three samples gradually increased over time and the α-helical content gradually decreased; when the ellipticity maintained constant, the recombination of the sample and HSA was completed.

Figure 8C illustrates that the fastest surface absorption rate was presented on the combination of CHSP and HSA. The size, charge, and hydrophobicity of NPs can influence the migration rate of HSA to the center of NPs. The surface of CHP is not charged, the surface of CHSP is negatively charged, and the surface of CHAP is positively charged. Owing to the presence of the negative-charge mutual exclusion between CHSP and HSA, the resistance of HSA migrating to the CHSP NP center becomes larger. The traction of NPs on HSA is driven by the hydrophobic interaction forces. The traction of the three NPs on HSA is identical, so the lowest velocity of HSA migrating to the center of NPs was observed on the combination of HSA and CHSP NPs. Because the particle size is in the order of CHSP> CHAP> CHP, the particle density displays a reverse order, i.e., CHSP

The ITC results show that the amount of HSA migrating toward the center of CHSP NPs is the smallest but with the fastest speed compared with other types of NPs. Table 3 shows that the α-helix content of HSA migrating toward the center of CHP NPs was the lowest. The more the secondary structure of HSA was damaged, the faster the HSA migrated toward the center. The fastest speed was observed on HSA migrating to the center of CHSP NPs (Fig. 8C).

Figure 8B shows CD spectra for (a) free HSA, (b) CHSP–HSA, (c) CHAP–HSA, and (d) CHP–HSA in solution at 25 °C. The samples were complex II. After the complexation is completed, the α -helical content of HSA recombined with CHSP, CHAP, and CHP was reduced to 46.27%, 44.55%, and 42.91%, respectively (Table 3). With the increase in interaction time, the secondary structure of HSA was changed and the α -helical content was reduced during the process of complexation with NPs.

Drug Release

We measured the drug release rate of MTO with the three kinds of drug-loaded NPs and drug-loaded NP–HSA complexes. The drug release for free MTO was about 99.8% at 4 h (Fig. 9). The release rate in 48 h for CHP, CHAP, and CHSP NPs was 53.68%, 58.54%, and 63.24%, respectively. The drug release from all NPs was fast in the first 8 h, which was a burst release process, and the drug release remained stable after 12 h, which was a sustained release process. In vitro drug release from NPs is not affected by gastrointestinal pH and enzymes, and the dissolution of nanomaterials results in little drug release. The release is mainly determined by dissolution and diffusion [46]. The 48-h drug release rate was in the order of CHSP> CHAP> CHP, corresponding to the size of NPs. The fastest release rate was found on CHSP, which was negatively charged with the largest size. The second fast drug release rate was found on which was positively charged with the size smaller than CHSP. CHP was electrically neutral, and its drug release rate was minimal. Hence, the polymer surface groups involved in the formation of NPs affect the size of NPs and ultimately the drug release of NPs.

Mitoxantrone (MTO) release of pullulan NPs in phosphate-buffered saline (PBS) at 37 °C in vitro (□:free mitoxantrone, ○:CHP, △:CHAP, ▽:CHSP, ◁:CHAP–HSA,◇:CHP–HSA, ▷:CHSP–HSA)

The drug release rate from the combinations of HSA and CHAP, CHP, and CHSP in 48 h was 32.45%, 33.86%, and 35.76%, respectively. After the combination of NPs and HSA, the drug release in 48 h was significantly decreased as compared with HSA-free NPs, which was mainly attributed to the resistive effect and adsorption effect of HSA. At 48 h, the drug release of the compounds was in the order of CHSP–HSA> CHP–HSA> CHAP–HSA, while the drug release of HSA-free NPs was in the order of CHSP> CHAP> CHP. Although NP–HSA compounds showed significantly slow drug release, the total release of CHP-HSA decreased by 21.23% in 48 h, whereas the total release of CHAP-HSA decreased by 25.68% and that of CHSP-HSA by 28.48%. The drug release of the NPs is related to the size of the NPs and the polymer hydrophobic groups on NP surface. The adsorption of HSA can lead to significant slowdown in drug release, which is related to the hydrophobicity of NPs and also to the surface charge of NPs [46]. The adsorption of HSA is closely related to the size of the NPs and the degree of substitution of the hydrophobic groups of the polymer during the self-assembly process. Nevertheless, the drug release of the NPs is ultimately determined by the properties of the NP itself.

Discussion

As shown in Fig. 10, the formation of the NP–HSA complex is driven by a hydrophobic force between cholesterol groups of the particle core and the aromatic amino acid of the hydrophobic domain of HSA. After mixing, HSA interacts with the surface cholesterol unit and is rapidly adsorbed to the NP surface. Then, the adsorbed HSA on the NP surface is processed because of the hydrophobic forces derived from the cholesteric unit in the particle core. When overcoming the steric hindrance of polysaccharide chains in the NP shell, the adsorbed HSA gradually migrates to the core. After the hydrophobic interaction and resistance of the hydrophilic polysaccharide chain are balanced, the HSA molecule enters the particle core to become hydrophobically bound to cholesterol groups to form the NP–HSA complex.

Adsorption of HSA to NPs

For CHAP and CHSP NPs, the recombination of HSA is a complex process also subjected to the charge interaction with HSA under the traction of the hydrophobic driving force. The binding constants of the three kinds of NPs with the same hydrophobic substitution and different surface charge were in the order of CHAP> CHP> CHSP. The electrical properties also play a major part in the formation of NP–HSA. In this process, the formation of the CHSP–HSA complex was blocked by the structure of the NP shell and the repulsive force between the negative charges, which led to their loose connection. During the rapid adsorption and slow recombination, the degree of spiraling of HSA is lower for CHSP NPs than CHP NPs and CHAP NPs. Therefore, the surface charge of NPs not only changes the nature of the particles themselves but also affects the protein complex.

In the current study, we investigated the effect of NP surface charge on the interaction between NPs and proteins (Fig. 10). Three different charges of pullulan NPs with HSA adsorption still showed rapid adsorption and slow recombination. The number of HSA molecules with positively charged CHAP complex was the most, including rapid adsorption of NP–HSA by hydrophobic forces, HSA molecule migration to the center, and the HSA molecules adsorbed on the surface of NPs by charge action. CHP- and CHSP-adsorbed HSA molecules were mainly distributed in the hydrophobic center of NPs, with CHSP adsorbing fewer HSA molecules. The adsorbed number of HSA molecules is related to the hydrophobicity of NPs. The greater the degree of substitution of hydrophobicity, the more HSA is adsorbed [41]. The cholesterol substitutions of the three NPs were the same, and the number of HSA molecules adsorbed by positively charged NPs was the highest, so the adsorption of NPs and HSA was related to the hydrophobicity and surface charge of the NPs.

The surface adsorption capacity between NPs and HSA is also related to the hydrophobicity and charge of NPs. The binding force between HSA and NPs is determined by the hydrophobicity, surface charge, size, and structure of NPs. The α-helicity was decreased most at the beginning of adsorption and the complete CHP–HSA complex. CHP NP has the smallest size and highest density. The CHP NPs migrated toward the center by the hydrophobic traction; the sugar chain of the CHP NP shell was larger to inhibit the migration toward the center. The extension of the peptide chain of HSA is larger, with the α -helix decreased the most. Although CHAP NPs have hydrophobic and charge forces, they possess relatively large size, loose structure, small resistance in the periphery, small extension of the peptide chain, and small content of the α -helix. Some HSAs remained on the surface of NPs through the charge force of adsorbing, and the α -helical content is also smaller in this part of the HSA. The α -helix content of CHAP decreased less than that of CHP, mainly due to the peptide chain extension-induced central pulling force which led to α-helix content decline. During the process of the CHSP and HSA complexation, the role of the central pulling force has a reverse direction of the charge force, thereby resulting in weakening the center of the migration force. CHSP NPs are larger than CHAP NPs, and the structure of CHAP NPs is loose. Because the adsorbed number of HSA on CHAP is higher than that on CHSP, the decrease of α -helicity in CHSP is less than that in CHAP NPs. Therefore, the interaction between NPs and HSA and the decrease in α -helicity are all related to the size, density, hydrophobicity of substitution, surface charge of the NPs, and number of HSA connections.

After the NPs enter into the blood, protein adsorption affects the functions of NPs, such as the slow and controlled drug release, the travel from the blood circulation passing through the vascular barrier, targeting tissue, and entering cells. NPs interact with the HSA in the body and affect the in vivo behavior of NPs. The number of adsorbed proteins is closely related to the properties of the NPs. HSA adsorbs NPs, which affects the distribution in organs and removal of NPs, thereby altering the concentration of the drug in the body and the efficacy of the drug.

Finally, the properties of NPs, such as size, hydrophobicity, and surface charge, affect the drug release of NPs in vivo. We can design specific materials to perform specific functions with specific protein adsorption.

Conclusions

In this study, three kinds of nano-drug carriers were constructed, CHP, CHSP, and CHAP. The size, charge, drug loading properties of NPs, interaction between NPs and HSA, and drug release were all closely related to charge amount and charge type of nanomaterials. With the same degree of substitution of hydrophobicity, CHAP NPs with larger amino substitutions were the largest, CHSP NPs the second largest, and CHP NPs the smallest. The size and surface charge of the NPs were essential to the coverage of HSA, the binding constant, and the slow drug release. The positively charged CHAP binding constant was the strongest, showing the fastest drug release, and CHP NPs had the highest coverage. The combination of HSA further retarded the drug release of NPs. CHAP NPs adsorbed HSA had the slowest drug release rate.

Afkortingen

CH:

Cholesteric hydrophobically

CHAP:

CH-modified animated pullulan

CHP:

Cholesteric hydrophobically (CH) modified pullulan

CHSP:

CH-modified carboxylated pullulan

DMSO:

Dehydrated dimethyl sulfoxide

HSA:

Human serum albumin

K _b :

The binding constant

MTO:

Mitoxantrone

NP:

Nanoparticle