Toxiciteitsonderzoek perovskiet nanodeeltjes op epitheelcellen van de luchtwegen

Abstract

Onderzoek naar de toxiciteit van nanodeeltjes heeft zich de afgelopen jaren ontwikkeld vanwege hun toenemende prevalentie in gewone alledaagse materialen. Van verschillende nanodeeltjes is gemeld dat ze de afscheiding van slijm bevorderen en induceren, wat mogelijk kan leiden tot schade aan de luchtwegen en ademhalingscomplicaties. Lanthaan strontium manganiet (LSM) is een nanodeeltje dat veel wordt gebruikt in door zonne-energie geoxideerde brandstofcellen (SOFC's) vanwege zijn hoge elektrische geleidbaarheid, hoge elektrochemische activiteit voor O₂ reductiereactie, hoge thermische stabiliteit en compatibiliteit van SOFC-elektrolyten, en vooral de microstructurele stabiliteit en prestaties op lange termijn. Er zijn zeer weinig onderzoeken uitgevoerd naar de toxiciteit van LMS, dus het effect ervan op luchtwegcellen werd in dit onderzoek onderzocht. Na behandeling van luchtpijpcellen met toenemende concentraties van LSM, variërend tot 500 μg/ml, ontdekten we dat het een matig effect heeft op de levensvatbaarheid van de cellen, ROS-productie, cytochroom C en caspase 3-expressie. Ondanks de minimale impact op de vermelde apoptose-inducerende eigenschappen, illustreerde LSM een remmend effect op de slijmsecretie. We kregen een dalende trend in slijmsecretie met een verhoogde concentratie van de LSM-behandeling. Over het algemeen maakte de vooruitgang van LSM in SOFC's een toxiciteitsonderzoek noodzakelijk, en hoewel het geen significante toxiciteit voor luchtpijpcellen vertoont, vermindert LSM de slijmsecretie en kan het mogelijk interfereren met de luchtwegklaring.

Inleiding

Lanthaan strontium manganiet (LSM) is een nanodeeltje uitgerust met een op perovskiet gebaseerde kristalstructuur. Het neemt de algemene vorm aan van "ABO3", waarbij lanthaan en strontium zich in de A-plaats en mangaan in de B bevinden. Dit leidt tot de algemene formule van La_1 − x Sr_x MnO₃ , waarbij x staat voor de strontiumdoteringsniveaus die afhankelijk zijn van de toepassing van het nanodeeltje. LSM kan in poedervorm worden gebruikt als tapegieten, lucht/thermisch/plasmaspray en voor brandstofceltoepassingen [1,2,3,4].

Bij de recente inspanningen om de vervuiling te verminderen en een op waterstof gebaseerde economie te creëren, is veel onderzoek gericht geweest op vaste oxidebrandstofcellen (SOFC's) [5, 6]. LSM-perovskieten hebben op hun beurt de aandacht van het onderzoek getrokken vanwege hun belangrijke rol in SOFC's als een van de belangrijkste elektrodematerialen [4, 7]. LSM-nanodeeltjes zijn bolvormige metaaldeeltjes met een hoog oppervlak die eruitzien als een bruin of zwart kristallijn poeder. Hoewel er talloze onderzoeken zijn uitgevoerd naar de mechanische en elektrische eigenschappen van LSM [1, 3, 8, 9], is er maar weinig onderzoek gedaan naar de biologische effecten ervan [10,11,12]. Talloze nanodeeltjes hebben de neiging geïllustreerd om de afscheiding en accumulatie van slijm te bevorderen, en zijn dus gekoppeld aan aandoeningen van de luchtwegen [13, 14]. Onderzoek naar LSM-nanodeeltjes laat veelbelovende ideeën zien voor biomedische toepassingen [15,16,17]. Recentelijk heeft onderzoek naar LSM zijn potentieel voor antikankertherapie aangetoond [12, 18, 19]. Met de juiste syntheseprocedures en oppervlaktemodificaties heeft LSM het vermogen om zowel een MRI-contrast- en hyperthermiemiddel als een medicijndrager te zijn [20,21,22]. De mogelijkheid van toxiciteit moet echter worden beoordeeld voorafgaand aan verdere medische toepassingen. Er zijn slechts beperkte onderzoeken naar het toxiciteitseffect van perovskiet [10, 23] en er is tot nu toe geen significant toxiciteitseffect gerapporteerd.

In deze studie hebben we de toxiciteit van LSM-nanodeeltjes onderzocht, terwijl ze werden blootgesteld aan primaire tracheale epitheelcellen om het toxiciteitsconcentratiebereik te bepalen. Vervolgens analyseerden we de productie van reactieve zuurstofspecies (ROS) en mitochondria-schade samen met de slijmsecretierespons met fluorescentiemicroscopie [24]. Het niveau van apoptose-progressie met of zonder LSM-nanodeeltjes werd onderzocht met cytochroom C- en caspase 3-assays [25].

Resultaten en discussies

NPs-karakterisering en cellevensvatbaarheidstest

De toxiciteit van nanodeeltjes is afhankelijk van de fysieke eigenschappen, zoals geometrie, grootteverdeling en oppervlakte. Voorafgaand aan de toxiciteitsexperimenten werden deze kenmerken geanalyseerd met SEM. De LSM-nanodeeltjes illustreerden een aanzienlijke oppervlakteruwheid en werden verdeeld in aggregaten van verschillende groottes, met een diameter van ongeveer 35 nm tot 200 nm (Fig. 1).

SEM-afbeelding van fysieke kenmerken van LSM. De enkele deeltjesgrootte was ongeveer 35 nm in diameter en de aggregatie van LSM-grootte varieerde van 200 nm tot enkele μm

We hebben talloze toxiciteitsexperimenten uitgevoerd op luchtwegcellen van de luchtpijp met een verscheidenheid aan NP's in onze vorige studie [26, 27], daarom werd deze cellijn gekozen voor deze biologische studie. Om de algehele toxiciteit van LSM op luchtpijpcellen te beoordelen, werd de colorimetrische CCK8-cellevensvatbaarheidstest uitgevoerd [25, 27]. Zoals te zien is in Fig. 2; cellevensvatbaarheidstest, was er een dramatische verandering in de populatie die zich voordeed van 50 tot 100 μg/ml-concentraties van LSM. Bij LSM-concentraties van meer dan 100 μg/ml bleef de populatie echter relatief stabiel, zonder significante veranderingen.

Levensvatbaarheid van luchtpijpcellen na verhoging van de LSM-concentratie, hier weergegeven als Log [ng/ml]. De colometrische CCK8-cellevensvatbaarheidstest werd gebruikt om te meten, en het gemiddelde per concentratietoename werd berekend. (n> 6)

Productie van ROS- en mucine-afgifte

ROS-productie zet apoptose aan en draagt zo bij aan cytotoxiciteit van nanodeeltjes. Volgens Fig. 3; ROS-productie, het verhogen van de concentratie van LSM heeft geen grote invloed op de ROS-productie. De 250 μg/ml LSM-concentratie verschilde het meest van de controle, maar de afwijking was niet significant, wat aangeeft dat LSM geen opmerkelijk effect heeft op de ROS-productie.

ROS-productie van luchtpijpcellen na toenemende LSM-concentraties. Verhoudingen van ROS-productie per elke LSM-concentratiebehandeling werden berekend door te vergelijken met de controlegroep. (n> 100)

Uit Fig. 4; mucus bata was er na een behandeling van 15 minuten geen significant effect op de levensvatbaarheid van de cellen, en naarmate de LSM-concentraties toenamen, nam de mucinesecretie af. De afgifte van mucine werd tot 40% verminderd wanneer cellen werden behandeld met 500 g/ml LSM, en zou mogelijk verder kunnen worden verminderd met nog hogere concentraties LSM. Deze vermindering suggereert dat LSM een remmend effect heeft op de afgifte van slijm.

Mucinesecretie resultaten na 15 minuten behandelingen van toenemende LSM-concentraties. De verhoudingen werden berekend voor elke LSM-concentratie door deze te vergelijken met de controlegroep. Beoordeling van mucine-uitscheidingen aan het celoppervlak werd gedaan door ELLA (enzym-gekoppelde lectine-assay). (*:n> 6, p < 0.05)

Mitochondriale schade en apoptoseprocessen

Het vroege stadium van apoptose wordt meestal vertegenwoordigd door mitochondriale schade. Om dit fenomeen te analyseren, werd de JC-1-kleurstof gebruikt als een mitochondriale membraanpotentiaalindicator. De intensiteitsverhouding die door de JC-1-kleurstof wordt geïnduceerd, correleert met het verlies van mitochondriale integriteit, en volgens figuur 5, toen de LSM-concentraties werden verhoogd, nam de mitochondriale schade aanzienlijk toe na 100 μg/ml LSM-behandeling. Hoewel de resultaten aantonen dat de schade aan de mitochondriën significant is na 100 μg/ml LSM-behandeling, vertonen caspase3 en cytochroom C een lichte daling, zoals hieronder wordt beschreven. Dit resultaat suggereert dat LSM schade aan de mitochondriën kan veroorzaken, maar de cellen hebben nog steeds het vermogen om op een laag niveau te blijven in apoptoseprogressie en de expressie van apoptosemarkers te verminderen.

Fluorescerende intensiteitsresultaten van JC-1-indicatorkleurstof in vier verschillende behandelingsomstandigheden op luchtpijpcellen om mitochondriale integriteit aan te geven. (*, **, ***:n> 100, p < 0.05)

Apoptose kan ook worden gemeten door de expressie van cytochroom C en caspase 3. Zoals weergegeven in figuur 6a; apoptose resultaat op cytochroom C, was er een matige afname in apoptose tarieven tussen de verschillende concentraties van LSM en de controlegroep. Deze zelfde trend is te zien in figuur 6b; apoptose resultaat op caspase 3, wat wijst op een zeer minimale toxiciteit als gevolg van LSM. Over het algemeen waren de mitochondriale schade en apoptoseresultaten op luchtweg-tracheacellen als gevolg van LSM erg laag, wat suggereert dat LSM geen significant toxisch effect heeft op trachea-epitheelcellen.

Gemeten apoptose resultaten via a cytochroom C-expressie, b caspase 3 uitdrukking. De verhoudingen werden verkregen per LSM-concentratiebehandeling door vergelijking met de controlegroep (HBSS). (*:n> 100, P < 0.05)

Conclusies

Recente onderzoeken naar nanotoxiciteit hebben veel aandacht getrokken voor de toxische effecten van NP's vanwege hun brede gebruik in industriële en commerciële producten. De grootste zorg van nanotoxiciteit is te wijten aan het genereren van ROS. Bijvoorbeeld TiO₂ NP's worden beschouwd als een soort kankerverwekkend materiaal vanwege de grote hoeveelheid gegenereerde ROS die kan leiden tot celdood en mutaties [28]. Er zijn verschillende soorten materialen en verbindingen die als perovskiet zijn geclassificeerd en die de afgelopen jaren in verschillende toepassingen zijn gemeld. Dit is de eerste studie om de LSM-toxiciteit te bepalen op epitheelcellen van de luchtwegen, die een van de belangrijkste wegen zijn voor cellen om NP's op te nemen. Deze studie had tot doel het effect van LSM op luchtpijpcellen te onderzoeken in een poging om de toxiciteit ervan te beoordelen. De resultaten toonden aan dat LSM geen significant effect heeft op de progressie van apoptose gemeten door cytochroom C- en caspase 3-expressies, mitochondria-integriteit gemeten door JC-1-fluorescentie, celoverleving en ROS-productie. De behandeling vertoonde echter een onderdrukkend effect op de slijmsecretie, waardoor de slijmproductie afnam naarmate de LSM-concentraties werden verhoogd. Uiteindelijk bleek uit de resultaten van deze studie dat LSM niet-toxisch was voor epitheelcellen van de luchtwegen, waardoor er geen significante veranderingen in de apoptosestadia werden veroorzaakt, en bovendien de slijmsecretie werd verlaagd die de levensvatbaarheid van de cellen in gevaar kan brengen. Dit suggereert het potentieel van LSM om de klaring van slijm in de luchtwegen te verstoren. In onze studie hebben we het toxiciteitspotentieel voor de LSM NP's aangetoond en de resultaten laten zien dat het potentiële risico van het toxische effect relatief lager is dan bij andere NP's die voor industriële en commerciële toepassing waren gebruikt. Er moet echter verder onderzoek worden gedaan om te bepalen of LSM veilig kan worden opgenomen als een actief ingrediënt in commerciële zonne- en energieopslagproducten.

Materialen en methoden

Cultuur van primaire luchtpijpcellen

De primaire epitheelcellen van de trachea werden geïsoleerd uit normaal bronchiaal epitheel van runderen volgens eerder gepubliceerde protocollen [26]. Cellen werden gekweekt en bewaard in serumvrij medium (SFM) aangevuld met vooraf gekwalificeerde menselijke recombinante epidermale groeifactor 1-53 (EGF 1-53) en runderhypofyse-extract (BPE) (Thermo Fisher). De primaire luchtpijpcellen werden gekweekt in met collageen () voorgecoate Falcon-platen van 15 cm en geïncubeerd in een bevochtigde incubator bij 37 ° C, 5% CO₂ . Celtellingen werden uitgevoerd met behulp van trypanblauw (Sigma) uitsluiting en een Bright-Line Hemocytometer. Cellen werden gepasseerd toen de confluentie 80% bereikte.

Celvoorbereiding

Cellen werden gezaaid bij 5 × 10⁴ cellen per putje in een met collageen gecoate plaat met 96 putjes (75% samenvloeiing) voor cellevensvatbaarheidstesten, 5 × 10⁵ cellen per putje in een met collageen gecoate plaat met 4 putjes (75% samenvloeiing) voor Ca²⁺ signalering, ROS en mitochondria-analyse. Na het zaaien werden de cellen 24 uur geïncubeerd in SFM aangevuld met vooraf gekwalificeerd humaan recombinant EGF 1-53 en BPE (Thermo Fisher). Na 24 uur incubatie werd het medium uit de cellen verwijderd en werd de kweek tweemaal gespoeld met fosfaatgebufferde zoutoplossing. PBS-was werd vervangen door nanodeeltjes gesoniceerd in Ca²⁺ met Hanks of Ca^2 + -gratis Hanks.

Cell Viability Assay

Fotocolorimetrische bepaling van cytotoxiciteit werd beoordeeld met behulp van CCK-8-kleurstof (Dojindo Laboratories, Tokyo, Japan) [27, 25]. CCK-8, dat niet-radioactief is, biedt een colorimetrische bepaling van het percentage levensvatbare cellen dat is onderworpen aan variërende NP-concentraties. Deze testkit meet de metabole activiteit van dehydrogenasen in de levensvatbare cellen om WST-8-tetrazoliumzout om te zetten in in water oplosbaar formazan. Het werd bereid door CCK-8 in HBSS toe te voegen in een verdunning van 1:10. Cellen werden gespoeld met HBSS en 100 μL van de kleurstof werd in elk putje geladen. Vervolgens werden de cellen geïncubeerd in een 37 ° C, 5% CO₂ broedmachine voor 6 uur. De absorptie werd gemeten met behulp van een Thermo Multiscan EX-plaatlezer (Thermo Multiskan EX-plaatlezer, VWR, CA, VS) bij een optische dichtheid van 450 nm (referentie van 650 nm). Een gemiddelde werd berekend uit drie afzonderlijke datasets voor elke concentratie, inclusief de onbehandelde controle, van drie onafhankelijke experimenten en werd getabelleerd als een percentage van de onbehandelde controle.

De levensvatbaarheid van de cellen werd berekend door \( \frac{OD_{450\mathrm{treatment}}-{OD}_{650\mathrm{treatment}}}{O{D}_{450\mathrm{control}}-O {D}_{650\mathrm{control}}}\ast 100\% \).

Lanthaan Strontium Manganite Nanodeeltje

Lanthaan strontium manganiet (La_0,15 Sr_0,85 MnO₃ ) (LSM) nanodeeltjes (35 nm, 99,5%) (Nanostructured &Amorphous Materials Inc.) werden in dit onderzoek gebruikt. Alle NP-monsters werden vóór gebruik gesoniceerd. De gebruikte concentraties waren 500 g/ml, 250 g/ml, 100 μg/ml en 50 g/ml. Het bereik van de gebruikte concentraties werd bepaald volgens de concentraties van TiO₂ NP's gevonden in eerdere rapporten (Dowding et al. 2014; Dowding et al. 2012; Gurr et al. 2005; Hirst et al. 2009; Niu et al. 2011). De LSM NP's werden gereconstitueerd met Hanks 'oplossing (Invitrogen, CA, VS) voordat ze afzonderlijk werden getest en onmiddellijk voor gebruik ongeveer 5 minuten gesoniceerd.

Scanning-elektronenmicroscoop

LSM NP's werden bereid tot 5 μg / ml en druppelgegoten op een schone siliconenwafel en aan de lucht gedroogd om resterend water te verwijderen. De grootte van NP's werd onafhankelijk bevestigd met behulp van een scanning elektronenmicroscoop (Gemini SEM, Zeiss).

Intracellulaire productie van reactieve zuurstofsoorten

De productie van reactieve zuurstofspecies (ROS) werd geëvalueerd door fluorescentiemicroscopie met behulp van oxidatie van CM-H2DCFDA-kleurstof (Invitrogen, CA, VS) [24]. De cellen (1 x 105 cellen / putje) werden 24 uur gekweekt voordat ze werden gespoeld met PBS-oplossing. Monsters werden gekleurd door gedurende 30 minuten een laadbuffer met 2 μM gereconstitueerde CM-H2DCFDA-kleurstof in medium aan te brengen. De gekleurde monsters werden driemaal gewassen met PBS en gedurende 5 minuten hersteltijd gereserveerd voor cellulaire esterasen om de AM- of acetaatgroepen te hydrolyseren en de kleurstof gevoelig te maken voor oxidatie. Hanks 'buffer, die LSM NP's bevat in concentraties variërend van 0 tot 500 g / ml in 50 g / ml, werd vervolgens gedurende 15 minuten bij 37 ° C met de cellen geïncubeerd, gevolgd door PBS-wassen. Fluorescerende beelden van ROS gegenereerd in cellen werden vastgelegd en geanalyseerd door de verhouding van toename in fluorescentie-intensiteit tussen verschillende behandelingen en controlegroepen te berekenen.

Meting van mitochondriënschade

Het mitochondriale innerlijke transmembraanpotentieel werd beoordeeld met behulp van polychromatisch 5,5′,6,6′-tetrachloor-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidoazolyl-carbocyaniojodide (JC-1 Sigma) [25]. JC-1 is een lipofiel fluorescerend kation dat kan worden opgenomen in het mitochondriale membraan, waar het afhankelijk is van membraanpotentiaalaggregaten. Aggregatie verandert de fluorescentie-eigenschappen van JC-1 en verschuift van groene naar rode fluorescentie. Intacte mitochondriale membranen gekleurd met JC-1 vertonen een uitgesproken rode mitochondriale fluorescentie die detecteerbaar is door fluorescentiemicroscopie. Een afbraak van het mitochondriale membraanpotentieel resulteert in een daaropvolgende afname van groene fluorescentie en toename van rode fluorescentie. Voorafgaand aan NPs-stimulatie werden cellen tweemaal gewassen met PBS en 30 minuten geïncubeerd met JC-1-kleuringsreagens (1:1000) in medium bij 37 ° C, gevolgd door wassen met PBS en celbehandeling. Het mitochondriale membraanpotentieel werd gedetecteerd met fluorescentiemicroscopie met een tijdsinterval van 10 min.

Meting van [Ca²⁺ ]_c

Alle experimenten werden uitgevoerd in donkere omstandigheden. De cellen werden geladen met een Rhod-2 AM-kleurstof (1 μM) (K _d = 570 nM, λ_Ex = 552 nm, en λ_Em = 581 nm) (Invitrogen, CA, VS) gedurende 45 min. De cellen werden vervolgens tweemaal gewassen met PBS voordat ze werden geïncubeerd met Hanks-buffer en behandeld met de juiste NP's-concentratie. Alle Ca²⁺ signaleringsexperimenten werden uitgevoerd in een thermo-gereguleerde toestand bij 37 ° C gemonteerd op een Nikon-microscoop (Nikon Eclipse TE2000-U, Tokyo, Japan) [24, 25, 27] (Chen et al. 2011).

Mucinesecretie en ELLA

De cellen werden gezaaid bij 1 × 10⁶ cellen per putje in een plaat met 6 putjes en 24 uur gekweekt. De primaire cellen van de luchtpijp werden vervolgens gespoeld met PBS en gedurende 15 minuten gestimuleerd met de overeenkomstige LSM NP-concentraties (500 g/ml, 250 g/ml en 100 μg/ml) bereid in PBS. Het supernatant dat uitgescheiden mucine bevatte, werd verzameld en kort gecentrifugeerd bij 8000 tpm om de resterende NP's te verwijderen. Het supernatant werd vervolgens een nacht bij 4 ° C geïncubeerd in een plaat met 96 putjes (Nunc MaxiSorp, VWR, CA, VS). Daarna werd de plaat met 96 putjes gewassen met PBST (PBS + 0,05% Tween-20) en vervolgens geblokkeerd met 1% BSA. De plaat met 96 putjes werd opnieuw gewassen met PBST en geïncubeerd met lectine (tarwekiemagglutinine, WGA) (Sigma-Aldrich, MO, VS), geconjugeerd aan mierikswortelperoxidase (HRP; 5 mg/ml) (Sigma-Aldrich, MO, VS), gedurende 1 uur bij 37 ° C. Het substraat, 3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine (TMB; Sigma-Aldrich, MO, VS), werd bij kamertemperatuur aan elk putje toegevoegd, gevolgd door H₂ SO₄ (Sigma-Aldrich, MO, VS) om de reactie te beëindigen. De optische dichtheid werd gemeten bij 450 nm (Chen et al. 2011; Kemp et al. 2004).

Voorbereiding van de immunosorbentassay (ELISA)

De cellen werden gezaaid met een dichtheid van 1 × 10⁶ celdichtheid in een plaat met 6 putjes en 24 uur gekweekt. Luchtpijpcellen werden vervolgens gespoeld met PBS. Cellen werden gedurende 2 uur gestimuleerd met de juiste LSM NP's-concentraties (0-500 μg / ml) bereid in PBS. Cellysering werd bereid door het Peirce RIPA cellysaatreagens en het lysaat werd verzameld en overgebracht naar een microcentrifugebuis. De monsters werden gecentrifugeerd bij ~-14.000×g gedurende 15 minuten om de celresten en NP's te pelleteren. Het supernatant werd vervolgens een nacht bij 4 ° C in een plaat met 96 putjes geïncubeerd. Daarna werd de plaat met 96 putjes gewassen met PBST (PBS + 0,05% Tween-20) en vervolgens geblokkeerd met 1% BSA. De plaat met 96 putjes werd opnieuw gewassen met PBST en 2 uur bij kamertemperatuur geïncubeerd met anti-caspase 3 van konijnen, antilichaam in actieve vorm (Millipore, polyklonaal antilichaam) en anti-cytochroom C van muis (Invitrogen, monoklonaal antilichaam). Gebruik vervolgens secundair antilichaam (anti-konijn en anti-muis geconjugeerde mierikswortelperoxidase, HRP, Millipore) en volg dezelfde procedure als ELLA om de absorptie-intensiteit te meten [25].

Beeldanalyse

Beeldanalyse werd uitgevoerd met een omgekeerde Nikon Eclipse TE2000-U fluorescentiemicroscoop. Elke foto werd genomen met een vergroting van × 10 en geanalyseerd met Simple PCI (Compix Inc., Imaging Systems, Sewickle, PA, VS). De getoonde gegevens voor cytosolische calciumconcentraties worden weergegeven door Rhod-2-fluorescentie. Er werden elke 0,5 s beelden gemaakt en voor analyse automatisch geconverteerd naar grijswaarden. Eenvoudige PCI leverde de pixelintensiteiten (gemiddelde grijswaarde) van geselecteerde gebieden, elk met een gemiddelde fluorescentie per frame voor 200 cellen van meer dan 100 s (~ 200 frames) onmiddellijk na stimulatie van nanodeeltjes. De getoonde gegevens voor immunofluorescentiekleuring zijn een weergave van eiwitexpressie na 1-2 uur behandelingen met grafeen. Alle experimenten zijn ten minste drie keer onafhankelijk uitgevoerd en bevestigd.

Statistische analyse

De gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde ± SD. Elk experiment werd ten minste drie keer onafhankelijk uitgevoerd. Statistische significantie werd bepaald met behulp van one-way ANOVA-testanalyse met p waarden < 0,05 (GraphPad Prism 4.0, GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, VS).