Neoglycoproteïne-Gefunctionaliseerde Fluorescent Goude Nanoclusters voor Plant Lectine Detectie en Dendritische Cel Imaging

Inleiding

Gouden nanoclusters (AuNC's), bestaande uit 10–100 goudatomen, vertonen grootte-afhankelijke fluorescentie die ze aantrekkelijk maakt voor bio-sensing en imaging. In tegenstelling tot conventionele organische kleurstoffen of quantum dots, bezitten AuNC's een grote Stokes-verschuiving, rood-tot-bijna-IR emissie, en superieure fotochemische stabiliteit, wat toepassingen in het weefseltransparantievenster mogelijk maakt. Eiwit-getemplateerde AuNC's werden voor het eerst gerapporteerd met rundserumalbumine in 2009 en zijn sindsdien een veelzijdig platform geworden voor het ontwerpen van water-oplosbare, biocompatibele fluoroforen. Glycosyleerde eiwitten blijven echter onvoldoende onderzocht als nanocluster-scaffolds, ondanks de cruciale rol van glycanen in het moduleren van eiwitvouwing, stabiliteit en receptorbinding. Synthetische neoglycoproteïnen — eiwitten chemisch geconjugeerd met gedefinieerde koolhydraten — bieden een strategie om eiwitten nieuwe functionele eigenschappen te geven terwijl hun structurele integriteit behouden blijft.

In deze studie hebben we een synthetisch biantennair G0-glycaan benut, geconjugeerd aan ovalbumine (OVA) via een C5 aminolinker en disuccinimidyl suberaat, om G0-OVA-AuNC's te genereren. We onderzochten hun fysicochemische kenmerken, beoordeelden de glycaantoegankelijkheid door lectine-agglutinatietoetsen, en evalueerden hun capaciteit om dendritische cellen (DC's) in vitro te labeleren. De resultaten vestigen G0-OVA-AuNC's als robuuste, multivalente lectine-sensoren en krachtige imaging-agenten voor immuuncellen.

Resultaten en Discussie

We optimaliseerden de synthese van G0-OVA-AuNC's door een protocol voor niet-geconjugeerde OVA-AuNC's aan te passen. Een 15 mg mL⁻¹ OVA-oplossing werd gemengd met HAuCl₄·3H₂O (4,2 mM) en NaOH (150 mM) onder microgolfbestraaling (100 °C, 6 min), wat bleekbruine clusters opleverde die helder rode fluorescentie emitteren bij 670 nm na 350 nm excitatie. UV-Vis-spectra vertonen geen plasmon-resonantieband, wat deeltjesgroottes onder 5 nm bevestigt; TEM onthulde een gemiddelde kerndiameter van 1,9 ± 0,7 nm, en dynamische lichtspriding toonde een hydrodynamische diameter van 8,7 ± 2,5 nm, consistent met een enkel eiwit dat de kern omhult. De clusters vertoonden een kwantumopbrengst van ~4 % en bleven fotostabiel over pH 3–11 en in foetaal runderserum, wat geschiktheid voor biologische assays aangeeft.

Voor G0-gefunctionaliseerde clusters, werden G0-glycanen geconjugeerd aan OVA met DSS, wat neoglycoproteïnen opleverde met 2–3, 3–4 of 5–6 glycanen per eiwit (geverifieerd door SDS-PAGE en MALDI-TOF). daaropvolgende AuNC-vorming onder identieke omstandigheden produceerde G0-OVA-AuNC's wiens optische eigenschappen overeenkwamen met die van OVA-AuNC's: absorbantie bij 278 nm en een 670 nm emissiepiek. TEM bevestigde een kerndiameter van 1,6 ± 0,5 nm. CD-spectra wisten op een willekeurige spoel secundaire structuur, waarschijnlijk door de alkalische synthese, toch bleven de glycaan-moieties toegankelijk voor lectinebinding.

Lectine-agglutinatietoetsen met Bandeiraea simplicifolia lectine-II (BSL-II) en Solanum tuberosum lectine (STL) onthulden concentratie-afhankelijke fluorescentie-quenching voor G0-OVA-AuNC's (5/6), terwijl een controle-lectine (Aleuria aurantia, AAL) geen effect had. De quenching volgde lineaire kalibratiekrommen, met detectielimieten van 2,83 µM (BSL-II) en 2,35 µM (STL). G0-OVA-AuNC's met minder glycanen (2/3) agglutineerden niet, wat de noodzaak van multivalente glycaanpresentatie benadrukt. Agarosegel-elektroforese in celcultuurmedia bevestigde dat lectinebinding efficiënt bleef in complexe biologische omgevingen.

Confocale microscopie van muur splenische DC's (CD11c⁺) geïncubeerd met G0-OVA-AuNC's (3/4) toonde snelle internalisatie binnen 40 min, met fluorescentie gelokaliseerd intracellulair en afwezig in onbehandelde controles. 3-D reconstructies bevestigden intracellulaire clusterdistributie.

Samenvattend, presenteren we de eerste neoglycoproteïne-beschermde AuNC's, demonstreren hun selectieve lectineherkenning via multivalente glycanen, en vestigen hun capaciteit om dendritische cellen te imageren. Hun robuuste fluorescentie, wateroplosbaarheid en pH-stabiliteit maken ze veelbelovende alternatieven voor conventionele kleurstoffen voor koolhydraat-eiwit interactiestudies en immunologische imaging.

Conclusies

We hebben met succes G0-OVA-AuNC's gesynthetiseerd en gekarakteriseerd, de glycaantoegankelijkheid en lectine-specifieke agglutinatie bevestigd. De multivalente glycaanweergave was essentieel voor efficiënte kruislinkering, terwijl de clusters hoge fotostabiliteit en wateroplosbaarheid behielden. In vitro imaging van muur dendritische cellen valideerde de clusters als krachtige, zelf-fluorescerende probes. Deze bevindingen ondersteunen verdere verkenning van neoglycoproteïne-gefunctionaliseerde AuNC's als veelzijdige tools voor koolhydraat-eiwit interactie-assays, immuuncel imaging, en potentiële therapeutische toepassingen.

Methoden/Experimenteel

Materialen

Alle oplossingen werden bereid in ultrazuiver water (18 MΩ cm). Goud (III) chloride trihydraat, NaOH, en triethylamine waren van Sigma-Aldrich. Ovalbumine was aangeschaft van Hyglos. DSS en DMSO waren van Thermo Fisher. G0-glycaan was gesynthetiseerd zoals eerder beschreven.

AuNC's Synthese. Algemene Procedure

15 mg mL⁻¹ eiwit in ultrazuiver water werd gemengd met 4,2 mM HAuCl₄·3H₂O, 5 min geroerd, daarna werd 150 mM NaOH toegevoegd. Het mengsel werd verhit bij 100 °C gedurende 6 min in een microgolfreactor. Clusters gedialyseerd (10 kDa MWCO) tegen ultrazuiver water. Fluorescentie opgemeten op een Varioskan Flash platenlezer (λ_ex=350 nm). Agarosegel (0,75 %) en TEM (200 kV) werden gebruikt voor groottekarakterisatie. CD beoordeelde secundaire structuur. XPS bepaalde goudoxydatietoestanden.

Lectine-Agglutinatie Assay

G0-OVA-AuNC's (0,2 mg mL⁻¹) werden gemengd met lectines (AAL, STL, BSL-II) bij 0–10 µM in TSM-buffer. Na overnachten incubatie, werden monsters gecentrifugeerd en supernataantfluorescentie gemeten. Neerslag werd waargenomen onder UV voor STL.

Isolatie van Muis Splenische DC's

Milt van C57BL/6J muizen werden verwerkt tot enkelcel-suspensies. CD11c⁺ cellen werden geïsoleerd door magnetisch-geactiveerde celsorting (Miltenyi) en gekweekt op poly-D-lysine-gecoate dekklaasjes.

DC Opname van G0-OVA-AuNC's

DC's (2 × 10⁶ cellen) werden geïncubeerd met 150 µg mL⁻¹ G0-OVA-AuNC's (3/4) gedurende 40 min bij 37 °C, gewassen, gefixeerd met 3 % PFA, en geïmageerd op een Zeiss LSM 510 confocale microscoop (365 nm laser, 63× olie-objectief).

Afkortingen

AAL:

Aleuria aurantia lectine

AuNC's:

Gouden nanoclusters

BSA:

Rundserumalbumine

BSL-II:

Bandeiraea simplicifolia lectine-II

CD:

Circulaire dichroïsme

CLRs:

C-type lectine receptoren

DC's:

Dendritische cellen

DMSO:

Dymethylsulfoxide

DSS:

Disuccinimidyl suberaat ester

FBS:

Foetaal runderserum

G0:

Biantennair N-glycaan

G0-OVA-AuNC's:

Neoglycoproteïne-gefunctionaliseerde gouden nanoclusters

HAuCl₄·3H₂O:

Goud tetrachloorauur (III) zuur

IMDM:

Iscove's modified Dulbecco's medium

IR:

Infrarood

LOD:

Detectielimiet

MACS:

Magnetisch-geactiveerde celscheiding

OVA:

Ovalbumine

QY:

Kwantumopbrengst

STL:

Solanum tuberosum lectine

TEM:

Transmissie elektronenmicroscopie

XPS:

Röntgenfoto-elektronspectroscopie