Oppervlactelading regelt complexvorming van pullulannanodeeltjes met humaan serumalbumine en gecontroleerde medicijnvrijgave

Samenvatting

Nanodeeltjesontwerp hangt af van hoe de oppervlaktechemie de proteïneadsorptie in de bloedstroom beïnvloedt. We synthetiseerden drie pullulan-gebaseerde polymeren—cholesterol-gemodificeerde pullulan (CHP), CH-gemodificeerde geanimeerde pullulan (CHAP), en CH-gemodificeerde gecarboxyleerde pullulan (CHSP)—en vormden nanodeeltjes via dialyse. Dynamische lichtverstrooiing onthulde dat de deeltjesgrootte varieerde met het aantal geladen groepen: CHP (73,1 nm, −0,698 mV), CHAP (116,9 nm, +12,9 mV), en CHSP (156,9 nm, −15,4 mV). Isotherme titratie calorimetrie toonde afzonderlijke thermodynamische profielen voor HSA-binding: bindingsconstanten (K_b) van 1,41 × 10⁴, 27,7 × 10⁴, en 412 × 10⁴ M⁻¹ voor CHSP, CHP, en CHAP, respectievelijk, wat de invloed van de oppervlactelading weerspiegelt. Fluorescentie- en circulair dichroïsme analyses bevestigden dat HSA α-helicale reductie ondergaat bij complexvorming, met CHP die de grootste conformationele verandering induceert. In vitro medicijnvrijgave studies met mitoxantrone toonden aan dat HSA-adsorptie de vrijgave aanzienlijk vertraagde: na 48 u vrijkwamen CHSP–HSA 35,8 %, CHP–HSA 33,9 %, en CHAP–HSA 32,5 %, vergeleken met 53,7 %, 58,5 %, en 63,2 % voor hun vrije nanodeeltjes tegenhangers. Deze resultaten benadrukken dat nanodeeltjesgrootte, oppervlactelading, en proteïne corona-vorming de medicijnvrijgavekinetiek en daarmee de therapeutische effectiviteit cruciaal bepalen.

Achtergrond

Gerichte nano-medicijnafgifte is uitgegroeid tot een hoeksteen van de moderne oncologie, biedend gecontinueerde vrijgave en verminderde systemische toxiciteit. Voor een nanodeeltje (NP) om tumorgeweefte te bereiken, moet het de bloedsomloop navigeren, de vasculaire endotheellijnen doorkruisen, de extracellulaire matrix penetreren, en kankercellen binnendringen. Proteïneadsorptie—met name van hoge-abundante plasma-eiwitten zoals humaan serumalbumine (HSA)—vormt een "proteïne corona" die de NP-biodistributie, cellulaire opname, en medicijnvrijgave kan veranderen. De samenstelling van de corona wordt gedreven door proteïneconcentratie, NP-affiniteit, en oppervlakte-eigenschappen, waaronder lading, hydrofobiciteit, en grootte.

Pullulan, een neutraal polysacharide, kan chemisch gemodificeerd worden om hydrofobe cholesterolgroepen te introduceren, wat amphiele polymeren oplevert die zich zelf assembleneren tot kern-schelp NPs. Eerder werk toonde aan dat cholesterol-gemodificeerde pullulan (CHP) anticancermedicijnen kan encapsuleren en dat HSA bindt aan CHP via hydrofobe interacties. Op dit opbouwden we twee extra varianten: CH-gemodificeerde geanimeerde pullulan (CHAP) met aminogroepen en CH-gemodificeerde gecarboxyleerde pullulan (CHSP) met carboxylgroepen. Deze modificaties maken systematische verkenning mogelijk van hoe de oppervlactelading de proteïneadsorptie en medicijnvrijgave beïnvloedt.

Methoden

Materialen

HSA (Sigma-Aldrich), N,N-imidazol, ethyleendiamine, succinische anhydride, en andere reagenties waren analytische graad.

Synthese van CHP, CHSP, en CHAP

CHP werd bereid door pullulan te esterificeren met cholesterol succinaat (CHS) in DMSO, gevolgd door zuivering. CHAP werd verkregen door CHP te laten reageren met N,N-diimidazol en ethyleendiamine; CHSP werd gesynthetiseerd via succinische anhydride koppeling. Structurele bevestiging werd uitgevoerd door FTIR en ¹H-NMR, wat cholesterol substitutiegraad van 4,5 % (CHP), 7,8 % (CHSP), en 14,1 % (CHAP) opleverde.

Bereiding en Karakterisering van NPs

Nanodeeltjes werden gevormd door dialyse van de polymeren in DMSO tegen water, gevolgd door filtratie (0,45 µm). Grootte en zeta-potentiaal werden gemeten door dynamische lichtverstrooiing (DLS). CHP, CHAP, en CHSP NPs vertoonden gemiddelde diameters van 73,1 nm, 116,9 nm, en 156,9 nm, met zeta-potentialen van −0,698 mV, +12,9 mV, en −15,4 mV, respectievelijk.

ITC

Isotherme titratie calorimetrie kwantificeerde de thermodynamica van HSA-binding aan elk NP-type bij 25 °C. Exotherme binding werd waargenomen voor CHP en CHSP, terwijl CHAP een initiële exotherme fase vertoonde gevolgd door endotherme binding, wat de wisselwerking van hydrofobe en electrostatische krachten weerspiegelt.

Fluorescentiespectroscopie

HSA fluorescentie (excitati 280 nm, emissie 290–450 nm) werd gemonitord na menging met elk NP-type. Kwetsingsanalyse met een gemodificeerde Stern-Volmer vergelijking leverde bindingsconstanten van 2,02, 2,99, en 4,72 × 10⁵ M⁻¹ voor CHSP, CHP, en CHAP, respectievelijk, wat de sterkste interactie voor het positief geladen CHAP aangeeft.

Circulair Dichroïsme Analyse

CD-spectra (200–250 nm) beoordeelden veranderingen in HSA secundaire structuur na NP-binding. α-Helicale inhoud daalde van 55 % (vrij HSA) naar 48–52 % voor de complexen, met de meest uitgesproken reductie voor CHP–HSA.

Medicijnvrijgave In Vitro

Mitoxantrone (MTO) werd in elk NP geencapsuleerd via dialyse. Vrijgaveprofielen werden gemeten in PBS bij 37 °C, met en zonder HSA (0,1 mg/mL). Het vrije medicijn vrijkwam 99,8 % binnen 4 u. Voor NPs alleen waren de 48-u vrijgaveratio's 53,7 % (CHP), 58,5 % (CHAP), en 63,2 % (CHSP). HSA-aanwezigheid verlaagde deze tot 33,9 % (CHP–HSA), 32,5 % (CHAP–HSA), en 35,8 % (CHSP–HSA).

Resultaten

Karakterisering van CHP, CHSP, en CHAP Polymeren

FTIR-spectra bevestigden succesvolle functionalisatie: ester carbonylpieken bij 1731 cm⁻¹ voor CHP, amide pieken bij 1648 cm⁻¹ voor CHAP, en carboxylpieken bij 1710 cm⁻¹ voor CHSP. NMR-analyse kwantificeerde substitutiegraad.

Eigenschappen van CHP, CHSP, en CHAP NPs

Grootte en oppervlactelading beïnvloedden direct de NP-zelfassemblage: negatief geladen CHSP en positief geladen CHAP vormden grotere deeltjes (156,9 nm en 116,9 nm) vergeleken met neutrale CHP (73,1 nm). Zeta-potentialen weerspiegelden de geïncorporeerde functionele groepen (−15,4 mV, +12,9 mV, −0,698 mV). De aanwezigheid van geladen groepen verstorende kernpakking, wat losser, grotere structuren opleverde.

Thermodynamische Analyse

ITC-gegevens onthulden exotherme binding voor CHP (ΔH = 42,8 kJ mol⁻¹) en CHSP (ΔH = 80,4 kJ mol⁻¹), en een gemengd exo-endo profiel voor CHAP (ΔH = 22,4 kJ mol⁻¹). Entropieveranderingen suggereerden gemakkelijkere HSA-binding aan CHP en CHAP (ΔS = 0,251 kJ mol⁻¹ K⁻¹ en 2,775 kJ mol⁻¹ K⁻¹) dan CHSP (ΔS = 0,201 kJ mol⁻¹ K⁻¹).

Fluorescentiespectroscopie

Fluorescentiekwetsing bevestigde een snelle adsorptiefase gevolgd door langzamere complexvorming. De bindingsconstanten afgeleid van Stern-Volmer analyse kwamen overeen met ITC-resultaten, wat de dominante rol van electrostatiek voor CHAP en hydrofobiciteit voor CHP benadrukt.

CD Spectrum Analyse

CD-metingen toonden progressieve verlies van α-helix bij complexvorming: CHP–HSA daalde naar 48,0 %, CHAP–HSA naar 48,6 %, en CHSP–HSA naar 52,0 %. De snelste heliciteitsreductie trad op voor CHP, consistent met zijn compacte, dichtgepakte kern.

Medicijnvrijgave

HSA-adsorptie vertraagde consistent de medicijnvrijgave over alle NP-typen. De hiërarchie van vrijgaveratio's (48 u) matched de volgorde van NP-grootte en oppervlactelading: CHSP > CHAP > CHP voor vrije NPs, en CHSP–HSA > CHP–HSA > CHAP–HSA voor proteïne-gebonden complexen. Deze bevindingen benadrukken hoe de proteïne corona diffusie- en degradatiepaden moduleert.

Discussie

Onze data bevestigen dat de oppervlactelading een doorslaggevende factor is in HSA corona-vorming en daaropvolgende medicijnvrijgave. Het positief geladen CHAP vormde het sterkste NP–HSA-complex, toeschrijfbaar aan gecombineerde electrostatische aantrekking en hydrofobe ankering. In tegenstelling, het negatief geladen CHSP vertoonde de zwakste binding, beperkt door ladingafstoting en een meer poreuze schelp die proteïnemigratie naar de kern vertraagde. Neutrale CHP nam een intermediaire positie in, met de hoogste HSA-dekking door zijn compacte, hydrofobe kern.

Deze interacties beïnvloeden het in-vivo lot van medicijn-geladen NPs. Een dichte proteïne corona kan endotheellijndoorkruising belemmeren, orgaandistributie veranderen, en cellulaire opname verminderen. Door de oppervlactelading af te stellen, kunnen we de corona-samenstelling moduleren en dus de farmacokinetiek en therapeutische vensters fijnstellen.

Conclusies

We synthetiseerden met succes drie pullulan-gebaseerde nanodeeltjes met distincte oppervlacteladingen. Grootte, lading, en hydrofobiciteit bestimmten gezamenlijk HSA-adsorptie, bindingssterkte, en medicijnvrijgavekinetiek. Positief geladen CHAP vertoonde de sterkste proteïnebinding en de langzaamste medicijnvrijgave, terwijl neutrale CHP de hoogste proteïnedekking vertoonde maar de snelste vrijgave onder vrije NPs. Deze inzichten bieden een blauwdruk voor het ontwerpen van nanodragers met afgestemde proteïne corona-profielen om gerichte afgifte en gecontroleerde vrijgave te optimaliseren.

Afkortingen

EDX

Energiedispersieve röntgenspectroscopie

SEM

Scanning elektronenmicroscoop

TEM

Transmissie elektronenmicroscopie

XRD

Röntgendiffractie