SPIO verbetert de kruispresentatie en migratie van DC's en anionische SPIO beïnvloedt de nanoadjuvante effecten gerelateerd aan interleukine-1β

Resultaten

Karakterisering van SPIO

De morfologie en grootte van de gesynthetiseerde SPIO werden waargenomen via TEM. Het TEM-beeld toonde aan dat SPIO een gemiddelde grootte had van 8,7 nm en een bolvorm (figuur 1a). De XRD-analyse toonde zes pieken die duidelijk overeenkwamen met de standaard γ-Fe₂ O₃ reflecties (Fig. 1b). De resultaten van de vibrerende magnetometer toonden aan dat de verkregen SPIO superparamagnetisch gedrag bezat, met een verzadigingsmagnetisatie van 60,4 emu/g beter dan Fe₃ O₄ (Fig. 1c). De DLS-plot toonde aan dat de grootteverdeling van de SPIO 22 nm in oplossing is (figuur 1d). Om te bevestigen dat de DC's SPIO bevatten, werd Pruisische blauwe kleuring uitgevoerd om te verifiëren dat de DC's ijzer bevatten (Fig. 1e).

Karakterisering van SPIO. een TEM-afbeelding van de verkregen SPIO. b XRD-patroon van de nanodeeltjeskatalysator die aangeeft dat het materiaal γ-Fe₂ . is O₃ . c Magnetisatiecurves van de verkregen SPIO en Fe₃ O₄ nanodeeltjes. d Hydrodynamische diameter van SPIO. e Morfologie van de DC's gelabeld met 50 μg/mL SPIO na 12 uur incubatie:niet-gelabelde DC's en Pruisische blauwe vlek-gelabelde DC's

SPIO-geactiveerde kruispresentatie van DC's

Om het effect van SPIO-gelabelde DC's op T-celactivering in een muizensysteem verder te bestuderen, is het niveau van B₃ Z T-celactivering werd bepaald door het onderzoeken van de productie van p-galactosidase door middel van een CPRG-assay. In deze studie werd een vaste concentratie van 100 μg/ml OVA en vijf dosisverhoudingen van SPIO (1, 5, 10, 25 en 50 μg/ml na 6 uur) aangenomen. Naarmate de concentratie van SPIO toenam, nam de mate van activering van B₃ Z-cellen namen geleidelijk toe en bereikten stabiliteit bij 25 g / ml (figuur 2a). Om te onderzoeken of de levensvatbaarheid van DC's gelabeld met de verschillende concentraties SPIO werd beïnvloed, werden de DC's en SPIO-gelabelde DC's geanalyseerd via FCS na Annexin V- en PI-kleuring. De resultaten gaven aan dat het totale percentage Annexine V/PI DC's bij SPIO-concentraties van 10, 25 en 50 g/ml niet significant verschilde, terwijl het percentage apoptotische cellen toenam na belading met 100 μg/ml SPIO (Fig. 2b ). De co-stimulerende oppervlaktemoleculen van de DC's die waren gelabeld met verschillende concentraties SPIO werden waargenomen door FCS. De expressie van CD80 en CD86 had een detecteerbare toename bij 25 g / ml vergeleken met die zonder SPIO-labeling (figuur 2c). DC's gelabeld met 25 g / ml SPIO vertoonden geen veranderingen in celapoptose op verschillende tijdstippen (figuur 2d). We gebruikten 25 μg/ml in de volgende experimenten.

Invloeden van DC-kruispresentatie en biocompatibiliteit na labeling met SPIO. een Kruispresentatie van DC's verbeterd bij verschillende SPIO-concentraties. b Apoptotische DC's en SPIO-gelabelde DC's onderzocht door FCS in verschillende concentraties (10, 25, 50 en 100 μg/ml). c Fenotypen van de DC's, waaronder CD11c ⁺ CD80 ⁺ en CD11c ⁺ CD86 ⁺ na labeling met SPIO (10, 25, 50 μg/ml). DC's gestimuleerd met LPS (1 μg/ml) werden gebruikt als positieve controles. d Apoptotische DC's geladen met 25 μg/ml SPIO onderzocht door FCS op verschillende tijdstippen (6, 12, 18 en 24 uur)

Etikettering van EGFP-DC's met SPIO Enhanced EGFP-signalen in secundaire lymfeklieren

EGFP-DC's werden met succes afgeleid van EGFP-transgene muizen in vitro, en confocale fluorescentiemicroscopiebeelden toonden aan dat bijna alle EGFP-DC's groene fluorescentie vertoonden (figuur 3a). Om te onderzoeken of de groene fluorescentie van de EGFP-DC's kan worden beïnvloed door SPIO, werd FCS uitgevoerd. De resultaten toonden aan dat de expressie van EGFP-fluorescentie niet was verzwakt na SPIO-labeling (Fig. 3b, c). Vervolgens werden de 25 g / ml SPIO-gelabelde EGFP-DC's geïnjecteerd in de rechter achtervoetzolen van C57BL/6-muizen en niet-gelabelde EGFP-DC's werden in de andere kant geïnjecteerd. De EGFP-signalen werden gemeten in de popliteale lymfeklier (PLN) en inguinale lymfeklier (ILN), die respectievelijk de schildwachtlymfeklieren en secundaire lymfeklieren zijn. De resultaten toonden aan dat de migratie van SPIO-gelabelde EGFP-DC's en ongelabelde EGFP-DC's in de schildwachtklieren een piek bereikte op dag 7. Significante verschillen in het EGFP-signaal werden niet waargenomen tussen de twee groepen, terwijl een significante vermindering werd gedetecteerd in de PLN-groep op dag 14. De EGFP-signalen die in de ILN-groep werden gedetecteerd, kwamen overeen met die van de SPIO-gelabelde EGFP-DC-groep op de 4e en 7e dag, wat aangaf dat de SPIO-gelabelde DC's migreerden naar de secundaire lymfeklieren knooppunten (Fig. 3d-f).

Migratie en locatie van EGFP-DC's na labeling met SPIO. een Laser scanning confocale microscopie van EGFP-DC's gelabeld met 25 g/mL SPIO nanodeeltjes na 12 uur incubatie. b , c Fluorescentie-intensiteit van de SPIO-gelabelde EGFP-DC's na 12 uur. In vitro optische beeldvorming van drainage lymfeklieren na de rugtransfusie van SPIO-gelabelde EGFP-DC's op verschillende dagen. TNF-α werd vooraf eerst in het muisvoetkussen geïnjecteerd om de migratie van EGFP-DC's te bevorderen. d –e In vitro optische beeldvorming en signaalintensiteitsanalyse van lymfeklieren op verschillende dagen na injectie van EGFP-DC's met of zonder SPIO. v EGFP-positieve cellen van drainerende lymfeklieren werden gedetecteerd door confocale lasermicroscopie

Anders geladen, gewijzigde SPIO-aangetaste muizen-DC's kruispresentatie

De SPIO was gecoat met APTS of DMSA. Om de oppervlaktelading van de SPIO te verifiëren, hebben we de zeta-potentiaalkarakteristiek gemeten. De zeta-potentialen van de SPIO/A ⁺ en SPIO waren positief, terwijl het zeta-potentieel van de SPIO/D ⁻ vertoonde een negatieve lading in oplossing wanneer de pH-waarde 7 was (Fig. 4a). De ultrastructuur van de SPIO-gelabelde DC's bedekt met verschillend geladen polymeren werd waargenomen via TEM. De met SPIO behandelde DC's leken elektronendicht in vergelijking met onbehandelde cellen, en talrijke SPIO's waren samen geclusterd in het cytoplasma. De SPIO/A ⁺ werden opgeslokt door endosomen in het cytoplasma, terwijl een grotere hoeveelheid SPIO/D ⁻ werden gevonden in het cytoplasma van de DC's, en bijna al deze nanodeeltjes waren omgeven door membraanstructuren met meerdere lagen die op lysosomen leken (figuur 4b). We onderzochten of de tegengesteld geladen SPIO verschillende niveaus van IL-1β kon veroorzaken. Volgens onze resultaten zijn DC's geladen met SPIO/A ⁺ en SPIO/D ⁻ induceerde een dosisafhankelijke secretie van IL-1β. Ongeacht de concentratie vonden we dat SPIO/D ⁻ induceerde significant hogere niveaus van IL-1β dan SPIO/A ⁺ (Fig. 4c). Vanwege de duidelijke correlatie tussen IL-1β en de TLR3-route, werden DC's afgeleid van TLR3-knockout-muizen en samen gekweekt met SPIO/A ⁺ om het effect van IL-1β op T-celactivering verder te bestuderen. , SPIO/D ⁻ , en OVA. De DC's geladen met SPIO/A ⁺ + OVA zou effectief B₃ . kunnen activeren Z T-cellen, wat betekent dat het TLR3-molecuul in de DC's absoluut noodzakelijk was voor kruispresentatie (Fig. 4d).

SPIO gecoat met verschillende ladingen beïnvloedde DC-kruispresentatie en IL-1β-secretie. een Het pH-afhankelijke zeta-potentieel van SPIO gecoat met verschillend geladen moleculen. b Locaties van nanodeeltjes met verschillende ladingen in DC's onder TEM. c IL-1β geïnduceerd door SPIO gecoat met verschillend geladen moleculen. d Kruispresentatie van SPIO/A ⁺ +OVA en SPIO/D ⁻ + OVA door DC's via de TLR3-route

SPIO gemodificeerd met tegengesteld geladen coatings bevorderde antigeen kruispresentatie door menselijke DC's en werden beïnvloed door IL-1β

Om de relatie tussen IL-1β en kruispresentatie te onderzoeken, selecteerden we de caspase-1-remmer YVAD en ontdekten dat deze de IL-1β-uitscheiding van menselijke DC's significant kon remmen na voorbehandeling met 50 μM lipopolysaccharide (LPS) gedurende 3 uur (Fig. . 5a). Bovendien vonden we dat YVAD de secretie van IL-1β door menselijke DC's veroorzaakt door SPIO/A ⁺ kon remmen. en SPIO/D ⁻ (Fig. 5b). Vervolgens hebben we onderzocht of menselijke DC's kunnen worden gebruikt als effectieve APC's en CMV pp65 kunnen kruisen met CEF-specifieke T-cellen. Om de antigeen-kruispresentatie te meten, werd intracellulaire kleuring (ICS) geïntroduceerd om het percentage antigeenspecifieke CD3 ⁺ te bepalen. CD8 ⁺ IFN-γ ⁺ en CD3 ⁺ CD4 ⁺ IFN-γ ⁺ T-cellen door FCS. DC's geladen met SPIO/A ⁺ gecombineerd met het CMV pp65-eiwit induceerde meer CD3 ⁺ CD8 ⁺ IFN-γ ⁺ en CD3 ⁺ CD4 ⁺ IFN-γ ⁺ T-cellen dan DC's geladen met SPIO/D ⁻ . Onze gegevens toonden aan dat de caspase-1-remmer YVAD de T-celreacties veroorzaakt door de SPIO/D ⁻ significant verhoogde. + CMV pp65-eiwit, terwijl het gedeeltelijk de T-celreacties remde die werden geïnduceerd door de SPIO/A ⁺ + CMV pp65-eiwit (Fig. 5c, d). Deze resultaten gaven aan dat een matig niveau van IL-1β-activering nodig is voor efficiënte kruispresentatie en dat een hoog niveau van IL-1β-activering kruispresentatie in DC's onderdrukt.

SPIO gecoat met tegengestelde ladingen beïnvloeden de functie van menselijke DC's via de IL-1β-route. een Na voorbehandeling door LPS gedurende 3 uur werden menselijke DC's geïncubeerd met toenemende concentraties YVAD (1, 10, 25 en 50 μM), en vervolgens werden de supernatanten verzameld voor een ELISA van IL-1β. b YVAD kan de secretie van IL-1β door menselijke DC's remmen via SPIO/D ⁻ . SPIO/A ⁺ , en SPIO/D ⁻ invloed hebben op de DC-kruispresentatie die wordt beïnvloed door IL-1β. c CD3 ⁺ CD8 ⁺ IFN-γ ⁺ en d CD3 ⁺ CD4 ⁺ IFN-γ ⁺ T-cellen werden geanalyseerd door intracellulaire kleuring met FCS

Discussie

Immunotherapie is sinds de ontwikkeling van de biotechnologie een onderzoeksfocus geweest in klinische en experimentele studies. Eerdere klinische onderzoeken met traditionele DC-vaccins die zijn ontworpen om immuniteit op te wekken, hebben echter niet voldoende immuunresponsen opgewekt [26]. Nanodeeltjes vertegenwoordigen een soort adjuvans en kunnen de functie van DC's om T-cellen te activeren bevorderen [27]. De meest karakteristieke kenmerken van onze SPIO zijn hun biocompatibiliteit en hun toepassing van het labelen van DC's als een immuunadjuvans. De TEM-afbeeldingen laten zien dat onze SPIO een gemiddelde grootte van 8,7 nm heeft in droge toestand en een bolvorm (Fig. 1a). Pruisische blauwe kleuring toonde aan dat de SPIO vatbaar zijn voor fagocytering door DC's (Fig. 1e), wat de efficiëntie van de inname aangeeft.

Van SPIO is gemeld dat het brede biomedische toepassingen heeft, zoals bij cellulaire labeling, medicijnafgifte, MRI en magnetische hyperthermie [28], allemaal toepassingen die biocompatibiliteit vereisen. Daarom moet worden onderzocht of DC's die zijn gelabeld met SPIO een invloed hebben op DC-apoptose. Onze gegevens suggereerden dat er geen significant verschil was in DC-apoptose wanneer DC's werden gelabeld met minder dan 50 μg / ml SPIO (figuur 2b). In de volgende studie kozen we OVA-eiwit als modeleiwit en B₃ Z T-cellen als effectieve T-cellen om te observeren of SPIO de kruispresentatie van DC's kan beïnvloeden. Onze resultaten geven aan dat SPIO-gelabelde DC's de kruispresentatie van OVA en de activering van B₃ aanzienlijk kunnen vergemakkelijken Z T-cellen. De oppervlaktemoleculen CD80 en CD86, die markers zijn van rijpe DC's, zijn twee kritische co-stimulerende factoren die nodig zijn voor T-celactivering. Bij 25 μg/ml is de geactiveerde B₃ Z T-cellen namen toe met de dosis nanodeeltjes en stabiliseerden uiteindelijk (figuur 2a). Bovendien bereikte de expressie van CD80 en CD86 op het oppervlak van DC's een maximum (figuur 2c). Daarom hebben we de concentratie van 25 μg / ml aangenomen en ontdekten dat de apoptose van DC's tijdonafhankelijk is (figuur 2d), wat de uitstekende nanoadjuvante functies en biocompatibiliteit van SPIO aantoonde.

Om de invloed van SPIO op DC-migratie te onderzoeken, gebruikten we EGFP-DC's, die groene fluorescentie vertoonden onder de confocale fluorescentiemicroscopie, om gedurende 12 uur samen te kweken met 25 μg / ml SPIO. We hebben waargenomen dat de expressie van EGFP-fluorescentie niet verzwakte na SPIO-labeling. Uiteindelijk is de migratie van DC naar de secundaire lymfoïde organen de belangrijkste parameter voor het beoordelen van de effectiviteit van op DC gebaseerde vaccins. In onze vorige studie werden gedurende de eerste 24 uur SPIO-gelabelde DC's niet in een significante hoeveelheid gedetecteerd in de secundaire lymfeklieren [29]. Om verder te bepalen of dit fenomeen met de tijd veranderde, werden zowel gelabelde als niet-gelabelde EGFP-DC's verzameld en geïnjecteerd in de voetzolen van muizen om het potentieel van SPIO bij de migratie van DC's te evalueren. Onze resultaten toonden aan dat groene fluorescentie verscheen in de ILN op dag 4 en 7 (Fig. 3d-f), wat aantoont dat SPIO de migratie van EGFP-DC's naar de secundaire lymfeklieren kan vergemakkelijken. Deze eigenschap kan worden toegepast om de uitzaaiing van tumoren te beperken en een grotere hoeveelheid CTL-cellen in meer lymfeklieren te activeren.

In onze studie hebben we de adjuvante eigenschappen van tegengesteld geladen SPIO onderzocht en het mogelijke mechanisme dat ten grondslag ligt aan de veranderingen in de functie van DC's. Het is aangetoond dat de oppervlaktelading van de ijzeroxide-nanodeeltjes invloed heeft op de cellulaire opname-efficiëntie [30, 31]. In ons eerdere onderzoek meldden we dat kationische SPIO de kruispresentatie van antigeen en bijgevolg T-celactivering zou kunnen verbeteren, terwijl anionische SPIO geassocieerd was met autofagie. [16] Verschillende metalen nanodeeltjes kunnen ontstekingsreacties veroorzaken [32, 33]. Van ijzeroxide-nanodeeltjes is gemeld dat ze NLRP3 activeren, de membranen van lysosomen scheuren, cathepsine B afgeven en IL-1β-secretie induceren [34]. We veronderstelden dus dat de tegengesteld geladen SPIO-nanodeeltjes verschillende functies zouden kunnen hebben bij het stimuleren van de productie van IL-1β in zowel muizen als menselijke DC's. In Fig. 4a toonde onze zeta-potentiaalanalyse aan dat met APTS gecoate SPIO positieve ladingen droeg, terwijl met DMSA gecoate SPIO negatieve ladingen droeg. Onder de TEM ontdekten we dat verschillend geladen SPIO op verschillende posities in het cytoplasma waren geclusterd (figuur 4b). Om het verschil te onderzoeken tussen de kruispresentatie van SPIO/A ⁺ en SPIO/D ⁻ , onderzochten we IL-1β-secretie in muizen-DC's geïnduceerd door verschillend geladen nanodeeltjes. We hebben de reacties van muizen-DC's beoordeeld na behandeling met SPIO/A ⁺ en SPIO/D ⁻ . Blootstelling aan SPIO/D ⁻ induceerde de openlijke activering van IL-1β-secretie in vergelijking met blootstelling aan SPIO/A ⁺ (Fig. 4c). Dit fenomeen onthulde gedeeltelijk dat de antigeen-kruispresentatie geïnduceerd door SPIO/D ⁻ is niet zo efficiënt als die veroorzaakt door SPIO/A ⁺ . Naast de CPRG-analyse van toenemende B₃ Z T-celactivering na de co-cultuur van muizen-DC's met SPIO/A ⁺ +OVA demonstrated that positively charged nanoparticles can perform better when used as immune adjuvants. Toll-like receptors (TLRs) are of importance for triggering immune responses, such as TLR3, and they can ultimately result in the production of inflammasomes, the activation of caspase-1 protein, and secretion of cytokine IL-1β [35]. To demonstrate whether TLR3 is related to the antigen cross-presentation influenced by our nanoadjuvant, TLR3 knockout DCs were employed in our study. TLR3 ^−/− DCs loaded with SPIO/A ⁺ +OVA and SPIO + OVA effectively stimulated the B₃ Z T cell activation (Fig. 4d), which indicates that the TLR3 molecule in DCs was necessary for cross-presentation. Collectively, these results elucidated that differently charged polymers on the surface of nanoparticles should be considered when investigating their synergistic effects on activated immune responses.

Our data show that the oppositely charged nanoparticles could induce the production of IL-1β, whereas SPIO/D ⁻ could hyperactivate the secretion of IL-1β. However, compared with SPIO/A ⁺ , SPIO/D ⁻ induced a lower level of B₃ Z T cell activation. Therefore, we speculate that aberrant IL-1β production may contribute to cellular dysfunction in DCs. Most studies on nanomaterial adjuvants exploit DCs from mice, whereas few have used DCs from humans [36, 37]. To further verify our hypothesis, we used YVAD, which has been proven to be an effective caspase-1 inhibitor (Fig. 5a, b), to suppress IL-1β secretion from human DCs. CMV pp65 protein was selected as the model antigen, and CEF-specific T cells expanded in vitro were used as responder cells. The CMV pp65 protein is an immunological dominant protein that readily activates CD8 ⁺ and CD4 ⁺ T cells to produce cytokines, particularly IFN-γ [38]. CEF peptide was used as a positive control to verify that the addition of YVAD would not affect the activation of T cells because it can be presented to the T cells directly. Intriguingly, with the use of YVAD, the T cell responses in the SPIO/A ⁺ group were slightly restrained, while the responses in the SPIO/D ⁻ group increased (Fig. 5c, d). The influence of IL-1β on DC cross-presentation provided conclusive evidence that a low level of IL-1β induced by SPIO/A ⁺ is needed for antigen cross-presentation, and a high level of IL-1β in the cytosol will inhibit the function of DCs.

Conclusies

As shown in the graphical abstract in Fig. 6, SPIO can promote the maturation, migration, and cross-presentation of DCs. Moderate IL-1β activity is partly related to the antigen cross-presentation of DCs. In addition, negatively charged nanoparticles can activate excessive IL-1β and subsequently inhibit the functions of DCs. In summary, our results indicate that SPIO exhibit many biological properties and have promising adjuvant potential. These findings will help identify the optimal choice of nanoadjuvants for the development of DC vaccines in the future.

Graphical abstract of SPIO as a nano-adjuvant for DCs. SPIO enhances the function of DCs by promoting the loading of DCs; thus, SPIO-labeled DCs can migrate to the ILNs active in an immune organ and may offer a new approach in cancer immunotherapy. Anionic-charged SPIOs activate protective IL-1β responses by triggering caspase-1 in DCs, thereby impairing antigen presentation to active T cells

Afkortingen

APCs:

Antigen-presenting cells

APTS:

3-Aminopropyltrimethoxysilane

ATP:

Adenosine triphosphate

CPRG:

Chlorophenol red-β-d-galactopyranoside

CTL:

Cytotoxic T cell

DAMPs:

Damage-associated molecular patterns

DC:

Dendritic cell

DMSA:

Meso-2, 3-dimercaptosuccinic acid

EGFP:

Enhanced green fluorescent protein

IL-1β:

Interleukin-1β

MHC-I:

Major histocompatibility complex class I

NLRP3:

NACHT, LRR, and PYD domains-containing protein 3

OVA:

Ovalbumin

PAMPs:

Pathogen-associated molecular patterns

SPIO:

Superparamagnetic iron oxide nanoparticles

SPIO/A ⁺ :

SPIO coated with APTS

SPIO/D ⁻ :

SPIO coated with DMSA

TLRs:

Toll-like receptors