Innovatieve nucleoside-lipide nanodragers verbeteren sorafenib-afgifte en verminderen toxiciteit

Samenvatting

Hoewel de toepassing van sorafenib, een kleine inhibitor van tyrosineproteïnekinasen, in kankerbehandelingen een wereldwijde optie blijft in chemotherapie, zijn nieuwe strategieën nodig om de lage wateroplosbaarheid (< 5 μM), toxiciteit en bijwerkingen van dit geneesmiddel aan te pakken. In deze context wordt het gebruik van nanodragers momenteel onderzocht om deze nadelen te overwinnen. In deze bijdrage rapporteren we een nieuw type sorafenib-gebaseerde nanopartikels gestabiliseerd door hybride nucleoside-lipiden. De vaste lipide nanopartikels (SLNs) toonden negatieve of positieve zetapotentiaalwaarden afhankelijk van de lading van de nucleoside-lipide. Transmissie-elektronenmicroscopie van met sorafenib geladen SLNs onthulde parallelepipede nanopartikels van ongeveer 200 nm. Biologische studies uitgevoerd op vier verschillende cellijnen, waaronder lever- en borstkanker, onthulden verbeterde antikankeractiviteiten van sorafenib-gebaseerde SLNs vergeleken met het vrije geneesmiddel. Belangrijk is dat contrastfasemicroscopie-afbeeldingen opgenomen na incubatie van kankercellen in de aanwezigheid van SLNs bij hoge concentratie in sorafenib (> 80 μM) een totale kankerceldood in alle gevallen onthulden. Deze resultaten benadrukken het potentieel van nucleoside-lipide-gebaseerde SLNs als geneesmiddelafgiftesystemen.

Achtergrond

Sorafenib, gecommercialiseerd onder de naam Nexavar™, is een hydrofoob geneesmiddel kinaseremmer goedgekeurd voor de behandeling van verschillende humane kankers, waaronder geavanceerde niercelcarcinoom (RCC), hepatocellulair carcinoom (HCC) en geavanceerde schildkliercarcinoom. Sorafenib heeft meerdere bekende proteïnekinase-doelen, waaronder transmembraanreceptoren en intracellulaire tyrosine en seriene-threonine kinasen, en is ook aangetoond om apoptose te induceren. Wat het werkingsmechanisme betreft, remt sorafenib tumorgroei via meerdere doelen, werkend direct op de tumor en/of op tumorangiogenese (door remming van VEGFR en PDGFR signalering). De effectiviteit in het remmen van maligne celdeling is aangetoond in veel histologische kankertypen zoals melanoom, schildklier, pancreas, hepatocellulair carcinoom en leukemie. Echter, de lage wateroplosbaarheid, toxiciteit en bijwerkingen beperken het gebruik van sorafenib in veel klinische toepassingen. Om deze problemen aan te pakken, worden verschillende sorafenib-formulaties momenteel onderzocht, waaronder vloeibare kristallijne nanopartikels, nano-emulsies, cyclodextrine-gemodificeerde poruze siliciumnanopartikels, geneesmiddel-afgevende nancomposieten, polyelektrolyt-gebaseerde nanopartikels, of curcumine zelf-assemblerende nanopartikels. Echter, lipide nanopartikels (LNs) geladen met sorafenib zijn slecht onderzocht.

Hier rapporteren we het eerste voorbeeld van sorafenib-gebaseerde vaste lipide nanopartikels (SLNs) gestabiliseerd door nucleoside-lipiden. Chromatografische studies uitgevoerd op positief en negatief geladen nucleolipiden (DOTAU en diC₁₆dT, respectievelijk) geven aan dat deze amphifielen de gevraagde stabiliteit en zuiverheid bezitten voor hun gebruik binnen het kader van geneesmiddelafgifte-toepassingen. Een eenvoudige nanoprecipitatieprocedure laat de vorming van SLNs toe met entweder positieve (SLN⁺) of negatieve ladingen (SLN⁻). Het is de moeite waard op te merken dat alle onderzochte SLNs het cytotoxische effect van sorafenib op verschillende humane carcinoomen verbeterden, wat aantoont dat SLNs de beperkingen van sorafenib qua wateroplosbaarheid en antikankeractiviteiten kunnen overwinnen.

Methoden

Chemicaliën en reagentia

Methanol (MeOH), vormiaazijn (FA), en ammoniumformaat (AFNH₄) werden aangeschaft bij VWR Chemicals (Frankrijk) en waren allemaal HPLC-kwaliteit. HPLC-kwaliteit water (minimale resistiviteit 18,2 MΩ) werd in-house geproduceerd door ELGA Millipore systeem (Frankrijk). DOTAU (CAS-nummer: 868226-06-6) en diC₁₆dT (CAS-nummer: 1160002-70-9) werden in het lab gesynthetiseerd volgens het protocol gerapporteerd in referenties. Sorafenib, 4-[4-[[4-chloor-3-(trifluormethyl)fenyl]carbamoilamino]fenoxy]-N-methyl-pyridine-2-carboxamide (CAS-nummer: 284461-73-0) werd aangeschaft bij SynVec.

Chromatografische studies

Een omgekeerde-fase UHPLC-methode (ultra hoge-prestatie vloeistofchromatografie) werd ontwikkeld voor nucleolipide (DOTAU en diC₁₆dT) en sorafenib kwantificering in SLNs. Voor injectie in HPLC, werden waterige oplossingen van nanopartikels verdund met ethanol met factoren 5 en 10, om nucleolipiden en sorafenib respectievelijk te kwantificeren.

Een chromatografisch systeem UHPLC UltiMate 3000 van Dionex-Thermo Scientific (VS), bestaande uit een pomp met een kwaternair klepsysteem voor kolomselectie, een getemperde auto-sampler, en een getemperde kolomcompartiment, werd gebruikt. De scheiding werd uitgevoerd met de kolom Syncronis C18 50 × 2,1 mm, 1,7 μm. De mobiele fase bestond uit 70/30 MeOH/25 mM ammoniumacetaat (pH = 7,4) (A) en 26,5 mM ammoniumacetaat in MeOH (pH = 7,9) (B). Een stroomsnelheid van 0,2 mL/min werd gebruikt, en het gradientprofiel was 0–2 min, 0–100% B; 2–20 min, 100% B. De kolomtemperatuur was ingesteld op 25 °C. De detectie werd uitgevoerd bij 267 nm voor sorafenib en diC₁₆dT en 257 nm voor DOTAU. Het geïnjecteerde volume was 1 μL leidend tot kwantificeringslimieten van 0,6 ng voor sorafenib en 15 ng voor beide nucleolipiden en DOTAU en diC₁₆dT.

Standaardcurven voor sorafenib, DOTAU, en diC₁₆dT in ethanol zijn getoond in Bijlage 1: Figuren SI1, SI2, en SI3, respectievelijk.

Bereiding van sorafenib nanopartikels

Tien milligram sorafenib werd opgelost in 1 mL ethanol, en 10 mg NLs (zowel diC₁₆dT of DOTAU) werd opgelost in 1 mL ethanol. Honderd microliter NLs, 100 μL sorafenib oplossingen, en 800 μL ethanol werden samen gemengd bij kamertemperatuur en druppelgewijs toegevoegd aan 10 mL gedistilleerd water onder magnetisch roeren. De oplossing werd in een ultrasoonbad geplaatst voor 90 min bij 25 °C. Ethanol werd onder vacuüm verwijderd bij 30 °C, en het volume werd aangepast op 1 mL. Deze oplossing werd tweemaal gesonicatieerd met een ultrasoonde sonda van 6 mm (Vibracell 75186) gedurende 10 min bij 100% amplitude met puls van 2 sec elke 5 sec. Eén milliliter werd gedialyseerd tegen 30 mL gedistilleerd water voor 3 × 15 min. Dit volume werd aangepast op 2 mL en bewaard voor karakterisatie, kwantificering en stabiliteitsstudies. Ook werden controle-experimenten uitgevoerd met hetzelfde protocol in afwezigheid van nucleolipiden.

Transmissie-elektronenmicroscopie (TEM en EDX)

Nanopartikels werden gevisualiseerd door negatieve kleuring microscopie. Tien microliter nanopartikels werd overgebracht naar een koolstof-gecoate koperen rooster voor 10 min. Het monster werd vervolgens gedroogd en gekleurd met 2,5% (w/w) uranylacetaat in water voor 2 min. De monsters werden waargenomen met een Hitachi H 7650 elektronenmicroscoop. Energie-dispersieve Röntgenspectroscopie werd uitgevoerd met een TECNAI transmissie-elektronenmicroscoop gekoppeld met Quantax-X-Flash SVE 6.

Deeltjesgrootte en Zeta-bepaling

Deeltjes zeta en grootte werden bepaald met een Zetasizer NanoZS, Malvern. Experimenten werden uitgevoerd met 40 μL van de nanopartikels verdund in 400 μL water, en metingen werden uitgevoerd bij 25 °C.

Cytotoxiciteitsanalyse

HuH7 en HepG2 werden in monolag gegroeid in DMEM-Glutamax aangevuld met 10% foetale kalfserum. MDA-MB-134 en T-47D werden in monolag gegroeid in RPMI aangevuld met 10% foetale kalfserum (voor T-47D alleen, niet-essentiële AA 1X, glucose 0,45%, insuline 10 mg L⁻¹, en natriumpyruvaat 1X). Alle kweekreagentia waren van Invitrogen. 10⁴ cellen/put in 90 μL volledig kweekmedium werden gezaaid in een 96-put plaat en geïncubeerd voor 24 uur bij 37 °C en 5% CO₂, voordat 10 μL van SLN of sorafenib in het kweekmedium werd toegevoegd. Sorafenib werd opgelost in kweekmedium met 0,1% DMSO. Let op dat in deze omstandigheden de maximale concentratie van sorafenib zonder neerslag 5 μM was, terwijl voor SLNs geladen met sorafenib de maximaal geteste concentratie 120 μM was zonder DMSO. Na 4 dagen incubatie werd de cellevensvatbaarheid beoordeeld met de formazan-gebaseerde proliferatie-assay (CellTiter 96® Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay kit, Promega), door 20 μL/put van reagentoplossing toe te voegen. Na een 30-min incubatie bij 37 °C, 5% CO₂, werd de absorbantie van elke put gemeten bij een golflengte van 492 nm met een Berthold spectrophotometer. Resultaten worden uitgedrukt als het percentage van \( \frac{{\mathrm{OD}}_{492}\ \mathrm{van}\ \mathrm{behandelde}\ \mathrm{cellen}-{\mathrm{OD}}_{492}\ \mathrm{van}\ \mathrm{blanco}}{\ {\mathrm{OD}}_{492}\mathrm{van}\ \mathrm{onbehandelde}\ \mathrm{cellen}-{\mathrm{OD}}_{492}\ \mathrm{van}\ \mathrm{blanco}} \).

Cellevensvatbaarheidsstudies

HuH7 werden gekweekt zoals eerder beschreven in de sectie "Cytotoxiciteitsanalyse". De cellevensvatbaarheid werd uitgevoerd na 4 dagen incubatie met SLN⁺ geladen met sorafenib bij verschillende concentraties (0, 1, 5, 10, 25, 50, en 100 μM) met behulp van live/dead cellevensvatbaarheidsassay (Invitrogen). Kortom, het kweekmedium werd verwijderd, en adhrerende cellen werden eenmaal gewassen met Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS). Tweehonderd microliter HBSS bevattende 2 μM calceine acetoxymethyl ester en 4 μM ethidium homodimer-1 werd aan elke put toegevoegd en geïncubeerd voor 45 min bij 37 °C en 5% CO₂. Na kleuring werden de cellen eenmaal gewassen met HBSS en microscopisch gebeeld op een geïnverteerde fluorescentiemicroscoop. Het percentage dode cellen werd beoordeeld door fluorescentie-geactiveerde cel-sortering (FACS) analyse. Na kleuring met 4 μM ethidium homodimer-1 oplossing, werden cellen behandeld met trypsine en tweemaal gewassen met fosfaat-gebufferde zoutoplossing (PBS) door centrifugatie bij 1000 rpm gedurende 5 min. Data werden verkregen op LSRFortessa stroomcytometer van Becton Dickinson, en de resultaten werden geanalyseerd met DIVA software. Een monster dode cellen werd bereid met 70% methanol en gebruikt als controle.

Resultaten en discussie

Synthese en karakterisering van SLNs

De non-toxiciteit en de zelfassemblage-eigenschappen van de nucleolipiden maken ze ideale amphifiele adjuvanten voor het inkapselen van hydrofobe geneesmiddelen zoals sorafenib. In deze studie werd een eenvoudige nanoprecipitatieprocedure ontwikkeld om de lage wateroplosbaarheidseigenschappen van sorafenib aan te pakken en de antikankeractiviteit te verbeteren, wat in veel gevallen het klinische gebruik beperkt. Wat de wateroplosbaarheid betreft, hypothesizeerden we dat de hydrofobe karakteristiek, de heterocyclen, en waterstofbrugfuncties van sorafenib de interacties met nucleolipiden en de vorming van nano-objecten zouden bevorderen. Ook werd verwacht dat SLNs geladen met sorafenib de antitumoractiviteiten zouden verhogen door de cellulaire opname van sorafenib te verbeteren. Inderdaad, in een van onze eerdere studies uitgevoerd op cisplatijn-nanopartikels, toonden we aan dat de verbetering van antitumoractiviteiten van cisplatijn te wijten was aan een verhoogde hoeveelheid geneesmiddel geïternaliseerd in kankercellen. Onze nanoprecipitatieproces omvat drie stappen: (i) de oplossing van sorafenib in ethanol bij 40 °C (10 mg/mL sorafenib, 100 μL) en toevoeging van één equivalent nucleolipide (zowel een anionisch nucleotide-lipide, de diC₁₆-3'-dT [thymidine 3'-(1,2-dipalmitoil-sn-glycero-3-fosfaat)] of een kationisch nucleoside-lipide DOTAU, 100 μL van een oplossing van 10 mg/mL in ethanol; (ii) 1 mL van de ethanoloplossing wordt druppelgewijs bij kamertemperatuur toegevoegd aan 10 mL gedistilleerd water; en (iii) de resulterende suspensie werd verdampt om het overtollige ethanol te verwijderen en gesonicatieerd.

Chromatografische studies

Om de geneesmiddelladingcapaciteiten van de nieuwe formuleringen te evalueren, werd een omgekeerde-fase UHPLC-methode ontwikkeld. Met deze HPLC-methode werd de gelijktijdige scheiding van sorafenib en nucleolipiden bereikt in 12 min, wat de individuele kwantificering van verbindingen in SLNs toelaat.

Ladingverhoudingen (massaverhoudingen van sorafenib/nucleolipiden in nanopartikels) van 50 en 80% en inkapselingsopbrengsten van sorafenib rond 55 en 75% werden verkregen voor formuleringen samengesteld uit sorafenib/DOTAU (SLN⁺) en sorafenib/diC₁₆dT (SLN⁻), respectievelijk. Tijdens het controle-experiment uitgevoerd in afwezigheid van nucleolipide, werd ongeveer 90% van sorafenib verloren tijdens de verschillende stappen van de formulering waarschijnlijk door de lage oplosbaarheid van sorafenib in water. Dit resultaat toont aan dat nucleolipiden nodig zijn om sorafenib op te lossen en de SLNs te stabiliseren.

Fysicochemische studies

Dynamische lichtverstrooiing (DLS) experimenten werden uitgevoerd om de vorming van SLNs te karakteriseren. Zowel negatieve als positieve nucleolipiden (diC₁₆dT en DOTAU) vormen vergelijkbare niet-sferische nanopartikels met parallelepipede vormen in waterige oplossing met een monodispersiteit (polydispersiteitsindex, PDI = 0,202 en 0,289; grootte = 335,2 en 304,4 nm, respectievelijk). Zoals verwacht, hangen de zetapotentialen van SLN-gebaseerde objecten af van de nucleolipide polaire koppen (ζ = +59,1 en −54,9 mV voor SLN⁺ en SLN⁻). De aanwezigheid van sorafenib in de NP werd gevalideerd door TEM-beeldvorming en EDX-acquisities van een SLN− werden gerealiseerd met EDX-acquisities. Fig. 2e, f toont I en II plekken. Plek I in Fig. 2f vertoont de emissie van chlooratoom (plek I, Fig. 2e, f) wat de aanwezigheid van sorafenib aangeeft (zie chemische structuur Fig. 2f). Let op dat chloor alleen aanwezig is in plek I en niet in plek II (Fig. 2f).

Belangrijk is dat in controle-experimenten de nanoprecipitatie van sorafenib in afwezigheid van nucleolipide geen nano-objecten opleverde, wat aantoont dat de nucleolipiden de vorming en stabilisatie van de SLNs mogelijk maken.

Stabiliteitsstudies

Colloidale stabiliteit van SLN⁺ en SLN⁻ werd gemeten door DLS en zetapotentiaal bij twee temperaturen. In het geval van diC₁₆dT-gebaseerde formuleringen, werd de grootte van SLN⁻ niet gewijzigd na 30 dagen bij zowel 4 als 37 °C, wat een hoge stabiliteit van die nanopartikels aangeeft. Zulke stabiliteit kan worden verklaard door de aard van de interacties (betreffende H-bindingen, π-π stacking, lading/lading interactie) die optreden tussen de diC₁₆dT en sorafenib. Echter, voor DOTAU-gebaseerde formuleringen, waren SLN⁺ alleen stabiel bij 4 °C gedurende 30 dagen zoals onthuld door DLS-studies, terwijl bij 37 °C een toename van zowel grootte als PDI werd waargenomen. Deze relatieve onstabiliteit waargenomen bij 37 °C in het geval van SLN⁺ kan worden verklaard door afstotende coulombische interacties die optreden tussen de positieve ladingen van zowel sorafenib als DOTAU. Interessant, de colloidale stabiliteitsstudies geven aan dat het mogelijk is om de stabiliteit, en dus de afgifte van sorafenib van de SLNs naar de fysiologische omgeving, te moduleren, afhankelijk van het nucleolipide dat gebruikt wordt voor de stabilisatie van de SLNs. De stabiliteitsmodulatie kan aantrekkelijk zijn afhankelijk van de benodigde vrijgavekinetiek.

Parallel aan de colloidale stabiliteit, werd de chemische stabiliteit van sorafenib, DOTAU, en diC₁₆dT in de SLN-gebaseerde formuleringen onderzocht als functie van de tijd bij 4 en 37 °C met behulp van een nieuwe chromatografische methode. Kinetische studies bij beide temperaturen worden getoond in Fig. 3b en Bijlage 1: SI5 voor DOTAU-SLNs en diC₁₆dT-SLNs, respectievelijk. De resultaten tonen aan dat sorafenib en diC₁₆dT moleculen in formuleringen stabiel blijven over ten minste 1 maand, wat een lange-termijn chemische stabiliteit bij beide temperaturen in het geval van SLN⁻ aangeeft. Echter, een afname van DOTAU gedurende de tijd werd waargenomen in de SLN⁺ formuleringen. Eerst, bij 4 °C, werden verliezen van ongeveer 12% over 7 dagen en 20% over 30 dagen gemeten. Bij verhoging van de temperatuur, nam de DOTAU-stabiliteit af met een verlies van 55% over 7 dagen en tot 95% over 30 dagen bij 37 °C. Zulke verschillen in chemische stabiliteit tussen nucleolipiden waren al eerder aangetoond tijdens eerdere stabiliteitsstudies.

Biologische studies

SLN-cytotoxiciteit werd geëvalueerd door metabolische activiteiten en morfologieën van cellen. MTT-assay maakte het mogelijk om vrije sorafenib (in 0,1% DMSO) en SLNs geladen met het geneesmiddel te vergelijken op vier cellijnen, waaronder twee hepatocellulaire carcinomen (HuH7 en HepG2) en twee luminale borstkankers (MDA-MB-134 en T-47D). Eerst, bij concentraties dicht bij de maximale oplosbaarheid van vrije sorafenib (5 μM sorafenib in 0,1% DMSO, 2,8 μM voor sorafenib/DOTAU, en 4 μM voor sorafenib/diC₁₆dT nanopartikels), remden beide SLNs de cellevensvatbaarheid beter dan vrije sorafenib. Zoals getoond in Fig. 4b, gaf een cellevensvatbaarheidsstudie uitgevoerd op MDA-MB-134 cellen aan dat de activiteit van vrije sorafenib beperkt is door de wateroplosbaarheid (100% cellevensvatbaarheid bij [sorafenib] = 5 μM), terwijl IC₅₀ waarden van 15 en 50 μM waargenomen werden voor SLN⁺ en SLN⁻, respectievelijk. In een FACS-studie uitgevoerd op HuH7, werd een IC₅₀ van ruwweg 50 μM verkregen. Beelden van contrastfasemicroscopie tonen inderdaad een verminderde dichtheid van de cellagen behandeld met SLN⁻ en SLN⁺ vergeleken met onbehandelde of sorafenib-behandelde cellen zonder verandering van de celmorfologie. Tweedens, vergelijkbare experimenten werden uitgevoerd bij hogere concentraties van SLNs ([sorafenib] = 120 en 84 μM voor SLN⁻ en SLN⁺, respectievelijk) en vergeleken met vrije sorafenib bij de oplosbaarheidsgrens (concentratie van 5 μM). In deze omstandigheden vertonen beide SLNs een sterk cytotoxisch effect op de vier kankercellijnen. Zoals onthuld op de contrastfasemicroscopie-afbeeldingen, werd celdetritus waargenomen voor zowel SLN⁻ als SLN⁺ wat celdood bevestigt, terwijl cellen levend bleven in het geval van vrije sorafenib. Het is de moeite waard op te merken dat sterke cytotoxische effecten voor beide SLNs waargenomen werden in het geval van luminale B borstkankercellen. Zulke antitumorale effecten, die nog niet eerder gerapporteerd waren, openen nieuwe mogelijke therapeutische toepassingen van sorafenib dankzij de SLNs.

Conclusie

We rapporteren een nieuwe benadering gebaseerd op nucleolipiden die de efficiënte inkapseling en afgifte van sorafenib toestaat. Onze onderzoeken tonen de vorming van twee typen vaste lipide nanopartikels (SLNs) hoog geladen met sorafenib. Deze SLNs, die ofwel negatieve of positieve zetapotentiaalwaarden vertonen, hebben parallelepipede vormen. Zoals onthuld door de DLS- en HPLC-studies, kan de stabiliteit van de SLNs gemoduleerd worden afhankelijk van het gebruikte nucleolipide. Belangrijk is dat zowel SLN⁺ als SLN⁻ formuleringen in staat zijn om de wateroplosbaarheid van sorafenib dramatisch te verbeteren (concentraties hoger dan 120 μM). Zulke SLNs vertonen betere antitumorale activiteiten op vier kankercellijnen (lever- en borstkanker) vergeleken met vrije sorafenib, wat beperkt is door het gebrek aan oplosbaarheid in water. Contrastfasemicroscopie-afbeeldingen, opgenomen op de vier kankercellijnen, vertonen een drastische celdood bij incubatie met 120 μM SLN⁻ of 84 μM SLN⁺. Daarom kan dit geneesmiddel gebruikt worden als nieuwe therapeutische opties in het geval van leverkankers (gebruik van sorafenib in intra-arteriële chemotherapie, bijvoorbeeld) of borstkankers. Voor zover we weten, is dit rapport het eerste voorbeeld van een studie die sorafenib gebruikt tegen luminale B borstkankers wat de bruikbaarheid van de SLN-benadering aantoont. Alles samengenomen, de resultaten gerapporteerd in deze bijdrage benadrukken het potentieel van nucleoside-lipide-gebaseerde SLNs als geneesmiddelafgiftesystemen.

Afkortingen

AFNH₄:

Ammoniumformaat

DLS:

Dynamische lichtverstrooiing

FA:

Vormiaazijn

HCC:

Hepatocellulair carcinoom

HPLC:

Hoge-prestatie vloeistofchromatografie

LNs:

Lipide nanopartikels

MeOH:

Methanol

PDI:

Polydispersiteitsindex

RCC:

Niercelcarcinoom

SLNs:

Vaste lipide nanopartikels

UHPLC:

Ultra hoge-prestatie vloeistofchromatografie