Goudnanodeeltje-Medicijn Interacties Veroorzaken Acute Nierschade in Muizen: Een Grootte-afhankelijke Toxiciteitsstudie

Samenvatting

Nanomaterialen zijn innovatieve materialen met veel nuttige eigenschappen, maar er is bezorgdheid over hun onbekende effecten op levende organismen. Goudnanodeeltjes worden vanwege hun uitstekende eigenschappen breed toegepast als industriële materialen. De potentiële biologische gevaren van goudnanodeeltjes zijn onbekend. Daarom onderzochten we in deze studie de in vivo-effecten van goudnanodeeltjes met diameters van 10, 50 en 100 nm (GnP10, GnP50 en GnP100) en hun interacties met medicijnen in muizen om hun veiligheid in zoogdieren te verduidelijken. Cisplatina, paraquat en 5-aminosalicylzuur veroorzaken bijwerkingen aan lever en nieren in muizen. Geen hepatotoxiciteit of nefrotoxiciteit werd waargenomen wanneer de goudnanodeeltjes apart via de staartvleet werden toegediend. In tegenstelling tot dit, veroorzaakte co-administratie van GnP-10 met cisplatina, paraquat of 5-aminosalicylzuur bijwerkingen aan de nieren. Dit suggereert dat goudnanodeeltjes met een deeltjesgrootte van 10 nm potentieel nefrotoxisch zijn door hun interactie met medicijnen.

Inleiding

Nanotechnologie speelt een steeds belangrijker rol in de eenentwintigste eeuw, met nanomaterialen als basis voor de vooruitgang in dit veld. Recente ontwikkelingen in de productie van nanodeeltjes hebben het wereldwijd gebruik van innovatieve nanomaterialen vergemakkelijkt. Nanomaterialen hebben een diameter van 100 nm of minder en omvatten goud, zilver, silica, platina en titaniumdioxide nanodeeltjes, evenals fullerenen en koolstofnanobuizen. Deze materialen vinden toepassing in elektronische opslagtechnologie, gen-/regeneratieve geneeskunde en elektronische apparaten, en vormen de fundamenten van nieuwe industrieën. Echter, nanodeeltjes zoals PM2.5 veroorzaken ernstige milieuverontreiniging, respiratoire ziekten zoals astma en ischemische hartziektes. Verder kunnen dieseldeeltjes die door auto's worden uitgestoten biologische effecten hebben door de hersenen en reproductieve organen binnen te dringen, vezelvormige fijne deeltjes zoals asbest induceren mesothelioom, en industriële vezelvormige nanomaterialen zoals koolstofnanobuizen kunnen de menselijke gezondheid negatief beïnvloeden. Er blijven dus veel onbekenden over de biologische effecten van nanodeeltjes.

Goud (Au) heeft een lage ionisatieneiging en hoge stabiliteit en wordt sinds de oudheid als edelmetaal voor decoratieve doeleinden gebruikt. Recent ontwikkelde goudnanodeeltjes worden breed toegepast in medische en technische toepassingen vanwege hun karakteristieke optische eigenschappen, en hun uitstekende opto-elektronische eigenschappen hebben geleid tot hun gebruik in organische zonnecellen, sensorprobes en geleidende materialen. Goudnanodeeltjes worden in de chemische industrie als katalysatoren voor acrylaat-harsynthese gebruikt. Ze vertonen ook superieure katalytische activiteit bij lage temperaturen voor het oxideren van CO vergeleken met platina-nanodeeltjes, wat resulteert in hun gebruik als uitlaatgaskatalysatoren. Verdere toepassingen van goudnanodeeltjes worden verwacht, maar er is weinig onderzoek gedaan naar de toxiciteit van goudnanodeeltjes en hun potentiële interactie met medicijnen.

Het veld van de nanotechnologie breidt uit naarmate onderzoekers de veiligheid, farmacologie en farmacokinetiek van nanodeeltjes verkennen. Silica-nanodeeltjes zijn aangetoond cytotoxisch, hepatotoxisch en placenta-schadelijk te zijn, en koolstofnanobuizen kunnen longmesothelioom induceren. Er is echter weinig bekend over de farmacologische effecten die voortvloeien uit interacties tussen nanodeeltjes en medicijnen. In deze studie onderzochten we de toxiciteit van gouddeeltjes van 10, 50 en 100 nm in muizen om hun veiligheid in zoogdieren te verduidelijken. Daarnaast onderzochten we de effecten van deze nanodeeltjes op de toxiciteit van paraquat (PQ, een bekende hepatotoxine en nefrotoxine), cisplatina (CDDP, een breed toegepaste antitumorale stof) en 5-aminosalicylzuur (5-ASA, een veelvoorkomend anti-inflammatoir middel).

Resultaten en Discussie

We maatten eerst de deeltjesgroottes van de goudnanodeeltjes met een Zetasizer en observeerden de deeltjes met transmissie-elektronenmicroscopie (Fig. 1a, b, c). De gemiddelde diameters van de GnP10, GnP50 en GnP100 nanodeeltjes waren respectievelijk 15,7 ± 7,0, 53,3 ± 14,2 en 97,0 ± 27,1 nm (Supplemental Fig. 1). Verder aggregeren goudnanodeeltjes bij meting met elektronenmicroscopie, maar niet wanneer ze aan muizen worden toegediend. Daarnaast maatten we de goudionconcentratie met ICP-MS, maar er werden geen ionen gedetecteerd (gegevens niet getoond). De oppervlakken van de goudnanodeeltjes waren gemodificeerd met citroenzuur om de affiniteit van de nanodeeltjes voor water te verhogen, maar deze modificatie vertoonde geen andere functionaliteit.

We onderzochten of GnP hepatotoxiciteit en nefrotoxiciteit veroorzaakt door een maximale dosis van 4 mg/kg aan muizen via de staartvleet toe te dienen. Geen hepatotoxiciteit of nefrotoxiciteit werd waargenomen wanneer goudnanodeeltjes apart werden toegediend (Fig. 2). De ALT- en AST-waarden van muizen die alleen GnP10, 50 en 100 kregen (Fig. 2a, b) waren vergelijkbaar met de controlewaarden, net als de BUN- en Cr-waarden. Eenmalige toediening van GnP aan muizen induceerde geen lever- of nierschade, noch schade aan hart, longen of milt (Supplemental Fig. 2), wat aangeeft dat goudnanodeeltjes niet toxisch zijn wanneer ze apart aan muizen worden toegediend.

Lever- en nierschade is gerapporteerd door co-administratie van silica-nanodeeltjes, nanokleien of polystyrene-nanodeeltjes met medicijnen of chemicaliën. We co-administreerden daarom goudnanodeeltjes met PQ (een lever-niertoxine) of de medicijnen CDDP of 5-ASA (die bijwerkingen aan lever en nieren veroorzaken). Figuur 2 toont de resultaten van de interactie tussen goudnanodeeltjes en CDDP. Co-administratie van GnP10 of GnP50 met CDDP verhoogde ALT en induceerde leverschade (Fig. 2a), en co-administratie van GnP10 met CDDP verhoogde BUN en Cr, wat nierschade induceerde (Fig. 2c, d). Vervolgens onderzochten we de interactie tussen GnP en 5-ASA, een breed gebruikt anti-inflammatoir middel dat lever- en nierschade veroorzaakt. Co-administratie van GnP10 of GnP50 met CDDP verhoogde ALT en induceerde leverschade (Fig. 3a), terwijl co-administratie met 5-ASA BUN en Cr verhoogde en nierschade induceerde (Fig. 3c, d). Vervolgens onderzochten we de interactie tussen GnP en PQ, een breed gebruikt landbouwgif dat lever- en nierschade veroorzaakt. Co-administratie van GnP10 en PQ verhoogde BUN- en Cr-spiegels en induceerde nierschade (Fig. 4c, d) maar geen leverschade (Fig. 4a, b). Co-administratie van de kleinste geteste gouddeeltjes, GnP10, met CDDP, 5-ASA of PQ resulteerde in de hoogste ALT-, BUN- en Cr-waarden in deze studie. De 10x grotere deeltjes van GnP100 veroorzaakten geen lever- of nierschade bij co-administratie met CDDP, 5-ASA of PQ. Deze resultaten tonen aan dat GnP toxisch is wanneer deeltjes kleiner dan 100 nm in diameter worden co-administreerd met CDDP, 5-ASA of PQ.

Nierhistologische observaties na co-administratie van GnP10 met CDDP, 5-ASA of PQ (Fig. 5) toonden tubulusschade, wat suggereert de inductie van acute nierschade. Vervolgens maatten we IL-6 en TNF-α in serum om de onderliggende oorzaak van GnP10-geïnduceerde acute nierschade te onderzoeken. Figuur 6 toont serum IL-6-spiegels 3 uur na co-administratie van GnP10 met CDDP, 5-ASA of PQ. IL-6 werd niet gedetecteerd in de groep met alleen GnP10, maar een toename van IL-6 werd waargenomen wanneer GnP10 werd co-administreerd met CDDP, 5-ASA of PQ. TNF-α werd in geen van de groepen gedetecteerd (gegevens niet getoond). Deze resultaten suggereren dat IL-6 betrokken is bij acute nierschade geïnduceerd door GnP10 en CDDP, 5-ASA of PQ.

We onderzochten het effect van co-administratie van goudnanodeeltjes en medicijnen op bijwerkingen (lever- en nierschade). De kleinste deeltjesgrootte, GnP10, induceerde nier- en leverschade bij co-administratie met CDDP, 5-ASA of PQ. We co-administreerden ook GnP10 met paracetamol, streptomycine of tetracycline aan muizen en observeerden geen lever- of nierschade (gegevens niet getoond). We rapporteerden eerder dat silica-nanodeeltjes leverschade induceren, afhankelijk van de deeltjesgrootte, en dat polystyrene-nanodeeltjes leerschade kunnen induceren bij co-administratie met een medicijn, afhankelijk van de deeltjesgrootte. Xia et al. rapporteerden dat kleinere goudnanodeeltjes in vitro meer genotoxisch zijn. Samen genomen worden goudnanodeeltjes hoogtoxisch door interacties met medicijnen naarmate de deeltjesgrootte afneemt.

Co-administratie van GnP10 met cisplatina, 5-ASA of PQ verhoogde IL-6-spiegels (Fig. 6). IL-6 werd niet verhoogd door toediening van alleen GnP10 (Fig. 6) of door toediening van alleen CDDP, PQ of 5-ASA (gegevens niet getoond). IL-6 was eerder gerapporteerd betrokken bij de inductie van lever- en acute nierschade. We geloven dat GnP10 IL-6 induceert, wat op zijn beurt lever- en nierschade induceert, maar het onderliggende mechanisme blijft onduidelijk. Bauza et al. rapporteren dat IL-6 leerschade induceert door transcriptiefactoren in hepatocyten te induceren. Het begrijpen van de betrokkenheid van celspecifieke transcriptiefactoren in IL-6-geïnduceerde lever- en nierschade vereist verdere experimenten over het mechanisme achter de cytotoxiciteit van goudnanodeeltjes.

Recent hebben goudnanodeeltjes aandacht getrokken als functioneel biomateriaal gebruikt in drug delivery systemen, en onderzoek naar kankerbehandeling met goudnanodeeltjes wordt actief uitgevoerd. Anselmo et al. rapporteerden dat PEG-gecoate silica-goudnanodeeltjes de lokale temperatuur verhoogden na absorptie van licht en solide tumoren thermisch oplosten, wat aantoont dat goudnanodeeltjes veelbelovende materialen zijn voor kankerbehandeling. Echter, we vonden dat interactie tussen het anticancermiddel cisplatina en goudnanodeeltjes nierschade induceerde (Fig. 2), wat suggereert dat het gebruik van goudnanodeeltjes in kankerbehandeling onderzoek vereist naar hun veiligheid bij co-administratie met het medicijn.

Conclusies

Samenvattend veroorzaakte GnP10 nierschade bij co-administratie met CDDP, PQ of 5-ASA. GnP50 veroorzaakte nierschade alleen bij co-administratie met 5-ASA, terwijl GnP100 dit niet deed. We hebben aangetoond dat goudnanodeeltjes nierschade kunnen veroorzaken en dat dit effect synergistisch kan worden verergerd door interacties met chemicaliën of medicijnen. Verdere studies op basis van deze gegevens zullen nodig zijn om de toxicologische profielen van nanodeeltjes die voorgesteld worden voor diagnostische of therapeutische toepassingen, volledig te verduidelijken.

Materialen en Methodes

Materialen

Suspensies van citraat-geligandeerde gouddeeltjes van 10, 50 en 100 nm in diameter werden verkregen van NANOCOMPOSIX, INC. (San Diego, CA, VS). De groottedistributies van de deeltjes werden geanalyseerd met een Zetasizer (Sysmex Co., Kobe, Japan) en een TEM JEOL JEM-1011 transmissie-elektronenmicroscoop. De gemiddelde diameters waren 15,7 ± 7,0, 53,3 ± 14,2 en 87,0 ± 27,1 nm (Fig. 1, Supplemental Fig. 1). Waterige suspensies (1 mg/mL) werden grondig gedispergeerd door sonicatie vóór gebruik en met water verlengd. De aanwezigheid van geïoniseerd goud in de goudnanodeeltjessuspensies werd onderzocht met ICP-MS, en er werd geen geïoniseerd goud gedetecteerd. Identieke volumes van elke suspensie werden in muizen geïnjecteerd voor elk experiment. De geometrische groottes van de deeltjes werden gekarakteriseerd met TEM. Paraquat (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, VS), cisplatina en 5-aminosalicylzuur (Wako Pure Chemical Industries, Osaka, Japan) werden opgelost in fysiologisch zout en opgeslagen bij -20 °C tot gebruik. Alle reagentia waren van onderzoeksgraden.

Dieren

Acht weken oude BALB/c mannelijke muizen werden gekocht van Funabashi Farm Co., Ltd. (Chiba, Japan). De dieren werden gehuisvest in een gecontroleerde omgeving (temperatuur 23 ± 1,5 °C; licht 12-uurs licht/donker cyclus) met vrije toegang tot standaard knaagdierenvoer en water. De muizen kregen 1 week om te acclimatiseren voordat de experimenten startten. De experimentele protocollen voldeden aan de ethische richtlijnen van de Teikyo Heisei University Graduate School of Pharmaceutical Sciences, samengesteld uit de Richtlijnen voor Dierexperimenten van de Japanese Association for Laboratory Animal Sciences.

Biochemische Analyses

Serum alanine aminotransferase (ALT), serum aspartaat aminotransferase (AST), bloedureumstikstof (BUN) en creatininine (Cr) werden gemeten met commercieel beschikbare kits (Wako Pure Chemical Industries) volgens het protocol van de fabrikant. Kortweg, verzameld serum (10 mL) werd gecombineerd met 1 mL kleur A reagent (bevattend urease) en geïncubeerd bij 37 °C gedurende 15 min. Na toevoeging van 1 mL kleur B reagent werd het monster geïncubeerd bij 37 °C gedurende 10 min. De absorbantie werd gemeten bij een golfengte van 570 nm. Interleukine (IL)-6 en TNF-α werden geanalyseerd met een enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (BioSource International, CA, VS). Alle analyses werden strikt volgens de instructies van de fabrikant uitgevoerd.

Histologische Analyse

24 uur na dosistoediening werden de dieren geofferd, en de lever werd verwijderd en gefixeerd met 4% paraformaldehyde. Na verwerking en sneden werden dunne weefselcoupes gekleurd met hematoxyline en eosin voor histologische observatie.

Statistische Analyse

Statistische analyses werden uitgevoerd met de Statcel add-in formulieren, 3rd Excel Software (EMS publication Co., Ltd., Saitama, Japan). Alle data worden gepresenteerd als gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM). Significante verschillen tussen de controle- en experimentele groepen werden bepaald met de Dunnett-toets; een P-waarde minder dan 0,05 werd als significant beschouwd.

Beschikbaarheid van Data en Materialen

Niet van toepassing.

Afkortingen

ALT:

Alanine aminotransferase

AST:

Aspartaat aminotransferase

BUN:

Bloedureumstikstof

PQ:

Paraquat

Cr:

Creatinine