Vervaardiging en karakterisering van met taurine gefunctionaliseerd grafeenoxide met 5-fluoruracil als medicijnafgiftesystemen tegen kanker

Abstract

Onlangs zijn nanocarrier-systemen voor kankermedicijnen, met name op GO gebaseerde medicijnafgiftesystemen, een zegen geworden voor kankerpatiënten. In deze studie kiezen we voor Tau om het GO-oppervlak te functionaliseren om de biocompatibiliteit ervan te verbeteren. Ten eerste werd GO op nanoschaal gesynthetiseerd door de gemodificeerde Hummer-methode en ultrasone stripmethode. De met taurine gemodificeerde grafeenoxidedrager (Tau-GO) werd met een chemische methode gesynthetiseerd om Tau-GO te verkrijgen met een goede dispergeerbaarheid en stabiliteit in water, met een zeta-potentiaal van -38,8 mV en een deeltjesgrootte van 242 nm. Op basis van de evaluatiecriteria voor inkapselingsefficiëntie werd de optimale formulering bepaald om Tau-GO en 5-FU te combineren door niet-covalente binding. De 5-FU-Tau-GO was stabieler in een neutrale omgeving dan in een zure omgeving, en met een bepaalde PH-respons en een effect met aanhoudende afgifte. In vivo vergeleken we orale en intraveneuze toedieningen van respectievelijk 5-FU en 5-FU-Tau-GO, met behulp van farmacokinetische tests en gerelateerde parameters en toonden aan dat 5-FU-Tau-GO orale of intraveneuze toediening de actietijd van 5 verlengt. -FU in het lichaam en verbetert de biologische beschikbaarheid. Bovendien toonde de remming van HepG2-cellen die werd gemeten met de MTT-assay, aan dat de IC₅₀ waarde van 5-FU was 196 ± 8,73 μg/ml, en de IC₅₀ de waarde van 5-FU-Tau-GO was 65,2 ± 0,7 g/ml, wat aangeeft dat 5-FU-Tau-GO krachtiger is tegen HepG2-cellen en een sterker remmend effect op kankercellen heeft. Het effect op celmorfologie dat werd gemeten met behulp van de AO/EB-kleuring toonde ook aan dat 5-FU-Tau-GO niet alleen cellen ontwrichtte, maar ook significant apoptose induceerde in vergelijking met 5-FU. We hebben ook door computerondersteund ontwerp geverifieerd dat Tau-GO beter kan binden aan 5-FU dan aan het ongewijzigde GO, en dat het gevormde 5-FU-Tau-GO-systeem stabieler is en bevorderlijk is voor de overdracht en afgifte van 5- FU in vivo.

Inleiding

Chemotherapie is nog steeds een veelgebruikte methode die wordt gebruikt bij de behandeling van verschillende vormen van kanker [1]. Een belangrijk obstakel van de meeste chemotherapeutische middelen is hun onvermogen om tumorweefsels binnen te dringen, in effectieve concentraties, of hun ongewenste bijwerkingen voor normale weefsels [2]. Daarom hebben wetenschappers hun inspanningen geconcentreerd op het ontwikkelen van een krachtig medicijnafgiftesysteem dat de gecontroleerde snelheid van medicijnafgifte in tumorweefsels kan bereiken om effectieve medicijnafgifte en therapie te garanderen.

Veel materialen met nanogrootte, waaronder liposomen [3], polymeren [4], nanodeeltjes [5], dendrimeren [6], micellen [7] en grafeenoxide [8, 9] zijn ontwikkeld voor de afgifte van verschillende medicijnen. Onder deze nanomaterialen is grafeenoxide (GO) een nieuw koolstofnanomateriaal dat chemisch wordt geëxfolieerd van geoxideerd grafiet en verschillende fascinerende fysische en chemische eigenschappen vertoont, zoals overvloedige functionele groepen, groot specifiek oppervlak, hoge hoeveelheid geneesmiddellading en uitstekende verspreiding vermogen in water [10,11,12]. Bovendien toonden de meeste in vitro experimentele resultaten aan dat een lage GO-concentratie kan worden gebruikt als substraat voor celgroei en om immuuncellen te activeren. Daarom is GO op grote schaal gebruikt bij de diagnose van ziekten [13], beeldvorming en tracking van kankercellen [14], fotothermische therapie bij kanker [15], weefselmanipulatie [16], gerichte medicijnafgifte [17], en vooral als een anti- drager van tumorgeneesmiddelen [18, 19]. Verschillende onderzoeksgroepen hebben echter gemeld dat een hoge GO-concentratie duidelijke cytotoxische effecten heeft in preklinische en klinische onderzoeken. Het mechanisme waarmee GO in vivo toxische effecten produceert, is door oxidatieve stress en de overproductie van intracellulaire reactieve zuurstofsoorten, het induceren van celapoptose en het veroorzaken van ernstige ontsteking, longoedeem en granuloomvorming [20]. Daarom is het van cruciaal belang om het probleem van GO-toxiciteit op te lossen.

Naar verluidt kan de functionalisering van covalente of niet-covalente bindingen de sterke hydrofobe interactie tussen GO en cellen verminderen. Dit werd aangetoond door verschillende onderzoeken die aantoonden dat GO-functionalisatie de biocompatibiliteit verbetert en de toxiciteit in vivo en in vitro bijna elimineert. Yang et al. bestudeerde voor het eerst de biologische distributie op lange termijn van covalent geconjugeerd PEG-GO bij muizen met behulp van een radiolabelingmethode, en de resultaten toonden aan dat PEG-GO geleidelijk door muizen kon worden uitgescheiden, waarschijnlijk in urine en ontlasting [21]. Zhang et al. vergeleek DEX-gefunctionaliseerde GO met GO en ontdekte dat GO-DEX de celtoxiciteit opmerkelijk kon verminderen en binnen een week grotendeels van muizen kon worden verwijderd [22]. Bovendien resulteert de niet-covalente GO-binding aan pluronic F127 in goedaardige oplosbaarheid en stabiliteit in fysiologische omstandigheden en een lage toxiciteit [23]. Hoewel verschillende polymeren of moleculen zijn gebruikt om GO te functionaliseren, zijn er op dit gebied significante resultaten bereikt. Er zijn echter nog steeds inspanningen nodig om eenvoudige methoden te ontwikkelen om een goede biocompatibele drager voor op GO gebaseerde geneesmiddelen te construeren.

Taurine (Tau) is een semi-essentieel aminozuur met een goede stabiliteit en oplosbaarheid in water. Tau kan cardiovasculaire en cerebrovasculaire ziekten voorkomen, de visuele functie behouden, cellen beschermen en de immuniteit reguleren. Talrijke studies hebben voorgesteld dat Tau antitumoreigenschappen heeft door zijn op- of neerwaartse regulatie van de expressiefactoren die een belangrijke rol spelen bij verschillende vormen van kanker, waaronder long-, maag-, colorectale en borstkanker [24]. Tau-gefunctionaliseerde GO kan dus een superieure rol spelen als drager van antitumormiddelen. In dit artikel hebben we voor het eerst covalente Tau-gefunctionaliseerde GO als nanodrager gebruikt en de cytotoxiciteit ervan in vitro geëvalueerd. Verder werd 5-fluorouracil (5-FU) gebruikt als een geneesmiddel tegen kanker dat niet-covalent was geladen op het oppervlak van Tau-GO om een medicijnafgiftesysteem te bouwen. De 5-FU-Tau-GO kan niet alleen de bijwerkingen op normale weefsels verminderen, maar ook de biologische beschikbaarheid van geneesmiddelen verbeteren. Bijgevolg werd Tau-GO met succes ontwikkeld als een nieuw op GO gebaseerd nanomateriaal dat in de toekomst belangrijke biomedische toepassingen kan hebben.

Experimenten en methoden

Materialen

Het grafietpoeder, met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) en dimethylsulfoxide (DMSO) werden gekocht bij Tianjin Laibo Chemical Co., Ltd.; Carbodiimide (EDC), N-hydroxysuccinimide (NHS), zoutzuur (HCl) en waterstofperoxide (H₂ O₂ 30%) werden gekocht bij Shandong Yuwang Industrial Co., Ltd.; Taurine (Tau), 5-fluorouracil (5-FU), menselijke hepatoomcellen (HepG2), penicilline-streptomycine-oplossing en foetaal runderserum (FBS) werden gekocht bij Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd.; zwavelzuur (H₂ SO₄ 98%) en kaliumpermanganaat (KMnO₄ ) werden gekocht bij Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd.; natriumnitraat (NaNO₃ ) en natriumdodecylsulfaat (SDS-Na) werden gekocht bij Shanghai Jinjinle Industrial Co., Ltd.; MTT werd gekocht bij Sigma-Aldrich, Inc; DMEM werd gekocht bij HyClone, Inc; De ratten werden gekocht bij het Benxi Changsheng Experimental Animal Center. Alle andere reagentia en chemicaliën waren analytisch zuiver en in de handel verkrijgbaar.

GO-synthese

De GO werd bereid uit grafietpoeder volgens een aangepaste Hummer-methode. Eerst werd 168 ml 98% zwavelzuur toegevoegd langs de kolfwand van een driehalskolf die in een ijsbad met thermometer werd geplaatst, en 5 g grafiet en 4 g natriumnitraat werden toegevoegd toen de temperatuur 5 °C bereikte. Vervolgens werd gedurende 1 uur langzaam 22,5 g kaliumpermanganaat in batches toegevoegd en werd de temperatuur onder de 5 °C gehouden. Daarna werd de driehalskolf overgebracht naar een oliebad en werd het verkregen mengsel gedurende 30 minuten bij 35°C omgezet, vervolgens werd de temperatuur verhoogd tot 65°C en werd het reactiemengsel 30 minuten geroerd. Na deze stap werd de temperatuur verhoogd tot 85°C en het mengsel werd gedurende 1 uur verder gereageerd om een paarsbruine pasta te verkrijgen. Dit mengsel werd 1 week bij kamer gelaten, overgebracht naar een bekerglas met 700 ml heet water, en de 30% waterstofperoxide werd druppelsgewijs toegevoegd totdat het geelachtig bruin werd. Het mengsel werd bij 10.000 rpm gecentrifugeerd, met heet water gewassen en dit proces werd verschillende keren herhaald totdat de pH van het supernatant 7,0 was. Ten slotte werd het product gedroogd in een vacuümvriesdroger en werd de nano GO verkregen.

Tau-GO-synthese

Een nauwkeurig afgewogen 50 mg GO werd opgelost in 50 ml gedestilleerd water en 150 mg EDC en 100 mg NHS werden toegevoegd om de GO te activeren door middel van ultrasone trillingen in een ijswaterbad gedurende 20 minuten. Vervolgens werd 10 ml waterige Tau-oplossing (0,1 g / ml) langzaam (druppelsgewijs) toegevoegd aan de bereide waterige GO-oplossing en de pH werd met HCl op 6-7 ingesteld en 24 uur continu geroerd bij kamer in het donker. Het product werd verzameld door 10 min centrifugeren bij 5000 rpm en driemaal gewassen met gedestilleerd water. De Tau-GO werd verzameld na vriesdrogen.

5-FU wordt geladen

Een hoeveelheid van 20 ml Tau-GO-oplossing werd gedurende 2 uur aan ultrasone trillingen onderworpen. Een nauwkeurig afgewogen hoeveelheid 5-FU werd opgelost in een geschikte hoeveelheid gedestilleerd water en langzaam druppelsgewijs toegevoegd aan de bereide Tau-GO-oplossing onder roeren bij kamertemperatuur, en vervolgens 1,5 uur in het donker bij 30 ° C gesoniceerd. De producten werden 10 minuten bij 4 ° C bij 5000 tpm gecentrifugeerd. Het onderste sediment werd gewassen met 20 ml gedestilleerd water en gecentrifugeerd (5000 rpm gedurende 10 minuten bij 4 ° C), en het proces werd 3 keer herhaald. De onderste laag werd gevriesdroogd, het supernatant werd in een beker gedaan, het volume gewogen, de concentratie van 5-FU werd bepaald met een 1200 HPLC (Agilent, VS). De detectieomstandigheden waren als volgt:chromatografische kolom:C18 (4,6 x 250 nm, 5 μm); kolomtemperatuur:25 °C; mobiele fase:0,1% KH₂ PO₄ oplossing met pH 5,5; stroomsnelheid:1,0 ml/min; injectievolume:20μL; en meetgolflengte:265 nm. De inkapselingsverhouding (EE) en de efficiëntie van het laden van geneesmiddelen (LE) werden verkregen door de volgende formule:

$$\begin{aligned} {\text{EE}}\left( \% \right) &=\frac{{M_{1} - C_{1} \times L_{1} }}{{M_{1 } }} \times 100\% \\ {\text{LE}}\left( \% \right) &=\frac{{{M_{1} - C_{1} \times L_{1} }}{{ 20C_{0} + M_{1} - C_{1} \times L_{1} }} \times 100\% \\ \end{aligned}$$

De totale dosis 5-FU werd geregistreerd als M₁ , werden de vrije 5-FU-concentratie en het volume geregistreerd als C₁ en L₁ , en de dragerconcentratie werd geregistreerd als C₀ .

Karakterisering

Om het geprepareerde nanocomposiet te karakteriseren, werden Fourier-transformatie-infraroodspectra (FT-IR) gescand van 4000 tot 400 cm⁻¹ op de IRAffinity-1 spectrometer (Shimadzu, Japan) om de interacties te bevestigen. UV-vis-absorptiespectra werden opgenomen op een UV-3600 Scanning Spectrophotometer (Shimadzu, Japan). De monsters werden opgelost in gedestilleerd water en de deeltjesgroottes, zeta-potentialen en PDI-waarden werden verkregen op een Nano-ZS 90 Nano-instrument (Malvern, VK). De morfologieën van de monsters werden geanalyseerd met behulp van een JEM-2100 transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) (JEOL, Japan). Thermogravimetrische analyses (TGA) werden uitgevoerd met behulp van een thermo-gravimetrische analysator (NETZSCH, Duitsland) met een verwarmingssnelheid van 10 ° C / min van 0 tot 800 ° C onder een stikstofatmosfeer. XRD-meting van monsters werd uitgevoerd met een röntgendiffractometer (Bruker, Duitsland) met een koperen CuKa-straling (λ = 1.5406 ) in een groothoek met een hoek van 2θ. XPS-metingen werden uitgevoerd met een Omicron ESCA-sonde met een monochromatische Al Karadiation (Thermo, Amerika).

In vitro geneesmiddelafgifte

In vitro geneesmiddelafgifte werd uitgevoerd bij respectievelijk pH 1,2 (gesimuleerde maagomgeving), pH 6,5 (gesimuleerde leverkankercelomgeving) en pH 7,4 (simulatie fysiologische omgeving) bij 37 ° C (gesimuleerde lichaamstemperatuur). In het kort werd 15 mg 5-FU-Tau-GO in een dialysemembraan geplaatst, ondergedompeld in 50 ml bufferoplossingen die 0,1% SDS-Na bevatten met een pH van 1,2, 6,5 en 7,4. Alle monsters werden in een continu schuddend waterbad geplaatst met een snelheid van 100 rpm en een temperatuur van 37 °C. Op vooraf bepaalde tijdstippen (0 min, 5 min, 10 min, 20 min, 30 min, 1 h, 1,5 h, 2 h, 2,5 h, 3 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h, 48 h en 72 uur), werd 1 ml van elk monster genomen en vervangen door 1 ml verse bufferoplossing met 0,1% SDS-Na om hetzelfde volume afgiftemedium te behouden. Het vrijgekomen medium werd gecentrifugeerd en geanalyseerd met 1200 HPLC.

In vitro cytotoxiciteitsonderzoeken

MTT-assay

De MTT-assay werd gebruikt om de cytotoxiciteit van 5-FU, Tau-GO en 5-FU-Tau-GO te evalueren. In het kort, de humane hepatoom HepG2-cellen werden gekweekt in DEME-medium, aangevuld met 10% FBS en 1% antibiotica (penicilline-streptomycine-oplossing) bij 37 ° C in een bevochtigde atmosfeer van 5% CO₂ . De cellen werden uitgezaaid in een plaat met 96 putjes met een dichtheid van 5 × 10³ cellen per putje met 100 μL DEME-medium, aangevuld met FBS en antibiotica. De plaat werd 24 uur in een bevochtigde kamer van 37 °C met 5% CO₂ . geplaatst . Daarna werd het groeimedium verwijderd en opnieuw gevuld met 100 μL vers medium dat verschillende concentraties (5, 10, 20, 40, 60, 80 en 100 μg/ml) 5-FU, Tau-GO, 5-FU- bevatte. Tau-GO, respectievelijk. Na een incubatie van 24 uur werden de cellen behandeld met 20 μL MTT-oplossing en verder gedurende 4 uur geïncubeerd. Vervolgens werd het medium opgezogen en werden de formazankristallen opgelost in 150 μL DMSO. Ten slotte werden de putplaten gedurende 15 minuten bij 37 ° C geschud in een oscillator met constante temperatuur. De optische dichtheid (OD) van elk monster werd gemeten bij 570 nm met behulp van een microplaatlezer. De experimenten werden in drievoud uitgevoerd. De celremmingssnelheid werd berekend uit de resultaten met behulp van de volgende formule:

$${\text{Cell}}\;{\text{inhibition}}\;{\text{rate}} =\frac{{{\text{OD}}_{{{\text{control}}} } - {\text{OD}}_{{{\text{behandeld}}}} }}{{{\text{OD}}_{{{\text{control}}}} }} \times 100\ %$$

waar OD_controle is de absorptie verkregen door onbehandelde controlecellen, OD_behandeld is de absorptie die wordt verkregen door behandelde cellen.

AO/EB-kleuringassay

AO/EB dubbele kleuring werd gebruikt om de morfologische veranderingen te evalueren van de cellen die werden behandeld met 5-FU, Tau-GO en 5-FU-Tau-GO. In het kort, HepG2-cellen in een logaritmische groeifase werden gezaaid in een plaat met 6 putjes met een dichtheid van 10.000 cellen per putje en gekweekt in een incubator bij 37 ° C en onder een 5% CO₂ atmosfeer. Na 24 uur werden de cellen behandeld met een vaste concentratie van 5-FU, Tau-GO of 5-FU-Tau-GO en 24 uur verder geïncubeerd. Het medium in elk putje werd verwijderd en de cellen werden tweemaal gewassen met PBS. Vervolgens werd 1 ml PBS aangevuld met 40 μL fluorescerende kleurstoffen (1 mg / ml AO en 1 mg / ml EB gemengd in een verhouding van 1:1) aan elk putje toegevoegd en 10 minuten zonder licht geïncubeerd. De gekleurde cellen werden bekeken onder een fluorescentiemicroscoop en er werden willekeurig foto's genomen.

Farmacokinetische studie

Alle dierproeven zijn uitgevoerd in overeenstemming met het beleid en de principes die zijn geformuleerd door de commissie voor dierenbescherming en ethiek. Een totaal van 24 mannelijke SD-ratten, met een lichaamsgewicht van 230-270 g, moesten 12 uur vasten en willekeurig verdeeld in 4 groepen voorafgaand aan de toediening van het geneesmiddel. Groepen A en B werden intraveneus geïnjecteerd met 5-FU- en 5-FU-Tau-GO-oplossingen en groepen C en D kregen respectievelijk orale 5-FU- en 5-FU-Tau-GO-oplossingen. Alle groepen kregen een dosis van 20 mg/kg. Na toediening van het geneesmiddel werden bloedmonsters (ongeveer 0,5 ml) verzameld in antistollingsbuizen op bepaalde tijdstippen (15 min, 1 uur, 2 uur, 4 uur, 6 uur, 8 uur, 12 uur, 16 uur, 24 uur en 48 uur). H). De plasmamonsters werden gescheiden door centrifugatie bij 7500 rpm en gedurende 10 minuten bij 4 °C. Daarna 200 μL plasma en 50 mg (NH₄ )₂ SO₄ werden gecombineerd in een buis (10 μL van 40 g/ml 5-BrU interne standaardoplossing, geföhnd met stikstof in een waterbad van 40 °C, 5 min gevortext en 3 min gecentrifugeerd bij 10800 rpm. Vervolgens werd de buis toegevoegd met 900 μL ethylacetaat/isopropanol-oplossing (85:15, v/v), 3 min gevortext en 15 min gecentrifugeerd bij 10800 tpm. Het supernatant werd verwijderd en gedroogd met stikstof, 100 μL mobiele fase werd toegevoegd en de buis werd gedurende 1 min. gevortext. Ten slotte werd de resulterende oplossing verzameld uit het supernatant gemeten met 1200 HPLC.

Moleculaire dynamieksimulatie

Moleculaire dynamische simulatie wordt voornamelijk gebruikt om de interactiekracht tussen het medicijn en de drager en het diffusiegedrag van het medicijn te analyseren. De chemische structuur van de 5-FU werd geconstrueerd met behulp van Chemdraw of chem office 2014, en de structuren van de Tau-GO en GO werden uitgevoerd in de Polymer and Molecule Builders-module met behulp van de moleculaire simulatiesoftware Materials Studio (versie 7.0, Accelrys Inc. , VS). Alle gebouwde verbindingen werden geometrisch geoptimaliseerd onder het COMPASS II-krachtveld en de conformatie met de laagste energie werd geselecteerd als de stabiele conformatie. Voor elk systeem werd een 10 ps, NVT-evenwicht uitgevoerd. De simulatie werd uitgevoerd met 100 ps MD om een gebalanceerde structuur te verkrijgen bij 298 K en 101,325 kPa met een stapgrootte van 1 fs. Ten slotte werden de gemiddelde vierkante verplaatsing (MSD) en de cohesieve energiedichtheid (CED) voor elk systeem verkregen en de diffusiecoëfficiënt (D) werd gegeven door de volgende formule:

$$D =\frac{1}{2d}\mathop {\lim }\limits_{\tau \to \infty } \frac{{\text{d}}}{{{\text{d}}\tau }}\links links. {r\overrightarrow {\left( t \right)} - r\overrightarrow {\left( 0 \right)} } \right]} \right.^{2}$$

waar de d is de dimensie van het systeem, $r\overrightarrow {\left( t \right)}$ en $r\overrightarrow {\left( 0 \right)}$ zijn de positievector van het medicijnmolecuul op tijdstip t en 0, respectievelijk $\links[ {\links. {r\overrechtspijl {\links( t \rechts)} - r\overrechtspijl {\links( 0 \rechts)} } \rechts]} \rechts.^{ 2}$ staat voor MSD.

Resultaten en discussie

Karakterisering

Het Tau-GO-conjugaat werd gefabriceerd door een amidebinding van GO en Tau. De succesvolle synthese van het nanocomposiet werd gevalideerd door FT-IR-spectra (Fig. 1). De aanwezigheid van de zuurstoffunctionaliteiten op GO werd bevestigd door de absorptiepieken bij –OH (~ 3405 cm⁻¹ ), C=O (1723 cm⁻¹ ), C=C (1628 cm⁻¹ ) en C–OH (1391 cm⁻¹ ). Deze resultaten bewezen de succesvolle voorbereiding van GO (Fig. 1a) [25]. Naast enkele karakteristieke GO-pieken, zijn de nieuwe pieken op 1638 cm⁻¹ en 3427 cm⁻¹ kwam overeen met de amidegroep, en de 1164 cm⁻¹ en 1085 cm⁻¹ overeenkwam met -SO. Het Tau-GO-spectrum gaf duidelijk aan dat Tau is gefunctionaliseerd op het GO-oppervlak (figuur 1b). In Fig. 2b, de karakteristieke piek van –SO₃ op 1164 cm⁻¹ werd overspoeld door de werking van waterstofbinding en was niet zichtbaar in de FT-IR-spectra. Daarom werd 5-FU met succes op de Tau-GO geladen.

FT-IR-spectra van GO (a ) en Tau-GO (b )

FT-IR-spectra van Tau-GO (a ) en 5-FU-Tau-GO (b )

De GO UV-Vis-absorptiespectra worden getoond in Fig. 3. De voor de hand liggende absorptiepiek bij 234 nm werd toegeschreven aan de π-π*-overgang van de grafeen C=C-bindingen. Bovendien werd de schouderpiek van 300 nm toegeschreven aan de n-π*-overgang van de grafeenoxide C=O-bindingen op de carboxyl- of de carbonylgroep. De twee karakteristieke absorptiepieken bleken succesvolle preparaten van GO te zijn.

UV-spectra van GO

De grootte van GO, Tau-GO en 5-FU-Tau-GO wordt getoond in Fig. 4. De zeta-potentiaal van GO, Tau-GO en 5-FU-Tau-GO wordt getoond in Fig. 5. De grootte van de GO-bladen waren ongeveer 221 nm en de PDI-waarde was ongeveer 0,188, wat aangeeft dat de voorbereide GO een uniforme verdeling en goede stabiliteit heeft. De zeta-potentiaal was ongeveer 33,3 mV, wat aangeeft dat de negatieve lading voornamelijk te wijten is aan de aanwezigheid van veel zuurstofbevattende groepen op het oppervlak. Toen de GO werd gemodificeerd met Tau via een amidebinding, vervingen de aminogroepen enkele van de carboxylgroepen en de -SO₃ had een sterker ionisatievermogen in oplossing, de zeta-potentiaal nam af en werd − 38,8 mV. De grootte en PDI-waarden van Tau-GO waren ongeveer 242 nm en 0,190. Vervolgens werd 5-FU op Tau-GO geladen door een niet-covalente binding. De zeta-potentiaal was ongeveer -26,7 mV en de absolute waarde was groter dan 20 mV. Bovendien waren de grootte en PDI-waarden van 5-FU-Tau-GO ongeveer 264 nm en 0,182, dit geeft aan dat de elektrostatische afstoting tussen deeltjes groot is, wat niet gemakkelijk is om aggregatie of neerslag te veroorzaken, en dat Tau een goede oplosbaarheid in water heeft GO heeft ook een goede oplosbaarheid in water omdat het oppervlak wordt gemodificeerd door zuurstofbevattende functionele groepen. Het gebruik van Tau-GO-drager om 5-FU te laden, verbetert de oplosbaarheid van 5-FU in water aanzienlijk, zodat 5-FU-Tau-GO stabiel kan worden gedispergeerd in een waterige oplossing.

Deeltjesgrootte van GO (a ), Tau-GO (b ), en 5-FU-Tau-GO (c )

Zeta-potentialen van GO (a ), Tau-GO (b ), en 5-FU-Tau-GO (c )

De morfologieën van GO, Tau-GO en 5-FU-Tau-GO werden gekenmerkt door TEM (figuur 6). De GO is een platte structuur met rimpels op het oppervlak, wat illustreert dat het een vlakke tweedimensionale structuur is (figuur 6a). Vergeleken met GO was de grootte van Tau-GO iets groter, maar vertoonde nog steeds een lamellaire structuur (figuur 6b). Het 5-FU-Tau-GO-beeld toonde aan dat de materialen niet aggregeerden of veranderden terwijl de oorspronkelijke lamellaire structuur van GO intact bleef (figuur 6c). Bijgevolg hadden Tau-GO en 5-FU-Tau-GO een goede stabiliteit.

TEM van GO (a ), Tau-GO (b ) en 5-FU-Tau-GO (c )

Thermogravimetrische analyse werd gebruikt om de samenstelling van de composieten te kwantificeren. De TGA-curven van GO en Tau-GO worden getoond in Fig. 7. GO en Tau-GO hebben restmassa's van 39,73% en 34,22% in een stikstofatmosfeer van 800 °C. Daarom werd bij het vergelijken van de gewichtsveranderingswaarden vastgesteld dat het gehalte aan Tau in Tau-GO ongeveer 13% was.

TAG van GO en Tau-GO

De XRD-patronen van Tau, GO en Tau-GO worden getoond in Fig. 8. De karakteristieke piek van GO kan worden waargenomen bij 10,7 ° van de 2θ-waarde, wat de vorming van GO bevestigt met volledige oxidatie voor een sterk chemisch oxidatie- en exfoliatieproces . Na gefunctionaliseerd met Tau op GO-oppervlak, nam het diffractiepatroon van de piek enigszins af bij 2θ-waarde 8,2. Dit betekent dat GO met succes is gefunctionaliseerd door Tau.

XRD patronen van Tau, Tau-GO en GO

De C1s XPS-spectra van GO en Tau-GO worden getoond in Fig. 9. De C1s XPS-spectra van GO geven aan dat er een aanzienlijke mate van oxidatie is, met de aanwezigheid van vier koolstofatomen die overeenkomen met verschillende functionele groepen. De C1s XPS-spectra van Tau-GO vertonen ook dezelfde koolstofatomen. Bovendien werd het verschijnen van aan C-N-binding gerelateerde componentpieken toegeschreven aan de aminogroepen, amidegroepen. Deze resultaten geven ook aan dat GO met succes is gefunctionaliseerd door Tau.

C1s XPS-patronen van GO en Tau-GO

Drugs laden en vrijgeven

5-FU werd geadsorbeerd op Tau-GO-nanodrager door niet-covalente interacties. De 5-FU-kalibratiecurve was y = 62.135x + 21.873 (r = 0.9999), en het bereik was van 6.5 ~ 250 µg/ml. De inkapselingsverhouding (EE) en de efficiëntie van het laden van geneesmiddelen (LE) werden bepaald door ongebonden geneesmiddelconcentraties om de laadprestaties van het geneesmiddel te evalueren. De resultaten toonden aan dat EE toenam met de toename van de geneesmiddelconcentratie, en dat de hoogste waarde van EE 83,2% was. Volgens de formule was de LE 33,7%, dat wil zeggen 508,52 μg 5-FU kan worden geadsorbeerd op 1 mg Tau-GO. Daarom is Tau-GO een veelbelovende medicijndrager die een grote hoeveelheid medicijnen kan bereiken. De mogelijke mechanismen van de hoge laadcapaciteit van 5-FU op de Tau-GO kunnen worden samengevat door de volgende verklaringen:ten eerste wordt Tau gebruikt om GO te functionaliseren en actieve functionele groepen te introduceren (–SO₃ ). –SO₃ heeft een sterk ioniserend vermogen in de oplossing, wat de agglomeratie tussen GO vermindert en het laden van 5-FU in Tau-GO vergemakkelijkt. Ten tweede is de Zeta-potentiaal van 5-FU-Tau-GO 12,1 mV anders dan die van Tau-GO, wat aangeeft dat 5-FU op het oppervlak van Tau-GO wordt geladen, en de elektrostatische interactie speelt een belangrijke rol in de laden van 5-FU. Ten slotte zijn er vele vormen van waterstofbindingen tussen 5-FU en Tau-GO-drager, waaronder -COOH in Tau-GO en -NH- in 5-FU, -COOH in Tau-GO en-in 5-FU C=O , –OH in Tau-GO en –NH– in 5-FU, –OH in Tau-GO en –C=O in 5-FU, –COOH en 5-FU in Tau-GO –F in Tau-GO, – COOH in Tau-GO en –F in 5-FU, deze waterstofbruggen maken 5-FU-Tau-GO stabiel in oplossing.

De in vitro cumulatieve afgifte van 5-FU uit de 5-FU-Tau-GO, bij een temperatuur van 37 °C in pH 1,2, 6,5 en 7,4 PBS-oplossing (respectievelijk de maagomgeving, de leverkankercelomgeving en de fysiologische omgeving simuleren) wordt getoond in Fig. 10. Het blijkt dat het 5-FU-afgiftegedrag werd beïnvloed door de pH-waarde van de omgeving. In een buffer met een pH van 7,4 was de geneesmiddelafgifte langzaam en continu, en de totale afgegeven hoeveelheid geneesmiddel was na 72 uur ongeveer 70,84%. Daarentegen was de afgegeven hoeveelheid geneesmiddel bij pH 7,4 significant lager dan die bij pH 1,2 en pH 6,5 op hetzelfde tijdstip. De totale geneesmiddelbelading die vrijkwam uit de 5-FU-Tau-GO kon worden bereikt bij respectievelijk ongeveer 90,29% en 85,75% en bij pH 1,2 en pH 6,5. Het kan worden toegeschreven aan de π-π-interacties en waterstofbruggen tussen 5-FU en Tau-GO. Hoe lager de pH-waarde, hoe hoger de protoneringsgraad van de waterstofbrug. Daarom werd de sterkte van de waterstofbinding gecontroleerd door de pH-waarde, wat leidde tot de afgifte van 5-FU. Dit pH-gevoelige medicijnafgiftesysteem speelt een belangrijke rol bij antitumormedicijnen en kan de afgifte van de medicijnen in de tumorcel bewerkstelligen.

In vitro afgiftecurves van 5-FU-Tau-GO in fosfaatzoutoplossing bij 37 °C

In vitro cytotoxiciteitsonderzoeken

Om de potentiële toxiciteit en de tumortherapie-effectiviteit van nanocarrier te evalueren, werd de levensvatbaarheid van de cellen in vitro uitgevoerd in HepG2-cellen met behulp van MTT-assays (Fig. 11). De Tau-GO vertoonde geen significante cytotoxiciteit bij verschillende concentraties. Na 5-FU-lading vertoonde de 5-FU-Tau-GO een duidelijk remmend effect en op een dosisafhankelijke manier had de nanodrager het vermogen om antitumormiddelen af te geven. De IC₅₀ waarde van 5-FU-Tau-GO was 65,2 ± 0,7μg/ml, wat giftiger was dan de vrije 5-FU (196 ± 8,73 g/ml). Dit kan te wijten zijn aan het vermogen van taurine om apoptose in tumorcellen te induceren, waardoor indirect het remmende effect van 5-FU op cellen wordt versterkt. Verder kon uit het in vitro afgifte-experiment worden gezien dat 5-FU geladen op de Tau-GO geleidelijk in de cellen kon worden afgegeven. Daarom was de effectieve tijd van 5-FU-Tau-GO op cellen langer dan die van vrij 5-FU, en produceerde dus een betere remming.

The viability of different concentrations of 5-FU, Tau-GO, and 5-FU-Tau-GO

AO fluorescent agent could emit green fluorescence when it passed through intact cell membranes and stained nuclei, while EB only marked the nucleus of damaged cells that emitted a red/orange fluorescence. The cells with early and late apoptosis presented greenish yellow or orange nuclei with the AO/EB stain, respectively. Therefore, AO/EB staining was performed to investigate whether the cells death was associated with apoptosis using characteristics of cell morphological changes. The results obtained from the AO/EB staining are presented in Fig. 12. Control cells were in spindle shape and with green nuclei. In the cell group that was cultured with Tau-GO alone, small parts of the nuclei were invaginated and with dark green or orange-red staining. Significant orange or red apoptotic cells with chromatin fragments and apoptotic bodies were observed in the 5-FU alone group. Compared with 5-FU, 5-FU-Tau-GO caused more damage to HepG2 cell morphology, which not only broke the cells, but also caused a large amount of apoptosis in cancer cells. As can be seen from the pictures, almost all the cells that were treated with 5-FU-Tau-GO, had morphological changes, a large number of cell debris and apoptotic bodies, indicating that the 5-FU-Tau-GO nano drug delivery system had a good killing effect on HepG2 cells.

The AO/EB of control (a ), Tau-GO (b ), 5-FU (c ), and 5-FU-Tau-GO (d )

Pharmacokinetic Studies

The pharmacokinetic studies of 5-FU and 5-FU-Tau-GO were performed in SD rats. The profiles of 5-FU concentration in plasma vs. time, following oral administration, are presented in Fig. 13a. We found that the tendency of the two curves was similar, but the 5-FU plasma concentration from the 5-FU-Tau-GO nanocarrier was higher than that from the 5-FU alone and this was observed at each measured time point. Figure 13b shows the 5-FU in vivo release profiles via tail vein. The 5-FU-Tau-GO could achieve sustained drug release over 24 h, and the drug concentration gradually decreased in the first few hours, indicating that 5-FU was slowly released.

In vivo pharmacokinetic standard curves of 5-FU and 5-FU-Tau-GO through oral administration (a ). In vivo pharmacokinetic standard curve of 5-FU and 5-FU-Tau-GO through intravenous injection (b )

The two-compartment model was used to analyze the pharmacokinetic parameters of oral or intravenous administration in rats. The pharmacokinetic parameters are presented in Table 1. Compared with the 5-FU, the 5-FU-Tau-GO showed higher T_1/2β that were 2.3 times by oral administration, and 3.0 times by intravenous injection, respectively. Moreover, the area under the concentration time curve (AUC_0−t ) of 5-FU-Tau-GO nanocomplexes was roughy 2.1-fold higher through the oral administration, and 2.8-fold higher through intravenous injection when compared to that of the 5-FU solution, respectively. Therefore, we concluded that 5-FU-Tau-GO could significantly extend 5-FU retention time in vivo and improve bioavailability. In addition, the T_1/2β of the 5-FU-Tau-GO nanocomplexes that were orally administered (1.67 ± 1.15 h), was longer than that of the intravenous injection (1.33 ± 0.64 h); however, the AUC_0−t of oral administration (36.02 ± 1.83 mg/L*h) was lower than that of intravenous injection (96.50 ± 8.70 mg/L*h). These results might be due to two aspects:on the one hand, when administered by intravenous injection, the drug directly enters the blood system for circulation and without passing through the gastrointestinal barrier for redistribution; on the other hand, because 5-FU easily causes a certain damage to the gastrointestinal system, it may also affect the effective use of drugs in the body.

MD Simulations

The docking and molecular dynamics of unmodified GO, Tau-GO and 5-FU were simulated by molecular docking and molecular dynamics simulation. The molecular docking results of GO, Tau-GO and 5-FU are shown in Fig. 14, where it can be seen that the bond lengths of 5-FU and GO and Tau-GO are 3.66 Å and 2. 602 Å, respectively. Moreover, from the calculation results, the binding energies of 5-FU to GO and Tau-GO were 47.69 kcal/mol and 25.04 kcal/mol, respectively. These indicated that the binding force of Tau-GO and 5-FU was stronger than that of GO and 5-FU. This is due to Tau polar atoms, such as S and N, forming a stronger non-covalent bond with 5-FU, that makes the force between Tau-GO and 5-FU stronger.

The Molecular docking of GO sheets with 5-FU (a ). The molecular docking of Tau-GO with 5-FU (b )

The diagrams of the molecular dynamics simulation of GO, Tau-GO and 5-FU were shown in Fig. 15. According to the calculation results, the CED of 5-FU-GO and 5-FU-Tau-GO were 2.67*10⁸ and 2.83*10⁸ , respectievelijk. These results showed a stronger interaction between the drug and the Tau-GO. The graphs between MSD and time were plotted (Fig. 16) to obtain the diffusion coefficient via MSD. The drug diffusion coefficients were obtained by the slope divided by 6 as follows:0.094m² /s and 0.058 m² /s. These show that the force between Tau-GO and 5-FU is stronger, which is consistent with the results of the molecular docking. Therefore, the functionalized GO makes the entire carrier more abundant in atoms and groups; Therefore, making the non-covalent bond with 5-FU stronger, and the entire system more stable.

Snapshots of the GO and 5-FU at the end of the MD (a ). Snapshots of the Tau-GO and 5-FU at the end of the MD (b )

The drug MSD profiles of the GO and 5-FU (a ), Tau-GO and 5-FU (b )

Conclusies

In summary, we successfully prepared a Tau-GO nanocomposite through a simple chemical method. GO functionalization with Tau has a good stability and improves its biocompatibility. The unique structure and brilliant properties of Tau-GO nanocarriers offer great opportunities for the loading and delivery of 5-FU. The 5-FU-Tau-GO has a potential anti-tumor ability and an excellent circulation time of drugs. Therefore, we believe that the modification of GO by the carrier Tau for 5-FU loading, is an effective and applicable tool for constructing a 5-FU-Tau-GO nano drug delivery system for the delivery of anticancer drugs and anti-tumor therapy.

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

De datasets die tijdens het huidige onderzoek zijn gebruikt en/of geanalyseerd, zijn op redelijk verzoek verkrijgbaar bij de corresponderende auteur.

Afkortingen

GO:: Grafeenoxide
Tau:: Taurine
5-FU:: 5-Fluorouracil
5-FU-Tau-GO:: Taurine functionalized graphene oxide loading 5-fluorouracil
EE:: Encapsulation ratio
LE:: Drug-loading efficiency
FT-IR:: Fourier-transformatie infrarood
TEM:: Transmissie-elektronenmicroscopie
TGA:: Thermogravimetric analyses
MSD:: Mean square displacement
CED:: Cohesive energy density

In situ fabricage van actieve kool uit een bioafval Desmotachya bipinnata voor verbeterde supercondensatorprestaties Nikkel-kobalthydroxiden met afstembare dunne-laags nanobladen voor hoogwaardige supercapacitor-elektrode

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal