Titaniumoxide Sensor Maakt Vroegtijdige Nanodetectie van Hoofd-Halskanker Mogelijk

Samenvatting

Hoofd-halskanker is een heterogene ziekte, ontstaan in de plaveiselcellen die de larynx (stemkast), mond, farinks (keelholte), neuskholte en speekselklieren bekleden. Laatstadiadiagnose van hoofd-halskanker beïnvloedt de overlevingskans van de patiënt sterk. Dit maakt het verplicht om deze kanker in een vroeg stadium te identificeren met een geschikte biomarker. Plaveiselcel carcinoom antigeen (SCC-Ag) is een circulerend serum tumor biomarker, en een verhoogd niveau is gevonden bij hoofd-halskankerpatiënten en sterk gecorreleerd met de tumorvolume. Het huidige onderzoek werd uitgevoerd om het niveau van SCC-Ag te detecteren en te kwantificeren op een titaniumoxide (TiO₂)-gemodificeerde interdigiteerde elektrode sensor (IDE) door SCC-Ag antilichaam. De detectie van SCC-Ag werd gevonden op het niveau van 100 fM, terwijl het verbeterde tot 10 fM wanneer het antilichaam geconjugeerd was met goudnanoster, wat een 10-voudige verbetering vertegenwoordigt. Interessant is dat deze verbetering in gevoeligheid 1000-voudig hoger is dan andere substraat. Bovendien werd de specificiteitsanalyse uitgevoerd met behulp van twee verschillende controle-eiwitten en gemerkt dat het antilichaam alleen SCC-Ag herkende, wat de specifieke detectie op de IDE-TiO₂ sensorische oppervlakte aangeeft.

Inleiding

Hoofd-halskanker toont abnormale celgroei in het gebied van het hoofd en de hals en wordt breed gerapporteerd. Het ontstaat uit de keel, mond, mucosa, epitheel van de mondholte, speekselklieren en neuskholte [1]; is de zesde meest voorkomende kanker wereldwijd; en treft meer dan 644.000 mensen elk jaar [2]. De meeste geaffecteerde patiënten worden gediagnosticeerd in geavanceerde stadia en beïnvloedt hun overleving sterk. Vroegtijdige identificatie van hoofd-halskanker is verplicht om de overleving en levensstijl te verbeteren. Serologische tumormarkers zijn gebruikt om hoofd-halskanker te diagnosticeren en de opvolging behandeling te managen. De plaveiselcel vrijwaart een predominant plaveiselcel carcinoom antigeen (SCC-Ag), zijn aanwezigheid verhoogd bij kankerpatiënten en SCC-Ag heeft zich bewezen een veelbelovende tumormarker te zijn met plaveiselcel-gerelateerde kankers zoals gynaecologische, long-, slokdarm- en anale kankers [3, 4]. Overwegende hoofd-halskanker, hogere niveaus van SCC-Ag zijn geassocieerd met ziekte metastasering, recidief en sterfte zoals bevestigd in verschillende studies met kankerpatiënten [5,6,7]. Onderzoekers vonden dat serum SCC-Ag op een significant risiconiveau was voor kankers in de hypopharynx, mondholte en larynx [8, 9]. Daarnaast was er een correlatie tussen SCC-Ag niveau en de tumorvolume bij hoofd-halskankerpatiënten [10]. Het is verstandig om het niveau van SCC-Ag te kwantificeren om de toestand van hoofd-halskanker te identificeren, om zo vroegtijdige behandeling te bieden. Het huidige onderzoek was gericht op het detecteren van SCC-Ag op zijn lagere niveau met behulp van nanopartikelen op interdigiteerde elektrode (IDE) sensor door SCC-Ag antilichaam.

IDE is een electrochemische biosensor met veelbelovende kenmerken zoals lage kosten, draagbaar en gevoelig, wat een breed scala aan toepassingen mogelijk maakt, in het bijzonder met milieucontrole en medische diagnostiek [11, 12]. Het verbeteren van de elektrische eigenschap op de sensorische oppervlakte verbetert de detectie van biomoleculen. Nanomateriaaltoepassing is breed gebruikt in de biosensor om de biomoleculaire detectie op sensorische oppervlakken te verbeteren. Nanomaterialen zijn kleiner in grootte, hebben groter oppervlakte, hebben goede thermische en elektrische geleiding, zijn compatibel met biomoleculen, en tonen een enorme capaciteit om toegepast te worden op het gebied van biosensor [13, 14]. Nanomateriaal is op twee verschillende manieren toegepast voor doeleinden: een is oppervlaktefunctionalizatie en de andere is conjugeren van het analiet of doelwit om de detectie te verbeteren [15]. Goud is een van de wel vastgestelde nanomaterialen en wordt toegepast in verschillende sensoren, die oppervlakteplasmonresonantie, golfgeleidingssensor, electrochemische sensor en colorimetrie omvatten [16,17,18]. Naast dat, werden zilver, grafeen, koper en titanium nanomaterialen ook toegepast in verschillende biomedische toepassingen. Als een milieuvriendelijk halfgeleider en lage kosten, heeft titaniumoxide (TiO₂) een brede bandkloof die hier gebruikt wordt voor de oppervlaktemodificatie op IDE om SCC-Ag te detecteren. Vanwege de hoge elektrische en optische eigenschappen van TiO₂, wordt het breed gebruikt voor supercapaciteit, fotokatalytische en fotoelektrische conversies [19,20,21,22,23]. Bovendien is zijn natuur van hydrofiliciteit en groter oppervlakte geschikt voor de oppervlaktemodificatie en helpt bij het detecteren van biomoleculen op een lager niveau. In dit onderzoek werd TiO₂ gecoat op de IDE sensorische oppervlakte om de elektrische stroom te verbeteren wanneer de interactie van biomoleculen plaatsvindt. Om de detectie van SCC-Ag te verbeteren, werd een antilichaam geconjugeerd met goudnanoster (GNS antilichaam) en geïmmobiliseerd op TiO₂-gecoate oppervlakte. Aangezien het is bewezen dat goudnanomateriaal-geconjugeerde biomoleculen een hogere stabiliteit vertonen en de goed georiënteerde oppervlakte-geïmmobiliseerde biomoleculen bieden, heeft het de capaciteit om de detectielimiet te verbeteren [24, 25]. Daarnaast kunnen meer biomoleculen geïmmobiliseerd worden op een enkele gouddeeltje, wat leidt tot het aantrekken van verhoogde niveaus van het doelwitmolecuul. In dit werk werden twee verschillende nanomaterialen, namelijk TiO₂ (voor oppervlaktemodificatie) en GNS (voor antilichaamconjugatie), gebruikt om de detectie van SCC-Ag op de IDE sensorische oppervlakte te verbeteren. De toepassing van GNS wordt verwacht de prestaties te verbeteren met de huidige sensor door zijn groter oppervlakte om een hoger aantal antilichamen vast te leggen.

Materialen en Methodes

Reagentia en Biomoleculen

SCC-antigeen (een glycopeptide met isoformen variërend van 45 tot 55 kDa) werd gekocht van Randox Life Sciences (Maleisië). Anti-SCC antilichaam werd verworven van Next Gene (Maleisië). (3-Aminopropyl)triethoxysilaan (APTES), ethanolamine, albumine (een hoofd bloedeiwit bij 45 mg/mL; 50–70% van bloedeiwit met een molecuulgewicht van 66,5 kDa), fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS; pH 7,4) en titanium(IV)isopropoxide waren van Sigma Aldrich (VS). Serpine (een veelvoorkomende seriene proteaseremmer met een molecuulgewicht van 40 tot 50 kDa) was van Sino Biological (China). Goudnanoster werd gesynthetiseerd zoals beschreven door Shan et al. [26]. Alle verkregen reagentia en chemicaliën werden opgeslagen volgens de aanbevelingen van de fabrikant.

Fabricage van Interdigiteerde Elektroden

Het basisonwerp en de fabricage van IDE werden gevolgd zoals eerder gerapporteerd [27]. Initieel werd het siliciumwafer gereinigd door de standaard reinigingsoplossingen, en aluminium IDE elektrode werd gedeponeerd door de traditionele natte etsmethode op het siliciumwafer. Vervolgens werd de positieve fotoresist gedeponeerd op het oppervlak van het siliciumwafer, gevolgd door thermische oxidatie. Depositie van aluminium werd uitgevoerd door de fotolithografietechniek. Drie stappen waren betrokken, waarin stap 1 was met 1200 toer/min voor 10 s, stap 2 was met 3500 toer/min voor 20 s, gevolgd door 500 toer/min voor 10 s. En dan werd ultraviolette (UV) licht blootgesteld aan de sensorische oppervlakte om het patroon van IDE op het monsteroppervlak over te dragen. Daarna werd RD-6 developer gebruikt voor 15 s om het ontwikkelingsproces uit te voeren. Fotoweerstand werd gedaan om de onbeloichte regio's te elimineren. Het ontwikkelde monster werd gebakken bij 100 °C om de onnodige vochtigheid te wissen en de hechting tussen de SiO₂ laag en het aluminium te verbeteren. Ten slotte, door het gebruik van 23 s aluminium etsmiddel, werd de onbeloichte regio verwijderd en gereinigd door aceton. Het uiteindelijke oppervlak werd gemodificeerd door TiO₂ om SCC-Ag te detecteren. Het gefabriceerde IDE oppervlak werd waargenomen onder hoogvermogen microscopie en 3D nanoprofiler. De afbeeldingen werden vastgelegd met het geassocieerde systeem bij × 50 vergroting.

Coating van TiO₂ op IDE Sensorische Oppervlakte

Op het gefabriceerde IDE oppervlak werd TiO₂ oplossing gecoat en titanium(IV)isopropoxide werd gebruikt als precursor om de oplossing van TiO₂ te bereiden. Hiervoor werd ethanol gemengd met titanium(IV)isopropoxide en vigoros geroerd voor 5 min. En dan werd de stabilisator (100 μL azijnzuur) onder roerconditie toegevoegd en vervolgens verhit op een warmteplaat bij een temperatuur van 85 °C. De molaire verhouding mengsel was vastgezet als 9:1:0,1 (ethanol tot TIP tot azijnzuur). Na 3 uur mengen werd een heldere oplossing verkregen. Na 24 uur verouderingsproces werd de oplossing gedropt op siliciumdioxide (SiO₂) substraten door gebruik te maken van de spindoeker met een snelheid van 2000 toer/min. Na coating werd het oppervlak gedroogd voor 15 min bij een temperatuur van 175 °C en gegloveerd voor 1 uur bij 450 °C. De TiO₂ dunne film krijgt een voldoende dikte na coating van drie lagen.

Bereiding van GNS-Geconjugeerd Anti-SCC-Ag

SCC-Ag antilichaam werd geïmmobiliseerd op GNS door gebruik te maken van de linker 16-mercaptoundecaanzuur (16-MDA). Initieel werd 5 mM vervaagd 16-MDA gemengd met 100 μL GNS en bij kamertemperatuur (RT) bewaard voor 30 min. De gebonden 16-MDA met GNS werd verwijderd door centrifugatie bij 13.000×g, 5 min. Vervolgens werd het verzamelde goudpellet geactiveerd door EDC (400 mM) en NHS (50 mM) met de verhouding 1:1 door 15 min te incuberen bij kamertemperatuur. De ongebonden EDC en NHS uit de oplossingsmengsel werden geëlimineerd door centrifugatie bij 13.000×g, 5 min. Het pellet met de geactiveerde GNS werd verzameld om het antilichaam te conjugeren. Vervolgens werd 200 nM SCC-Ag antilichaam gemengd met EDC-NHS-geactiveerde GNS en bij RT bewaard voor 1 uur. Ten slotte werden de ongebonden antilichamen verwijderd door centrifugatie bij 13.000×g, 5 min. Het geconjugeerde antilichaam met GNS werd bewaard bij 4 °C voor verder gebruik, en de conjugatie werd bevestigd door UV-Vis spectroscopie scanning. Scanning werd uitgevoerd in het gebied tussen 480 en 560 nm, en de piekmaximumwaarden werden gevonden.

Immobilisatie van GNS Antilichaam op TiO₂-IDE Oppervlakte

De TiO₂-gecoate IDE oppervlakte werd verder gemodificeerd in amine door APTES om GNS antilichaam te immobiliseren. APTES met 3% (vervaagd in 30% ethanol) werd gedropt op TiO₂ oppervlakte en bewaard voor 3 uur bij RT. Het oppervlak werd gewassen met 30% ethanol drie keer om ongebonden APTES te verwijderen. Om het antilichaam te immobiliseren, werd de activatiestap gevolgd zoals hierboven vermeld. Het antilichaam of GNS antilichaam werd gedropt op de oppervlakken en gewacht voor 1 uur om het immobilisatieproces te voltooien. Ten slotte werd het oppervlak vijf keer gewassen door PBS-buffer om de ongebonden antilichamen volledig te elimineren. Deze antilichaam of GNS antilichaam-gemodificeerde oppervlakken werden gebruikt om SCC-Ag te detecteren en vergeleken. De GNS antilichaam-geïmmobiliseerde TiO₂ oppervlakte werd geanalyseerd door atoomkrachtmicroscopie (AFM), veldemissie transmissie elektronenmicroscopie (FETEM) en energiedispersieve Röntgen (EDX) analyseerder zoals eerder beschreven [15]. AFM waarnemingen waren op 5 μm schaal, terwijl SEM op 100 nm schaal opereerde met 15 kV. De aanwezigheid van de elementen werd gevonden door EDX.

Detectie van SCC Antigeen op Antilichaam/Goud Nanoster Antilichaam Oppervlakken

Om SCC-Ag te detecteren, werden antilichaam of goudnanoster antilichaam-gemodificeerde TiO₂-IDE oppervlakken geblokkeerd door 1 M ethanolamine om de antilichaam-vrije oppervlaktegebieden te maskeren en bewaard voor 30 min bij RT. Op de ethanolamine-geblokkeerde oppervlakte, interageerde 1 nM SCC-Ag en de stroomresponsen werden opgemerkt voor en na de toevoeging van SCC-Ag. Om de detectielimiet te evalueren, werd SCC-Ag getitreerd van 10 fM tot 1 nM en afzonderlijk gedropt op de antilichaam of GNS antilichaam-gemodificeerde oppervlakken en responsen met de stroom werden genoteerd. Experimenten werden in drievoud uitgevoerd en de statistiek berekend. Een lineaire sweep spanning van 0 tot 2 V bij 0,01 V stapspanning werd gevolgd voor de metingen. De detectielimiet (LOD) werd beschouwd als de laagste concentratie van een analiet (van de kalibratielijn bij lage concentraties) tegen de achtergrondsignaal (S/N = 3:1), met andere woorden, LOD = standaarddeviatie van de baseline + 3σ.

Selectieve Detectie van SCC-Ag

Om de selectieve interactie van SCC-Ag met zijn antilichaam te controleren, werden controle-experimenten uitgevoerd met twee verschillende eiwitten, namelijk serpine en albumine. Een 1-nM concentratie van deze controle-eiwitten werd gedropt op antilichaam of GNS antilichaam-gemodificeerde oppervlakken, en de veranderingen in de stroom werden opgemerkt voor en na de interactie. Deze stroomniveaus werden vergeleken met de specifieke detectie van SCC-Ag door zijn antilichaam en GNS antilichaam. Andere controle-experimentele opstellingen omvatten de interactie van SCC-Ag met alleen GNS en SCC-Ag met TiO₂-IDE oppervlakte gecoat met niet-immuun antilichaam-gelabelde GNS. Experimenten werden in drievoud uitgevoerd en de statistiek berekend. Een lineaire sweep spanning van 0 tot 2 V bij 0,01 V stapspanning werd gevolgd voor de metingen.

Resultaten en Discussie

Hoofd-halskanker is beschreven als verschillende tumoren die zich ontwikkelen in of rond de neus, mond, larynx en sinussen [28]. Vroege diagnose en behandeling met een geschikte biomarker zijn verplicht om de overlevingskans van patiënten te verbeteren. SCC-Ag werd gevonden als een geschikte serum biomarker voor hoofd-halskanker; hierin werden experimenten uitgevoerd om het niveau van SCC-Ag te detecteren en te kwantificeren op titaniumoxide-gemodificeerde interdigiteerde elektrode (IDE) sensor door zijn antilichaam. TiO₂ wordt hier gebruikt om de stroomrespons te verbeteren tijdens de interactie van biomoleculen. Vergeleken met andere nanomaterialen, wordt TiO₂ beschouwd als aantrekkelijk in de electrochemische sensor vanwege zijn actieve gedrag op het oppervlak langs elektroden en verbetering van de elektrokatalytische activiteit. Bovendien geeft het meer stabiliteit aan het oppervlak, wat de herhaalbaarheid van de respons door de elektrode oplevert en verbetering in de detectielimiet door de piekstroom te verhogen [29,30,31]. Om deze positieve eigenschap te benutten, verbetert in dit onderzoek gecoate TiO₂ op de IDE oppervlakte (IDE-TiO₂) de stroomstroom. Een ander nanomateriaal GNS werd gebruikt om anti-SCC-Ag antilichaam te immobiliseren op de IDE-TiO₂ oppervlakte en om de detectielimiet te verbeteren. Aangezien het is bewezen dat goud-geconjugeerd biomolecuul-geïmmobiliseerd oppervlak de detectie van het doelwit verbetert [32, 33], werd hier SCC-Ag gedetecteerd en vergeleken met antilichaam en GNS antilichaam gemodificeerde IDE-TiO₂ oppervlakken. Zoals overal gegeneraliseerd, met een toename in het oppervlaktegebied van het nanopartikel, zal er een verbetering zijn in de biomoleculaire hechting. In deze context heeft GNS een groter oppervlak vergeleken met het spherische goudnanopartikel. Om deze idee te implementeren, is het huidige experiment uitgevoerd met GNS om de gevoeligheid te verbeteren.

Oppervlakte Karakterisering en GNS Antilichaam Immobilisatie

Figuur 1 toont de schematische voorstelling van het detecteren van SCC-Ag op IDE-TiO₂ sensorische oppervlakte. Zoals weergegeven in Fig. 1a, werd initieel de IDE sensorische oppervlakte gecoat met TiO₂ en daarna antilichaam geïmmobiliseerd met of zonder GNS conjugatie. Deze antilichaam-gemodificeerde oppervlakken werden gebruikt om het niveau van SCC-Ag te detecteren. Voordat de detectie werd uitgevoerd, werd de conjugatie van GNS met antilichaam bevestigd door UV-Vis spectroscopie. De GNS scanningsprofielen met de gewenste golfengtebereik voor en na conjugatie met antilichaam werden bepaald. Het was duidelijk te zien dat na immobilisatie, de verschuiving verplaatste van 535 naar 545 nm (Fig. 1b). Dit resultaat bevestigt de conjugatie van antilichamen op het oppervlak van de GNS. Aan de andere kant werd het gefabriceerde sensorische oppervlak morfologisch waargenomen. Figuur 2a toont de hoogvermogen microscopie-afbeelding, terwijl Fig. 2b de afbeelding beschrijft vastgelegd van 3D nanoprofiler imaging. Beide imaging profielen zijn duidelijk getoond met gat en elektrode regio's, die de vingers vormen. De rangschikking van de gaten en vingers leek uniform en intact.

Vergelijking op Antilichaam en GNS Antilichaam Immobilisatie TiO₂-IDE Sensorische Oppervlakken

SCC-Ag werd gedetecteerd op TiO₂-IDE oppervlakte door antilichaam- of GNS antilichaam-geïmmobiliseerde oppervlakken. De hechting van GNS op TiO₂ oppervlakte werd bevestigd door AFM, SEM waarnemingen en EDX analyse (Fig. 2c). Onder AFM waarneming is een duidelijke discriminatie opgemerkt tussen TiO₂ en GNS door donkere en heldere vlekken, respectievelijk. Dit werd ondersteund door SEM en EDX analyses, waarin prominente goud- en matige titaniumpieken werden waargenomen. Deze resultaten bewijzen de aanwezigheid van GNS op de TiO₂ oppervlakte. Figuur 3 toont de immobilisatieprocessen van antilichaam en GNS antilichaam op de amine-gemodificeerde IDE-TiO₂ sensorische oppervlakken. TiO₂-gemodificeerde IDE sensorische oppervlakte toont het stroomniveau als 4,65E−12 (Fig. 3a). Na toevoeging van APTES, steeg het stroomniveau tot 5,37E−11; deze toename in stroom geeft aan dat het oppervlak was gemodificeerd in amine door APTES. Wanneer het antilichaam geïmmobiliseerd werd, veranderde het stroomniveau van 5,375E−11 tot 1,05E−9. Het verschil in de stroom werd opgemerkt als 1,04E−9 (Fig. 3a). Deze immobilisatie gebeurde door de chemische interactie van de aminegroep van de APTES en COOH groep in het antilichaam [18]. De veranderingen in de stroom bevestigden de binding van het antilichaam op de APTES gemodificeerde oppervlakte. Daarna werd het overgebleven oppervlak bedekt door 1 M ethanolamine om het biovervuilings-effect van de niet-specifieke binding van biomoleculen op de sensorische oppervlakte te reduceren. Op dezelfde manier werd GNS antilichaam geïmmobiliseerd op TiO₂-IDE oppervlakte, en wanneer GNS antilichaam geïmmobiliseerd werd op de APTES-gemodificeerde oppervlakte, steeg het stroomniveau van 4,41E−12 tot 1,23E−9 (Fig. 3b). Het was duidelijk gevonden dat wanneer het antilichaam geïmmobiliseerd werd op de GNS oppervlakte, het een hogere respons toonde op de amine-gemodificeerde oppervlakte. Dit kan zijn door het grotere aantal antilichamen dat bindt op het oppervlak van een enkele GNS en de sterke binding van dit complex op de amine-gemodificeerde oppervlakte. Deze binding gebeurde door de aminoterminale groep in de APTES de citraatgroepen op GNS te verdringen en chemisch te fixeren op de APTES-gemodificeerde IDE oppervlakte [34]. Het is bekend dat de detectie van biomoleculen op de sensorische oppervlakken voornamelijk afhangt van twee factoren, namelijk bindingsaffiniteit van interactieve moleculen en de juiste oppervlakteimmobilisatie van moleculen op de sensorische oppervlakte. Hogere biomoleculaire immobilisatie op de sensorische oppervlakte verbetert de detectie van een doelwit op zijn lagere niveau drastisch. In dit onderzoek werd GNS gebruikt om anti-SCC-Ag antilichaam te immobiliseren op IDE-TiO₂ oppervlakte om de kans op hogere antilichaambinding te vergroten, wat leidt tot efficiënte SCC-Ag detectie.

Vergelijkende Detectie van SCC-Ag op IDE-TiO₂ Oppervlakte door Antilichaam of GNS Antilichaam

Aangezien antilichaam GNS de efficiënte immobilisatie op IDE-TiO₂ oppervlakte toont, werd de gelijke 1 nM concentratie van SCC-Ag gedetecteerd op zowel antilichaam en GNS antilichaam oppervlakken en de veranderingen in het stroomniveau vergeleken. Figuur 4a toont 1 nM SCC-Ag detectie op een antilichaam-gemodificeerde oppervlakte. Voordat de detectie werd uitgevoerd, werd de antilichaam-gemodificeerde oppervlakte bedekt door het blokkeermiddel ethanolamine om niet-specifieke binding van biomoleculen te vermijden. Ethanolamine toont de stroomverandering als 4,65E−12. Na toevoeging van 1 nM SCC-Ag, steeg het stroomniveau tot 1,33E−09. Deze stroomveranderingen gaven duidelijk de binding van SCC-Ag aan zijn antilichaam aan. In het geval van GNS antilichaam oppervlakte, toont ethanolamine het stroomniveau als 1,33E−11; na toevoeging van 1 nM SCC-Ag, steeg het tot 1,62E−09 (Fig. 4b). De stroomveranderingen met GNS antilichaam waren hoger vergeleken met alleen antilichaam-gemodificeerde oppervlakte voor een gelijke concentratie van SCC-Ag. Dit kan zijn door het hogere aantal antilichamen gebonden in IDE-TiO₂ oppervlakte door GNS.

Detectielimiet van SCC-Ag op IDE-TiO₂ Oppervlakte door Antilichaam of GNS Antilichaam

Antilichaam- of GNS antilichaam-gemodificeerde oppervlakken tonen een duidelijke detectie van SCC-Ag, en de detectielimiet werd geschat op beide oppervlakken voor vergelijking (Figuur 5a, b). Hiervoor werden de concentraties van 10 fM tot 1 nM SCC-Ag vervaagd en afzonderlijk gedropt op deze oppervlakken en de veranderingen in de stroom genoteerd. Figuur 5a toont de verschillende concentraties van SCC-Ag binding op de antilichaam-gemodificeerde oppervlakte. Na ethanolamine, interageerde 10 fM SCC-Ag, en er werd geen stroomverandering opgemerkt. Toen de concentratie werd verhoogd tot 100 fM, was er een kleine verandering in de stroom van 4,65E−12 tot 6,54E−11. Vervolgens werden de concentraties verhoogd tot 1 pM, 10 pM, 100 pM en 1 nM, en de stroomniveaus steeg respectievelijk tot 4,69E−10, 7,91E−10, 8,78E−10 en 1,33E−09. Deze resultaten geven duidelijk aan dat met een toename in de concentraties, de binding ook toeneemt. De detectielimiet werd berekend op basis van 3σ, en was 100 fM (Fig. 6a).

Deze concentraties van SCC-Ag interageerden onafhankelijk op GNS antilichaam-gemodificeerde oppervlakken. Toen 10 fM SCC-Ag werd gedropt op het oppervlak, veranderde het duidelijk de stroom van 1,33E−11 tot 3,74E−11. Dit resultaat toont aan dat zelfs 10 fM SCC-Ag duidelijk kan interageren met GNS antilichaam-geïmmobiliseerde oppervlakte, wat niet gedetecteerd kan worden in het geval met alleen antilichaam. Bovendien, toen de concentraties werden verhoogd tot 100 fM, 1 pM, 10 pM, 100 pM en 1 nM, steeg de stroomniveaus verder tot 4,69E−10, 9,23E−10, 1,41E−09, 1,48E−09 en 1,62E−09, respectievelijk (Fig. 5b). De statistische berekeningen met de standaarddeviaties zijn in het bereik van ± 0,1 tot 0,15 × 10⁻⁹ A. Wanneer vergeleken met de sensing op de bovenstaande twee oppervlakken, toont GNS antilichaam-gemodificeerde oppervlakte de hogere veranderingen in de stroom met alle concentraties van SCC-Ag getest (Fig. 6b). Op basis van 3σ, kon de detectielimiet gevonden worden als 10 fM (Fig. 6a), dit is 10 keer betere (lagere) detectie vergeleken met alleen de antilichaam-gemodificeerde oppervlakte. De statistische berekening met de standaarddeviaties is in het bereik van ± 0,1 tot 0,15 × 10⁻⁹ A. Eerder is SCC-Ag geëvalueerd op verschillende nanomaterialen, zoals strontiumnanopartikel en grafeen; deze oppervlakken toonden echter ~ 1000-voudig mindere gevoeligheid vergeleken met de huidige studie [35].

Selectieve Detectie van SCC-Ag op Antilichaam/GNS Antilichaam-Gemodificeerde Oppervlakken

Selectieve detectie van SCC-Ag werd vergeleken met twee controle-eiwitten, namelijk serpine en albumine die rijkelijk in de bloedstroom aanwezig zijn. Serpine is een protease-inhibitor die verschillende menselijke fysiologische functies en biologische processen uitvoert, terwijl albumine 45 mg mL⁻¹ bedraagt en 50–70% bijdraagt in het bloedserum. Zoals getoond in de figuur, werd 1 nM concentratie van deze twee controle-eiwitten en SCC-Ag afzonderlijk gedropt op de oppervlakken antilichaam of GNS antilichaam (Fig. 7a); het was duidelijk te zien dat de stroomveranderingen alleen werden opgemerkt met SCC-Ag in beide gevallen, wat aangeeft dat het antilichaam in staat is om alleen SCC-Ag te herkennen. Er zijn geen significante veranderingen opgemerkt in de stroom met de interactie van controle-eiwitten. Dit experiment bevestigt dat de huidige experimentele opstelling specifiek SCC-Ag kan detecteren/diagnosticeren. Verdere ondersteuning werd verleend door andere controle-experimenten door de interacties van SCC-Ag met alleen GNS en SCC-Ag met TiO₂-IDE oppervlakte gecoat met niet-immuun antilichaam-gelabelde GNS. Er werden geen significante veranderingen in de stroom opgemerkt vergeleken met de specifieke interactie (Fig. 7b).

Conclusie

Hoofd-halskanker is een veelvoorkomende kanker die de gebieden van de mond, keel en speekselklieren treft. Het diagnosticeren van hoofd-halskanker met een geschikte biomarker is verplicht om de nodige behandeling aan de patiënten te geven en hun levensstijl te verbeteren. SCC-Ag is bevonden als een van de belangrijke biomarkers voor kankers; hierin werd SCC-Ag gedetecteerd op de titaniumoxide-gecoate interdigiteerde elektrode sensorische oppervlakte (IDE-TiO₂). Antilichaam voor SCC-Ag werd geïmmobiliseerd op IDE-TiO₂ oppervlakte en detecteerde de SCC-Ag. De detectielimiet werd gevonden als 100 fM, en verdere toename in de detectielimiet werd bereikt door het conjugeren van het antilichaam met goudnanoster (GNS antilichaam). De detectielimiet werd verbeterd met 10-voud (tot 10 fM), dit kan zijn door het grotere aantal antilichaam gebonden op de amine-gemodificeerde TiO₂ oppervlakte door GNS. Bovendien werden controle-experimenten uitgevoerd met twee verschillende eiwitten en niet herkend door de anti-SCC-Ag, wat de selectieve detectie van SCC-Ag aangeeft. De gedemonstreerde IDE-TiO₂ sensorische oppervlakte helpt bij het diagnosticeren van hoofd-halskanker, een strategie kan worden gevolgd voor de vroegtijdige detectie.

Beschikbaarheid van Gegevens en Materialen

Alle gegevens zijn volledig beschikbaar zonder beperking.

Afkortingen

16-MDA:

16-Mercaptoundecaanzuur

APTES:

(3-Aminopropyl)triethoxysilaan

GNS:

Goudnanoster

IDE:

Interdigiteerde elektrode

PBS:

Fosfaatgebufferde zoutoplossing

RT:

Kamertemperatuur

SCC-Ag:

Plaveiselcel carcinoom antigeen

SiO₂ :

Siliciumdioxide

TiO₂ :

Titaniumoxide

UV:

Ultraviolett