Op goud gebaseerde detectie van AGE's met laag moleculair gewicht van in vitro geglyceerde hemoglobine A0-monsters

Abstract

Eiwitglycatie is een belangrijke biochemische gebeurtenis die plaatsvindt in het plasma van diabetespatiënten als gevolg van verhoogde suikerspiegels. Uitgebreide glycatie leidt tot de vorming van geavanceerde glycatie-eindproducten (AGE's) waarvan bekend is dat ze nadelige effecten hebben op diabetespatiënten. In het huidige werk hebben we het fysiologisch belangrijke eiwit hemoglobine A0 in vitro geglyceerd om de vorming en activiteit van AGE te bestuderen door ze te gebruiken als een sjabloon voor de synthese van gouden nanodeeltjes (BNP's). Er werd gevonden dat de oppervlakteplasmonresonantie van gesynthetiseerde BNP's een hoge correlatie vertoonde met de mate van glycatie. Bij fractionering segregeerde het geglyceerde hemoglobine A0 zich in twee verschillende populaties van producten, een bestaande uit eiwitachtige, verknoopte grotere fragmenten van hemoglobine A0 en een tweede populatie van niet-eiwitachtige AGE's met een laag molecuulgewicht. Alleen AGE's met een laag molecuulgewicht droegen bij aan de synthese van BNP's bij gebruik van de fracties als een sjabloon, wat het principe van de voorgestelde BNP-gebaseerde test bevestigt. Vanwege het fysiologische belang ervan kunnen AGE's worden gebruikt als diagnostisch middel voor diabetes en de bijbehorende complicaties. In deze studie hebben we de hoge reactiviteit van AGE's gebruikt voor de ontwikkeling van een op het BNP gebaseerde nieuwe colorimetrische sensor om hun detectie mogelijk te maken. Onze voorgestelde BNP-gebaseerde waarneming zou een hoge klinische betekenis kunnen hebben bij het opsporen van diabetes en de bijbehorende complexiteit.

Achtergrond

Type II diabetes mellitus (T2DM) is een complexe stofwisselingsziekte die wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van hoge bloedsuikerspiegels. De hyperglykemie die in het lichaam aanhoudt, veroorzaakt een reeks chemische en biochemische reacties en de belangrijkste reactie die optreedt tijdens het verloop van hyperglykemie staat bekend als Maillard-reactie, waarbij een niet-enzymatische reactie tussen suikers en eiwitten betrokken is om een omkeerbaar aldimine (Schiff-base) te vormen. koppeling. De relatief onstabiele Schiff-base tautomeriseert tot zijn stabielere keto-vorm die ook wel bekend staat als het 'Amadori-product' [1]. Amadori-producten, ook wel tussenproducten van glycatie of vroege glycatieproducten genoemd, ondergaan groepsherschikkingen, cyclisatie, uitdroging en afbraakreacties om een reeks chemische verbindingen te vormen. Van deze verbindingen is bekend dat ze potentiële cross-linkers zijn van eiwitten en glycosylerende middelen [2]. Ze zijn vatbaar voor verdere afbraak, wat leidt tot de vorming van geavanceerde glycatie-eindproducten (AGE's) [3]. Bij hoge endogene concentraties dragen AGE's bij aan de complicaties van diabetes [4], hetzij door eiwitverknopingen te induceren, hetzij door receptorgemedieerde intracellulaire signaaltransductie (RAGE), wat leidt tot oxidatieve stress en ontsteking [5, 6]. Het is ook bekend dat het geassocieerd is met hart- en vaatziekten [7, 8], nefropathieën [9, 10], retinopathieën [11, 12], veroudering [13, 14], artritis, kanker [15,16,17], neurodegeneratieve ziekten zoals de ziekte van Alzheimer [15] en de ontwikkeling van depressie [18]. Naast de Maillard-reactie leiden verschillende andere routes, waaronder oxidatie van glucose, lipide-per-oxidatie en polyolroute, ook tot de vorming van AGE's [19, 20] in vivo. Daarnaast draagt de inname via de voeding van bepaalde voedingsmiddelen waarvan bekend is dat ze rijk zijn aan AGE's ook bij aan de totale AGE's in het lichaam [6].

Hoewel de meeste AGE-producten een gemeenschappelijk structureel element hebben [21], moeten de exacte chemische structuren van honderden AGE's nog worden geïdentificeerd [22]. Ondanks hun heterogeniteit zijn de vorming van covalente kruisverbindingen met het eiwit en het ‘bruiningeffect’ typerend voor alle bekende AGE’s [23]. De adducten met suiker en eiwit die in het vroege stadium van glycatie worden gevormd, worden vroege glycatie-adducten genoemd. Fructosyllysine en Fructosamine zijn voorbeelden van dergelijke structuren en het zijn potentiële verknopers [24,25,26]. Enkele van de veel bestudeerde AGE's zijn N -carboxymethyl-lysine (CML), N -carboxyethyl-lysine (CEL) [27], pentosidine [28], glucosepane [29], pyrraline, argpyramidine, Crossline en Vesperlysine C [30].

Studies over de rol van AGE's bij de progressie van diabetes, veroudering en bijbehorende complicaties nemen toe en er is gemeld dat ze een goede biomarker zijn voor de respectievelijke onderzoeken [https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02863224][ 31,32,33,34]. De complexiteit en heterogeniteit in de structuur van AGE's is echter een grote hindernis bij de ontwikkeling van een universeel detectiesysteem [35]. Kwalitatieve analyse van AGE's wordt over het algemeen gedaan door middel van spectroscopische en colorimetrische technieken [36] waarbij de evolutie van Maillard-reactieproducten wordt gevolgd door ofwel de verbetering van de lichtabsorptie bij 280 nm te meten, wat overeenkomt met de vroege Maillard-reactieproducten [37] of door te meten de fluorescentie-emissie bij 450 nm [38,39,40,41,42]. Studies voor de identificatie van verschillende AGE-producten zijn nog aan de gang; er werden echter enkele pogingen ondernomen om pentosidine [43] en carboxymethyllysine [44] te kwantificeren. De meeste AGE's werden op weefselniveau bestudeerd door middel van immunohistochemie en op ELISA gebaseerde kwantificering met behulp van een reeks poly- en monoklonale antilichamen [21, 45]. De beste analytische techniek die tot nu toe beschikbaar is voor AGE-detectie is vloeistof- of gaschromatografie gevolgd door spectrofotometrische of massaspectrometrische detectie [12, 46,47,48,49]. De kwantitatieve analyse van AGE's is nog steeds een grote technische uitdaging en de weinige technieken die daarvoor beschikbaar zijn, zijn duur en beperken dus het gebruik ervan in point-of-care-toepassingen. De ontwikkeling van nieuwe strategieën voor de kwalitatieve en kwantitatieve evaluatie van AGE's is de noodzaak van het uur vanwege hun implicaties bij levensbedreigende ziekten.

Er zijn grote inspanningen geleverd aan de ontwikkeling van colorimetrische sensoren vanwege hun eenvoud in detectie, snelle responstijd en kosteneffectiviteit, vooral voor biologische toepassingen [50]. Onder hen zijn op oppervlakteplasmonresonantie (SPR) gebaseerde sensoren van bijzonder belang vanwege hun hoge detectiegevoeligheid [51]. In de huidige studie hebben we de optische eigenschappen van gouden nanodeeltjes (BNP's) onderzocht voor de kwalitatieve identificatie van AGE-producten. BNP's staan bekend om hun unieke, afstembare SPR en zijn daarom geëvolueerd als een colorimetrische reporter voor de detectie van verschillende biomoleculen. Optische sensoren op basis van BNP's omvatten die voor kleine chemische analyten [52], suikers [53], verschillende eiwitten [54], eiwitaggregaten [55] en conformationele varianten van een eiwit [56]. Eerder toonden we aan dat BNP's, wanneer gezaaid op een geglyceerde eiwitsjabloon, zouden kunnen reageren op de vooruitgang van glycatie [57]. Hier hebben we dit concept voor de kwalitatieve detectie van verschillende glycatieproducten colorimetrisch uitgebreid door gebruik te maken van de reducerende eigenschap van de AGE's. In het kort, HbA0 werd in vitro geglyceerd, met fructose als reducerende suiker, AGE-vorming en de bijbehorende structurele veranderingen in de eiwitruggengraat werden bevestigd met behulp van spectroscopie. Het geglyceerde Hb werd gefractioneerd met behulp van gelfiltratiechromatografie om de producten te scheiden op basis van hun molecuulgewicht en BNP's werden gesynthetiseerd met behulp van de verkregen fracties. Alleen de niet-eiwitachtige AGE-producten leidden de synthese van gouden nanostructuren en maakten zo hun identificatie mogelijk.

Steeds meer bewijzen ondersteunen de betrokkenheid van verschillende glycatieproducten bij ziekten, waaronder diabetes, veroudering, Alzheimer, nierziekten, atherosclerose en verschillende soorten kankers. Onze bevindingen benadrukken het gebruik van BNP's als een eenvoudig en zeer gevoelig colorimetrisch detectieplatform voor de identificatie van verschillende AGE-producten die mogelijk betrokken zijn bij de prognose van diabetesgerelateerde gezondheidscomplicaties.

Methoden

Materialen

Hemoglobine AO (HbA0) en Sephadex (G25) werden verkregen van Sigma Aldrich India Pvt. Ltd. Waterstoftetrachloorauraat (III) trihydraat (HAuCl₄ .3H₂ O) werd gekocht bij Loba Chemie. Fructose, kaliumdiwaterstoforthofosfaat, dikaliumwaterstoforthofosfaat, natriumdiwaterstoforthofosfaat, dinatriumwaterstoforthofosfaat, kaliumferricyanide, trichloorazijnzuur, ijzerchloride, salpeterzuur (HNO₃ ), zoutzuur (HCl), acrylamide, bisacrylamide, ammoniumpersulfaat, TEMED, natriumdodecylsulfaat, Coomassie Brilliant Blue, glycerol, dithiothreitol, TRIS-base en andere chemicaliën die werden gebruikt, waren van analytische kwaliteit en werden zonder verdere zuivering gebruikt. Voor alle experimenten werd MilliQ ultrapuur water (>18 MΩ) gebruikt.

Methoden

Glycatie van HbA0

Voorraadoplossingen van HbA0 en fructose werden bereid in geautoclaveerde kaliumfosfaatbuffer (0,1 M, pH 7,4) en vóór gebruik gefiltreerd met behulp van spuitfilters van 0,2 m. HbA0-monsters werden geïncubeerd met verschillende concentraties fructose gedurende verschillende tijdsperioden (1 tot 10 dagen) in een incubator bij 37 ° C. De eindconcentraties van fructose en HbA0 waren 0,1 M en 1 mg ml⁻¹ respectievelijk. Er werden ook controles van HbA0 en fructose gehouden die dezelfde concentraties hadden. De monsters die gedurende 10 dagen werden geglyceerd, worden gelabeld met het voorvoegsel 'Dag 10' en de controlemonsters die niet werden geïncubeerd, worden gelabeld met het voorvoegsel 'Dag 0'. Alle experimenten werden uitgevoerd onder steriele omstandigheden in een afzuigkap met laminaire luchtstroom.

Eigenschapstest verminderen

De reducerende eigenschappen van de geglyceerde monsters werden bepaald met de methode beschreven door Gu. et al. [37] met kleine aanpassingen. Vervolgens werden 100 L van de geglyceerde monsters en hun respectievelijke eiwit- en suikercontroles gemengd met 1 ml 0,2 M natriumfosfaatbuffer en 1 ml 1% kaliumferricyanide. De mengsels werden gedurende 20 minuten bij 50°C in een waterbad geïncubeerd. Na afkoeling van het mengsel tot kamertemperatuur werd 1 ml 10% trichloorazijnzuur toegevoegd. Aan 1 ml van dit mengsel werd 1 ml MilliQ-water en 200 μL 0,1% ijzerchloride toegevoegd. De absorptie van het resulterende mengsel werd gemeten bij 700 nm. Er werd een negatieve controle gehouden waarin 0,1 M fosfaatbuffer werd toegevoegd in plaats van het geglycosyleerde monster en dit diende als blanco voor absorptiemetingen. Hoe hoger de absorptie bij 700 nm, hoe meer de reducerende eigenschap.

Gelfiltratiechromatografie van dag 0 Fruc-Hb en dag 10 Fruc-Hb met Sephadex (G25)

In het kort werden Sephadex (G25)-korrels een nacht in MilliQ-water geweekt en vervolgens gepakt in een glazen kolom met een lengte van 15 cm, een diameter van 1 cm en een binnenvolume van 15 ml. Eerst werd de kolom gewassen met een ruime hoeveelheid MilliQ-water gevolgd door kaliumfosfaatbuffer (0,1 M, pH 7,4). Ongeveer 600 L van het Fruc-Hb-monster werd in de kolom geladen nadat deze in evenwicht was gebracht met fosfaatbuffer. Elutie werd uitgevoerd met dezelfde buffer bij een stroomsnelheid van 7,5 ml per uur. Fracties werden verzameld zodra het geladen monster een afstand van ongeveer 10 cm van de kolom kruiste. Van elk van de monsters werden ongeveer 30 fracties verzameld en daarna gekarakteriseerd. Hier dienden Fruc-Hb van dag 0 en de daaruit afgeleide fracties als controle tegen het Fruc-Hb-monster van dag 10 en hun respectievelijke fracties.

Synthese van gouden nanodeeltjes

Al het glaswerk dat voor de BNP-synthese werd gebruikt, werd gewassen met Aqua Regia (HCl:HNO₃ in een volumeverhouding van 3:1) en vóór gebruik gespoeld met ethanol en ultrapuur water (Let op! Aqua Regia is een zeer bijtend oxidatiemiddel waarmee met grote zorg moet worden omgegaan ). De synthese van BNP's werd uitgevoerd, gebruikmakend van de reducerende eigenschap van glycatieproducten van Hb. In een typisch experiment uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT), 32 μL waterige oplossing van HAuCl₄ (1% w /v ) werd onder constant roeren toegevoegd aan 3,868 ml MilliQ-water. Na volledige oplossing van het goudzout wordt de oplossing bleekgeel. Vervolgens werd 50 L van het vereiste Fruc-Hb-monster of 100 μL van de fractie toegevoegd aan de goudzoutoplossing. Nadat alle reactanten grondig waren gemengd, werd het roeren gestopt en werd het reactiemengsel ongestoord gelaten om de groei van BNP's mogelijk te maken. In het uiteindelijke reactiemengsel was de concentratie van het Fruc-Hb-monster 12,5 ng μL⁻¹ (12,5 μg ml⁻¹ ) en die van de fractie was 1 ng μL⁻¹ (1 μg ml⁻¹ ) (De gedetailleerde berekeningen worden gegeven in S6). Afhankelijk van het toegevoegde monster ontwikkelden zich kleuren variërend van roze tot paars in de reactiemengsels. Alle monsters werden gehandhaafd totdat de kleur van het reactiemengsel gestabiliseerd was en er geen verdere verandering werd waargenomen.

Bradford-assay

De fracties verzameld uit Fruc-Hb-monsters werden geanalyseerd op de aanwezigheid of afwezigheid van eiwit met behulp van Bradford-assay. In het kort, aan elk van 20 μL onverdunde fracties werd ongeveer 200 μL Bradford-reagens toegevoegd en de absorptie werd gemeten bij 595 nm en 450 nm [58]. De verhouding van OD bij 595 nm tot 450 nm werd uitgezet tegen het fractiegetal en een hogere verhouding gaf een relatief hoger percentage van het eiwit aan.

Spectroscopie

UV-zichtbare spectroscopie

UV-zichtbare spectra van alle Fruc-Hb-monsters, hun respectieve controles en de chromatografische fracties van de geglyceerde monsters werden opgenomen in een Perkin Elmer, Lambda 25 UV-zichtbare spectrometer. Spectra werden genomen door een scan uit te voeren van 800 tot 200 nm met een scansnelheid van 240 nm/min en een spleetbreedte van 1 nm. Alle metingen werden gedaan met behulp van 1 cm padlengte, 1 ml kwartscuvetten. De UV-zichtbare spectra van BNP's werden ook op een vergelijkbare manier geregistreerd.

Fluorescentiespectroscopie

Om structurele eiwitveranderingen en AGE-vorming te identificeren, werden de fluorescentie-emissieprofielen van Fruc-Hb-monsters en de fracties van dag 0 Fruc-Hb en dag 10 Fruc-Hb uitgevoerd met behulp van Agilent Technologies Cary Eclipse fluorescentiespectrofotometer. Excitatie- en emissiespleetbreedtes werden ingesteld op 5 nm en spectra werden genomen met behulp van een kwartscuvet met een padlengte van 1 cm. Monsters werden geëxciteerd bij 280 nm en 350 nm voor het controleren van respectievelijk de tryptofaanfluorescentie/intrinsieke eiwitfluorescentie en AGE-fluorescentie [34,35,36,37,38].

Circulair dichroïsme spectroscopie

De secundaire structuurveranderingen in de Fruc-Hb-monsters werden geïdentificeerd met behulp van circulair dichroïsme spectroscopie. De metingen werden uitgevoerd met behulp van circulair dichroïsme (CD) spectrometer met Stop Flow, Applied PhotoPhysics Chirascan (Applied Photophysics Limited, VK). De spectra zijn genomen in het verre UV, variërend van 190 tot 260 nm.

Voor alle spectroscopiemetingen, Fruc-Hb-monsters van 0,1 mg ml⁻¹ concentratie werden gebruikt en fracties van dag 0 Fruc-Hb en dag 10 Fruc-Hb werden geanalyseerd zonder enige verdunning. Kaliumfosfaatbuffer (pH 7,4, 10 mM) diende als blanco in alle experimenten. Alle metingen werden in drievoud bij kamertemperatuur gedaan.

Transmissie-elektronenmicroscopie

Om de grootte en structuur van de BNP's te identificeren die zijn gesynthetiseerd uit de Fruc-Hb-monsters en hun respectieve controles, werd elektronenmicroscopie-analyse uitgevoerd met behulp van transmissie-elektronenmicroscoop (TEM) -JEOL 2100F. De BNP's werden geconcentreerd door centrifugatie bij 6000 rpm en werden door druppels gegoten op met koper beklede koolstofroosters met een maaswijdte van 300. De monsters mochten voorafgaand aan de analyse een nacht bij kamertemperatuur drogen.

Kleurintensiteitsprofiel van BNP's

Om de kleur van het BNP in meetbare waarden uit te drukken, werd (RB)/G ((rode intensiteit-blauwe intensiteit)/groene intensiteit) berekend door rode, blauwe en groene kleurvlakken te extraheren uit elk van de gouden colloïden met behulp van een digitale kleur meter.

SDS-polyacrylamidegelelektroforese

Natriumdodecylsulfaat-polyacrylamidegelelektroforese (SDS PAGE) werd uitgevoerd om de verschillen in het molecuulgewicht van HbA0 na glycatie te zien. HbA0-controles van dag 0, dag 10 en Fruc-Hb van dag 0 en dag 10 werden gemengd met 10% SDS met 6X laadbuffer en 5 minuten gekookt, waarna 30 L van de monsters op de gegoten gel werd geladen (stapelgel- 5%, oplossende gel − 12%). De monsters werden samen met de 10-175 kDa PiNK Plus voorgekleurde eiwitladder (cat. nr. PM005 0500) bij 100 V uitgevoerd met behulp van het Mini PROTEAN Tetrad-systeem van Bio-Rad. De gels werden gevisualiseerd onder de witte lichtbron van een Bio-Rad Trans-illuminator.

Resultaten

BNP-synthese van fructose, hemoglobine A0 en geglycosyleerde hemoglobine A0

Het is bekend dat de reducerende suiker glucose in vivo reageert met HbA0 om HbA1c te produceren, het bekende vroege glycatie-adduct dat een belangrijke biomarker is voor de hyperglykemische niveaus geassocieerd met diabetes [59]. Om snellere glycatiekinetiek en hoge AGE-accumulatie in vitro te bereiken, wordt fructose gebruikt in plaats van glucose, wat een krachtig glycatiemiddel is in vergelijking met de laatste [55,56,57,58,59,60]. In onze studie hebben we de glycatie van hemoglobine A0 uitgevoerd met fructose als reducerende suiker en de glycatie werd gevolgd tot 10 dagen, wat naar verluidt goed genoeg is voor substantiële AGE-vorming [57]. Figuur 1 illustreert de vorming van AGE's in de HbA0-monsters na 10 dagen incubatie met fructose in vitro. AGE-vorming werd geëvalueerd door de fluorescentie-emissie kwalitatief te meten bij 450 nm bij excitatie bij 350 nm [38,39,40,41,42]. Meer dan tienvoudige toename van fluorescentie-emissie bij 450 nm bevestigde de vorming van AGE-producten in geglycosyleerd HbA0 (dag 10 Fruc-Hb) vergeleken met het niet-geglycosyleerde HbA0 (dag 0 Fruc-Hb-fysisch mengsel van HbA0 en fructose zonder incubatie). De gedetailleerde biofysische karakterisering van de monsters wordt besproken in het aanvullende bestand 1 (S1 &S2).

Vorming van AGE's gemeten door het genereren van fluorescentie bij 450 nm wanneer hemoglobine gedurende 10 dagen met fructose wordt geïncubeerd. Vergelijking van 450 nm fluorescentie-emissie op dag 0 Fruc-Hb en dag 10 Fruc-Hb

Om BNP's te gebruiken als een colorimetrische sensor voor AGE's die zijn afgeleid van eiwitglycatie, was het een vereiste om de vormingskinetiek van BNP's uit de suiker- en eiwitreactanten te bestuderen. Van fructose en hemoglobine A0 is al gemeld dat ze de synthese van gouden nanostructuren sturen [53, 61,62,63] wanneer ze alleen of in combinatie met een sterk reductiemiddel worden gebruikt. Om het verschil in vormingskinetiek te begrijpen, vergeleken we echter de BNP's die zijn gesynthetiseerd uit Fruc-Hb, fructose en HbA0 die respectievelijk 0 en 10 dagen waren geïncubeerd in afwezigheid van een extra reductiemiddel. De reducerende eigenschappen van deze sjablonen werden biochemisch gemeten volgens het protocol beschreven in de sectie methoden. Over het algemeen vertoonden de monsters van dag 10 een hogere reducerende eigenschap dan de monsters van dag 0, en Fruc-Hb vertoonde de maximale reducerende eigenschap gevolgd door fructose en HbA0 in beide gevallen, wat kan worden toegeschreven aan de aanwezigheid van AGE's in Fruc-Hb-monsters ( Afb. 2a). Van deze monsters, in een typische concentratie, droeg alleen Fruc-Hb op dag 10 bij aan de synthese van stabiele BNP's (Fig. 2b) aan het einde van 4 dagen, terwijl de rest van de monsters dit alleen konden doen als ze de kans kregen om gedurende langere tijd worden bewaard (meestal meer dan 10 dagen) en de resultaten zijn in overeenstemming met de verkregen reducerende eigenschappen van de monsters (gegevens niet getoond). Het zichtbare lichtabsorptiespectrum van de Fruc-Hb_GNP's van dag 10 genereerde een piek rond 530 nm (Fig. 2c) en de deeltjes werden ook gekenmerkt door transmissie-elektronenmicroscopie (TEM), om de grootte en morfologie te bestuderen (Fig. 2d). Elektronenmicrofoto toonde de aanwezigheid van bolvormige deeltjes met een gemiddelde diameter van 21,930 ± -2,4 nm (figuur 2e). Ook waren de deeltjes polykristallijn van aard met roosterpunten die overeenkomen met 111, 200, 220, 311 vlakken van een fcc-rooster (figuur 2f). Een gedetailleerde kinetische analyse van de BNP-vorming van differentieel geglyceerde monsters wordt gegeven in S3.

Karakterisering van AGE-vorming en BNP-synthese uit HbA0-, fructose- en Fruc-Hb-monsters. een Verminderende eigenschappen van HbA0, fructose, Fruc-Hb van respectievelijk 0 en 10 dagen incubatie gemeten met de ferri-ionenreductietest. b Foto's van BNP's gesynthetiseerd uit de respectieve monsters. c UV-zichtbaar absorptiespectrum voor de dag10 Fruc-Hb_GNP's. d Transmissie-elektronenmicrofoto van de dag10 Fruc-Hb_GNP's (schaalbalk:20 nm). e Grootteverdeling van de deeltjes en f SAED voor de deeltjes

Hier fungeert Fruc-Hb zowel als een sjabloon als als stabilisator om de synthese van gouden nanostructuren met een bolvorm te sturen. Omdat alleen op dag 10 Fruc-Hb de deeltjessynthese in een bepaalde tijd mogelijk maakt in vergelijking met de suiker- en eiwittegenhangers, kan dit mechanisme worden gebruikt om onderscheid te maken tussen een geglyceerd en niet-geglyceerd eiwittemplate.

Fractionering van Fruc-Hb lost twee verschillende klassen van glycosyleringsproducten op

Het was interessant om te zien of de AGE's of de veranderingen in de eiwitruggengraat verantwoordelijk zijn voor de waargenomen differentiële SPR-respons in de BNP's die zijn gezaaid op dag 10 Fruc-Hb-template. Om verder te onderzoeken, hebben we dag 10 Fruc-Hb en dag 0 Fruc-Hb gefractioneerd met behulp van gelfiltratiechromatografie zoals beschreven in de sectie methoden. De fracties afgeleid van dag 0 Fruc-Hb dienden als controle tegen de fracties van dag 10 Fruc-Hb. Figuur 3 vat de spectroscopische karakterisering van de fracties samen. Figuur 3a toont de elutieprofielen van fracties verzameld vanaf dag 0 Fruc-Hb (rood) en dag 10 Fruc-Hb (zwart). Het karakteristieke elutieprofiel dat is verkregen voor de fractionering van Fruc-Hb komt overeen met de eerdere rapporten [37].

Elutieprofiel van dag 0 Fruc-Hb (rood) en dag 10 Fruc-Hb (zwart) fracties. UV-absorptieprofiel gemeten bij 280 nm (a ) en Bradford-assay voor de aanwezigheid van eiwitten (b ) fracties van dag 0 Fruc-Hb en dag 10 Fruc-Hb

De aanwezigheid van eiwit in de fracties van dag 0 en dag 10 werd bevestigd door de absorptie van UV-licht bij 280 nm door de in het eiwit aanwezige aromatische aminozuren. Het elutieprofiel van Fruc-Hb van dag 10, gemeten door lichtabsorptie bij 280 nm, toont de aanwezigheid van twee populaties van producten gemarkeerd met I en II. Populatie I, bestaande uit producten met een hoog molecuulgewicht, varieert van fractie nr. 5 t/m 12 en fractie nr. 15 en later overeenkomend met producten met een laag molecuulgewicht vallen in populatie II. Een klein bereik van 2-3 fracties werd waargenomen tussen I en II, waar geen UV-absorptie werd waargenomen. Aan de andere kant vertoonde een enkele populatie van fracties vanaf dag 0 Fruc-Hb UV-lichtabsorptie (populatie I), wat bevestigt dat de absorptie in regio II in fracties op dag 10 door de producten gegenereerd in dag 10 Fruc-Hb als resultaat is van glycatie. Er is al gemeld dat de tussenproducten van de Maillard-reactie licht absorberen in het nabije UV-bereik [64] wat de waarneming ondersteunt. De verhoogde absorptie van UV-licht bij 280 nm bij fracties op dag 10 in vergelijking met fracties op dag 0 kan te wijten zijn aan de uitgebreide ontvouwing van eiwit als gevolg van glycatie, wat resulteert in de blootstelling van aromatische aminozuren (Fig. 3a).

Glycatie verandert de secundaire en quaternaire structuren van het eiwit aanzienlijk, zoals besproken in S1. Om de structurele status van het eiwit in de fracties te bevestigen, voerden we SDS-polyacrylamidegelelektroforese van de fracties uit en ontdekten dat in plaats van monomere en dimere banden, gefuseerde banden werden waargenomen die de verknoping van eiwit in het Fruc-Hb-monster van dag 10 bevestigen (Extra bestand 1:Afbeelding S4).

Bij het vergelijken van de elutieprofielen van dag 0 Fruc-Hb en dag 10 Fruc-Hb, onderscheiden we dat de fracties die vallen in populatie I eiwitachtig van aard zijn en de tweede populatie die volledig afwezig was in dag 0 fracties (niet-geglyceerd) bestaat uit niet-eiwitachtige glycatieproducten. Deze bevindingen worden ondersteund door de eiwitschatting door de analyse van Bradford, waarbij de eiwitachtige aard van de fracties in populatie I van zowel dag 0 als dag 10 Fruc-Hb werd bevestigd (Fig. 3b). Kort gezegd, fractionering van Fruc-Hb op dag 10 door gelfiltratiechromatografie leverde twee verschillende populaties van fracties op, waarbij beide licht bij 280 nm absorbeerden, waarvan de ene eiwitachtig van aard was en de andere niet-eiwitachtig.

De eiwithoudende glycatieproducten en niet-eiwitachtige glycatieproducten zijn fluorescerend van aard

Nadat de elutie van glycatieproducten van eiwitachtig en niet-eiwitachtig van aard was begrepen, werd de fluorescentie-emissie van deze fracties gemeten bij 450 nm om de aanwezigheid van AGE-producten te karakteriseren. Net als bij het UV-elutieprofiel worden twee populaties van fluorescentie-emissie waargenomen voor fracties van dag 10, maar geen van de fracties van dag 0 vertoonde fluorescentie-emissie bij 450 nm aangezien er geen AGE-vorming heeft plaatsgevonden op dag 0 Fruc-Hb (Fig. 4). De intensiteit van de fluorescentie varieerde significant tussen de fracties van dag 10, wat de differentiële chemische aard van de glycatieproducten aangeeft. In het fluorescentie-elutieprofiel bestonden de initiële eluaten die tot populatie I behoorden uit glycatieproducten met een hoge fluorescentie-intensiteit. Dit samen met de eiwitschatting getoond in Fig. 3 suggereert de elutie van sterk fluorescerende glycatieproducten die eiwitachtige structuren in deze fracties omvatten. De tweede populatie vertoonde fluorescentie-emissie van mindere intensiteit in vergelijking met de initiële fracties. Ze bleken niet-eiwitachtig van aard te zijn (Fig. 3b) maar in staat om UV-licht bij 280 nm te absorberen (Fig. 3a).

Vergelijking van AGE-fluorescentie in Fruc-Hb-fracties van dag 0 en Fruc-Hb-fracties op dag 10 uitgedrukt als de intensiteit van fluorescentie-emissie bij 450 nm

Rekening houdend met de UV-absorptie (Fig. 3) en fluorescentie-emissie van de fracties op dag 10 (Fig. 4), is het duidelijk dat de fractionering onderscheid maakt tussen twee verschillende klassen van glycatieproducten van HbA0. De populatie fracties die aanvankelijk uit de G25-kolom wordt geëlueerd, heeft een hoog molecuulgewicht, is eiwitachtig van aard en zendt sterke fluorescentie uit bij 450 nm. De tweede klasse van producten zijn niet-eiwitachtige structuren met een laag molecuulgewicht, die fluorescentie uitzenden bij 450 nm maar met een relatief lagere intensiteit. Aangezien beide producten 'AGE'-fluorescentie vertonen, kunnen de eiwitachtige structuren de AGE-producten zijn die verknoopt zijn met de eiwitruggengraat die aanvankelijk tijdens de Maillard-reactie worden gevormd, en de fracties van de tweede populatie zouden de late glycatieproducten kunnen zijn die als resultaat worden gevormd van de afbraak van AGE-eiwit-crosslinks.

BNP's gezaaid op fracties van Fruc-Hb-monster maakt differentiatie tussen de glycatieproducten mogelijk

Het is duidelijk dat synthese van BNP's kan worden gebruikt om onderscheid te maken tussen een geglyceerde en niet-geglyceerde matrijs (Fig. 2). Om te onderzoeken of de BNP's kunnen differentiëren tussen de eiwitachtige en niet-eiwitachtige eluten vanaf dag 10 Fruc-Hb, hebben we BNP's gesynthetiseerd met behulp van de fracties verkregen vanaf dag 10 Fruc-Hb zoals beschreven in de methoden. De kleur van de gevormde BNP's werd gevolgd totdat alle monsters stabiel waren geworden.

Zoals getoond in Fig. 5 vertoonde geen van de fracties bestaande uit eiwitachtige structuren (populatie I) opmerkelijke BNP-vorming, terwijl de fracties die niet-eiwitachtige AGE-producten bevatten (populatie II) stabiele BNP's produceerden die een reeks kleuren vertoonden in colloïdale oplossing. De vorming van BNP's werd gekarakteriseerd met behulp van UV-zichtbare spectroscopie en de absorptiemaxima werden uitgezet tegen de fractieaantallen. De spectroscopiegegevens ondersteunen het gevisualiseerde BNP-kleurprofiel goed. Deze gegevens concluderen dat de differentiatie van matrijs van geglyceerd eiwit van matrijs van niet-geglyceerd eiwit op basis van het op het BNP gebaseerde detectiemechanisme wordt gemedieerd door de AGE-producten met een laag molecuulgewicht en hetzelfde mechanisme kan worden gebruikt om onderscheid te maken tussen de eiwitachtige en niet-geglyceerde niet- -eiwitachtige glycatieproducten.

BNP-synthese van dag 10 Fruc-Hb-fracties. Het colorimetrische profiel van BNP's gesynthetiseerd uit fracties op dag 10 en hun absorptiemaxima uitgezet tegen het fractienummer

De kinetiek van de op het BNP gebaseerde colorimetrische detectie kan in grotere mate worden verbeterd door simpelweg de concentraties van Fruc-Hb en goudzout te verhogen, waardoor de responstijd wordt verkort. When the concentrations of the Fruc-Hb and gold salt was increased four times than the concentrations used initially in this study, GNP formation was completed within 1 day, substantiating the use of the proposed colorimetric sensor for point-of-care applications (Additional file 1:Figure S5).

The linearity of detection for this colorimetric sensor was also confirmed using different concentrations of the day 10 glycosylated HbA0 (day 10 Fruc-Hb) (Fig. 6). Colour formation was not prominent enough for the lower concentrations of day 10 Fruc-Hb used, and as the concentration was increased from 20 to 40 ng/μL, the colour intensity increased linearly. This confirms that the colour intensity profile extracted from the GNPs obtained from differentially glycated haemoglobin samples can be used for qualitative measurement of AGEs in respective samples.

Linearity of detection. The red colour intensity as quantified by (R-G)/B intensity of GNP colloids plotted against the concentration of day 10 Fruc-Hb used for the synthesis. The concentration was varied from 8 to 40 ng/μL

Discussion

The study presented here provides a detailed mechanism of GNP formation from a glycosylated HbA0 template and also discusses how this technique can be expanded for highly sensitive detection of AGE products in a simple manner. Our primary objective for this work was to establish a colorimetric sensing mechanism based on GNPs for the differentiation of glycated and non-glycated samples. The glycated HbA0 was found to be having high reducing property in comparison to the protein and sugar counterparts, enabling formation of stable and mono dispersed GNPs (Fig. 2). Since, among the control samples tested for GNP synthesis, only day 10 Fruc-Hb showed AGE fluorescence, the reactivity can be attributed to the AGE products than a mere structural alterations of the due to glycation (Figs. 1 and 2). To confirm this norm further, the products of glycation obtained from day 10 Fruc-Hb was fractionated to separate the products according to their molecular weights.

Fractionation of glycated Hb segregated two major population of products, high molecular weight proteinaceous (population I) and low molecular weight non-proteinaceous (population II) glycation products (Figs. 3 and 4). When GNPs were synthesised using these fractions of day 10 Fruc-Hb, it was found that only the products belonging to population II, the non-proteinaceous glycation products, were capable of carrying out the synthesis of particles (Fig. 5). This confirmed that the non-proteinaceous AGE products can initiate GNP synthesis by their own and the formation of GNPs from a Fruc-Hb template can be clearly attributed to the AGEs. Also, this opens up the possibility of using this property for the colorimetric detection of AGE products along with the distinction between proteinaceous and non-proteinaceous glycation products of HbA0.

Generally, CARBONYL groups present in the protein and sugar enable the stable synthesis of gold nanostructures in biological syntheses. Here, the generation of AGE products consisting of dicarbonyl functional groups during glycation might be providing the reducing environment for the proposed GNP synthesis [65]. As a matter of fact, the suggested mechanism can be used for the detection of advanced lipid per-oxidation end products (ALEs) as well, since the latter is also characterised by dicarbonyl functional groups and shares structural similarities with AGEs [66]. In short, GNPs synthesised from fractionated glycosylated Hb samples can clearly distinguish between proteinaceous and non-proteinaceous products. Our GNP-based simple colorimetric sensing of glycation products is highly sensitive and can detect nanogram levels of glycation products (S6) in a concentration-dependent manner (Fig. 6). The detection limit using the proposed sensing mechanism for the fractions is 1 ng/μL. The method developed in here can be scaled down to smaller reaction volumes without affecting the reaction kinetics, thus enabling lower sample requirements (data not shown) as well as enhance the reaction kinetics by increasing the concentrations (S5).

Conclusies

Concisely, in this study, we have demonstrated a colorimetric sensing mechanism for the non-proteinaceous AGE products which is simple and highly sensitive with a detection limit down to nanogram levels. Conditions like type 2 diabetes requires continuous monitoring of sugar levels at regular time intervals. Currently, levels of HbA1c formed as a result of extensive glycation of haemoglobin is used as a diagnostic means for diabetes. Chromatographic [67], electrophoretic and advanced technologies including high-performance liquid chromatography (HPLC) and mass spectrometry (MS) [12, 46,47,48,49, 68] are used for HbA1c detection. Early glycation adducts including fructosamines are also indicative of the glycemic control [69] which can be used as a marker for diabetes detection. Monitoring the AGE levels in addition to the HbA1c levels can significantly improve the determination the degree of complexity associated with diabetes, since the advancement of the disease is often associated with AGE formation and is involved in the progression of the disorder as well. Till date, the LC-MS/MS offers the highest selectivity and sensitivity in AGE detection [70]. But when it comes to simple, cost-effective, point-of-care diagnostics, our method can detect few nanograms of the sample compared to other fluorescence emission-based techniques [71, 72]. The method is highly specific for the AGEs, such that sugars and proteins do not develop any colour as such which are the expected interferences in the clinical samples such as blood or serum for the proposed study (Additional file 1 section 7). In this study, we have also segregated the products of glycation to proteinaceous and non-proteinaceous components and proved that non-proteinaceous AGEs are more reactive by the GNP based colorimetric assay. Further research can explore how this idea can be expanded for the distinction between different AGEs and thereby apply it for the diagnosis of organ specific diabetes-related complications.

Afkortingen

AGEs:: Advanced glycation end products
Fruc-Hb:: Glycated Hb
GNPs:: Gouden nanodeeltjes
HbA0:: Haemoglobin A0
SPR:: Oppervlakteplasmonresonantie

Decoratie van nanoblaasjes met pH (laag) insertiepeptide (pHLIP) voor gerichte toediening Rationeel ontwerp van 3D-honingraatachtige SnS2 Quantum Dots/rGO-composieten als hoogwaardige anodematerialen voor lithium-/natrium-ionbatterijen

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal