Snelle, goedkope LSPR nanobiosensor voor accurate brucellose diagnostiek

Samenvatting

Brucellose blijft de meest voorkomende bacteriële zoonose wereldwijd. Conventionele diagnostiek – cultuur, serologie en PCR – lijden onder lange doorlooptijden, beperkte gevoeligheid of kruisreactiviteit. Hier presenteren we een goud-nanodeeltje gelokaliseerde oppervlakte plasmon resonantie (LSPR) nanobiosensor die deze tekortkomingen overwint. Gladde lipopolysacchariden (LPS) van Brucella melitensis en Brucella abortus werden covalent geïmmobiliseerd op 10-nm goudnanodeeltjes. Binding van patiënt anti-Brucella antilichamen produceerde een meetbare rode verschuiving in de LSPR piek, wat kwantitatieve discriminatie tussen geïnfecteerde en niet-geïnfecteerde sera mogelijk maakte. In een geblindeerde studie van 40 klinische monsters (20 cultuur-positief, 20 cultuur-negatief) bereikte de sensor 85 % gevoeligheid, 100 % specificiteit, 100 % positieve voorspellende waarde en 86 % negatieve voorspellende waarde – vergelijkbaar met of beter dan standaard serologische assays. Het assay vereist slechts 30 min, gebruikt goedkope reagentia en is geschikt voor point-of-care implementatie.

Inleiding

Brucella soorten zijn langzaam groeiende, Gram-negatieve coccobacillen die een breed scala aan domestieke en wilde dieren infecteren. Onder de 12 erkende soorten zijn B. melitensis, B. abortus, B. suis en B. canis de belangrijkste humane pathogenen, met B. melitensis als meest virulente. Humane brucellose presenteert met aspecifieke griepachtige symptomen, wat laboratoriumbevestiging essentieel maakt. Traditionele cultuur, hoewel de goudstandaard, vereist 5–7 dagen en draagt biosafety risico's. Serologische assays lijden onder kruisreactiviteit en kunnen actieve van eerdere infecties niet onderscheiden. Nucleïnezuur-amplificatie biedt snelheid maar kan lang na genezing positief blijven. Dus is een snelle, accurate en betaalbare diagnostische tool dringend nodig.

Gelokaliseerde oppervlakte plasmon resonantie (LSPR) benut de collectieve oscillatie van geleidingselektronen in metaal nanodeeltjes, genererend een scherpe absorptiepiek die verschuift bij biomoleculaire binding. Goudnanodeeltjes (AuNPs) van ~10 nm bieden hoge oppervlakte-tot-volume verhouding en stabiele optische eigenschappen, wat ze ideale LSPR transducers maakt. Door LPS antigenen te koppelen aan AuNPs, kan de LSPR sensor anti-Brucella antilichamen detecteren met hoge gevoeligheid en specificiteit in een eenvoudige colorimetrische readout.

Methoden

Bacteriële cultuur en LPS extractie

Gladde stammen van Brucella melitensis en Brucella abortus werden gekweekt op Luria-Bertani agar. LPS werd geëxtraheerd via een hete-fenol methode, gezuiverd door zilver-gekleurde SDS-PAGE, en gekwantificeerd met 1,9-dimethylmethyleneblauw tegen een Salmonella typhimurium standaard. Eiwitcontaminatie werd uitgesloten door de Bradford assay en nucleïnezuurgehalte was <0,2 % van LPS massa.

Goudnanodeeltjes synthese

AuNPs werden geproduceerd door de Turkevich reductie van HAuCl₄ met natriumcitraat, gevolgd door natriumborohydride toevoeging bij kamertemperatuur. Het resulterende colloïd vertoonde een 530 nm plasmon piek en een gemiddelde diameter van 10 nm, bevestigd door SEM en dynamische lichtverstrooiing (DLS). Zeta-potentiaal van -28 mV wees op goede colloïdale stabiliteit.

Nanoprobe bereiding

AuNPs werden gefunctionaliseerd met thioglycolzuur (TGA) voor carboxyl oppervlaktegroepen. Optimale TGA incubatie was 24 u, waarna 300 µg/ml LPS covalent gekoppeld werd via EDC/NHS chemie. De finale probe behield een sterke 530 nm absorptiepiek.

Antilichaam detectie

Serummonsters werden 1:50 vervaagd in PBS en 1:2 gemengd (100 µl serum + 200 µl probe). Na 30 min incubatie werd het mengsel gecentrifugeerd en de supernatans absorptie gemeten. Rode verschuivingen van ≥4,38 nm, gedefinieerd als de afsnijwaarde (gemiddelde + 2 SD van negatieve controles), werden als positief beschouwd.

Ethiek

Alle sera werden verzameld met geïnformeerde toestemming en IRB goedkeuring (IR.FUMS.1396.324). Deelnemersidentiteiten werden gecodeerd.

Validatie

Veertig sera (20 cultuur-positief, 20 cultuur-negatief) werden getest. Resultaten vergeleken met cultuur, standaard buis agglutinatie test (SAT) en commerciële ELISA kits voor IgM/IgG. Gevoeligheid, specificiteit, PPV en NPV berekend per standaard formules.

Statistische analyse

Data normaliteit beoordeeld met Kolmogorov-Smirnov; ANOVA vergelijk groepen. Analyses uitgevoerd met GraphPad Prism 8 en SPSS 9.

Resultaten

LPS extractie

SDS-PAGE bevestigde een ~1 % opbrengst (nat gewicht) met verwaarloosbare eiwit- en nucleïnezuurcontaminatie.

AuNP karakterisatie

SEM afbeeldingen toonden uniforme 10 nm spheren. DLS gaf nauwe grootteverdeling (10 ± 2 nm). Zeta-potentiaal was -28 mV. UV-Vis piek bij 530 nm bevestigde succesvolle synthese.

Probe optimalisatie

24 u TGA coating produceerde maximale functionalisatie zonder spectrale verschuiving. LPS lading plateauwde bij 300 µg/ml, waarna geen verdere absorptieverandering optrad.

Concept bewijs

Incubatie met positieve anti-Brucella controle antilichamen produceerde een duidelijke rode verschuiving, terwijl negatieve controles dit niet deden.

Afkapwaarde bepaling

Gemiddelde rode verschuiving in negatieven was 1,70 nm; positieven gemiddeld 6,08 nm. Een 4,38 nm afsnijwaarde leverde 5 % false positief en 0 % false negatief in de validatieset.

Diagnostische prestaties

Vergeleken met cultuur toonde de LSPR assay 85 % gevoeligheid, 100 % specificiteit, 100 % PPV en 86 % NPV. SAT bereikte 90 % gevoeligheid, 100 % specificiteit; ELISA IgM/IgG had lagere PPV (90 % en 81 % respectievelijk).

Discussie

Brucellose veroorzaakt ~500.000 nieuwe humane gevallen per jaar. De LSPR nanobiosensor biedt een snelle (≤30 min), goedkope (<$1 per test) en hoog specifieke alternatief voor conventionele methoden. Door anti-LPS antilichamen te detecteren via een meetbare spectrale verschuiving, omzeilt het assay de tijdrovende cultuur en de kruisreactiviteitsproblemen van serologie. Hoewel het kwalitatieve in plaats van kwantitatieve antilichaamniveaus geeft, maken de hoge PPV en NPV het geschikt voor zowel screening als bevestiging in endemische regio's.

Beperkingen omvatten de persistentie van antilichamen na genezing, wat positieve resultaten kan geven bij herstelde patiënten, en de noodzaak voor een spectrophotometer voor nauwkeurige verschuivingmeting. Toekomstig werk zal draagbare, handgeheelde readers verkennen om echte point-of-care implementatie mogelijk te maken.

Conclusie

De 10-nm goudnanodeeltje LSPR biosensor demonstreert snelle, accurate en kosteneffectieve detectie van anti-Brucella antilichamen. De hoge specificiteit en vergelijkbare gevoeligheid met standaard serologie, gekoppeld aan minimale apparatuurvereisten, maken het een aantrekkelijk hulpmiddel voor het diagnosticeren van brucellose, vooral in resource-beperkte settings.