De rol van apoptose-route in de cytotoxiciteit die wordt veroorzaakt door verse en verouderde zinkoxide-nanodeeltjes

Resultaten

Karakterisering van ZnO NP's

Om de verschillen in gedetailleerde fysisch-chemische kenmerken tussen verse en verouderde ZnO NP's te bepalen, hebben we eerst de morfologie van NP's waargenomen met behulp van TEM (Fig. 1A). Onze resultaten gaven aan dat 20 nm verse ZnO NP's bijna bolvormige kristallen waren en 90-200 nm verse ZnO NP's onregelmatige staafachtige / kubusvormige kristallen. De grootte van de enkele deeltjes was consistent met de grootte die door de fabrikant werd verschaft. Het is duidelijk dat zowel 20 nm als 90-200 nm ZnO NP's geneigd waren te aggregeren in ultrapuur water. Ook, ongeacht de vorm en grootte van de oorspronkelijke NP's, werd de microstructuur van zowel 20 nm als 90-200 nm ZnO NP's drastisch veranderd van een heldere kristalstructuur in een amorfe of vel-/naaldachtige toestand na 60 dagen veroudering. Verder werden de kristallijne aard en fasezuiverheid van zowel verse als verouderde NP's bepaald met behulp van röntgendiffractie (XRD) met Cu Kα-straling (λ = 0.15418 nm) naderen bij 25 °C, zoals weergegeven in figuur 1B. Het XRD-patroon van verse ZnO NP's gaf aan dat de monsters bestonden uit een kristallijne wurtzietstructuur en dat er geen karakteristieke onzuiverheidspieken werden geïdentificeerd, wat wijst op een hoge kwaliteit van verse NP's. Voor oudere NP's vertoonde het XRD-patroon de neoformatie van Zn₅ (CO₃ )₂ (OH)₆ (kaartnummer 00-011-0287) en Zn (OH)₂ (kaartnummer 00-003-0888) vaste fasen, die de chemische transformatie van ZnO NP's (20 en 90-200 nm) tijdens het verouderingsproces aangeven.

Fysisch-chemische kenmerken van verse en verouderde ZnO NP's. A Representatieve microfoto's van verse en verouderde NP's (100 μg/ml, 20 en 90-200 nm) in Milli-Q water met lage resolutie TEM, B XRD-patronen van verse NP's, verouderde NP's, ZnO, Zn (OH)₂ en Zn₅ (CO₃ )₂ (OH)₆ referenties in gedroogde vorm

Morfologische waarneming van A _L Cellen blootgesteld aan verse en verouderde ZnO NP's

De behandeling van NP's resulteert in een merkbare verandering in cellulaire vorm, of morfologie, in vitro [26]. Daarom, A _L cellen blootgesteld aan verse of verouderde ZnO NP's bij 10 &15 µg/ml gedurende 72 uur werden onderzocht onder een stereoscopische microscoop. Zoals weergegeven in Fig. bleef de celmorfologie in de controlegroep normaal. De cellen hechtten goed, waarbij de meeste zich binnen 2 uur hechtten. De meeste cellen waren spoelvormig of veelhoekig, met een paar nieuw delende cellen die een transparanter cytoplasma en betere dispersie vertoonden tijdens het aanhechtingsproces. Behandeling met 12 μg / ml verse ZnO NP's (20 nm en 90-200 nm) gedurende 72 uur veranderde de celmorfologie aanzienlijk. Hoewel de meeste cellen binnen 3-5 uur hechtten, konden ze zich niet goed verspreiden, en sommige cellen werden afgerond en verloren de veelhoekige vorm. Toen de concentratie van ZnO NP's werd verhoogd tot 15 g/ml, atrofeerden de behandelde cellen en konden ze niet hechten, wat suggereert dat hun cellevensvatbaarheid significant lager is dan die van de cellen die met 10 μg/ml zijn behandeld. Deze resultaten gaven aan dat de LC100 voor verse ZnO NP's waarschijnlijk minder is dan 15 μg / ml bij een behandeling van 72 uur. Daarentegen werd de celmorfologie in 20 nm en 90-200 nm oude NP-behandelde groepen (15 μg / ml) niet significant beïnvloed, en de meeste van de overlevende cellen konden zich hechten en verspreiden, met minder dan half dode cellen waargenomen, onthullend dat verouderde ZnO NP's zijn veel lager cytotoxisch dan verse ZnO NP's.

Morfologische veranderingen in A _L cellen na blootstelling aan verse of verouderde ZnO NP's gedurende 72 uur in aanvullend Ham's F12-medium, en niet-blootgestelde cellen werden gebruikt als controlegroepen. A _L celmorfologie werd waargenomen met een optische microscoop bij 10 × vergroting

Verouderde ZnO NP's veroorzaakten lagere cytotoxiciteit dan verse NP's

Om het verschil in cytotoxiciteit tussen verse en verouderde ZnO NP's verder te onderzoeken, hebben we de levensvatbaarheid van de cellen onderzocht met behulp van CCK-8-kits. Zoals weergegeven in Fig. 3, incubatie A _L cellen met gradiëntdoses van verse en verouderde ZnO NP's (variërend van 0 tot 20 g/ml, 20 nm en 90-200 nm) gedurende 24 uur, 48 uur of 72 uur vertoonden een dosisafhankelijke afname van de levensvatbaarheid van de cellen. Er werd geen duidelijke cytotoxiciteit waargenomen door cellen te behandelen met ZnO NPs ≤ 10 μg/ml. Toen de dosering van verse en verouderde ZnO NP's werd verhoogd tot 12 en 15 g/ml, vertoonde de levensvatbaarheid van de cellen een tijdsafhankelijke neiging tot afname. Het is duidelijk dat de levensvatbaarheid van de cellen in oude NP-behandelde groepen significant hoger was dan bij verse NP-behandelde groepen. Bovendien, ZnCl₂ -behandeling bracht ook de levensvatbaarheid van de cellen in gevaar op een dosis- en tijdsafhankelijke manier, terwijl de cytotoxiciteit van ZnCl₂ was veel minder dan die van zowel verse als oude ZnO NP's.

Levensvatbaarheid van de cellen geïnduceerd door verse en verouderde ZnO NP's in A _L cellen. A _L cellen werden 24 uur geïncubeerd met verschillende concentraties verse en verouderde ZnO NP's (20 en 90-200 nm) (A ), 48 u (B ) en 72 h (C ). D A _L cellen werden blootgesteld aan verschillende concentraties ZnCl₂ voor verschillende tijden. Gegevens waren gebaseerd op ≥ 3 onafhankelijke experimenten en uitgedrukt als gemiddelde ± SD, *p < 0.05

De behandeling van verse ZnO NP's activeerde apoptose-routes en reguleerde de expressie van apoptotische genen op

Om de onderliggende mechanismen te onthullen die leiden tot de lagere cytotoxiciteit van verouderde NP's, analyseerden we RNA-sequencinggegevens van zowel verse als oude ZnO-NP's. Zoals getoond in Fig. 4A, B, werd na behandeling met verse ZnO NP's de apoptose-route geactiveerd in Jurkat-cellen (p = 0.017) en HMDM-cellen (p = 0,041). De apoptose-genen:ANXA1 , CYLD , TNFSF10 , IER3 , CDKN1A , JUN , SAT1 , PMAIP1 , CD38 en ISG20 waren significant verrijkt in verse ZnO NP-behandelde Jurkat-cellen. De apoptose-genen:CD38 , TNFRSF12A , CCNA1 , BMP2 , PPP2R5B , EREG , IFNGR1 , CD44 , CD14 , GNA15 , GCH1 , TIMP1 , BTG2 , IL1B , IL1A , BTG3 , BCL2L11 , SC5D en SPTAN1 waren significant verrijkt in verse met ZnO NP behandelde HMDM-cellen (Fig. 4C, D). Aangezien Jurket-cellen (perifere bloed-T-lymfocytcellen) en HMDM-cellen (menselijke monocyt-afgeleide macrofagen) verschillende soorten cellen zijn, kan de manier waarop ze apoptose veroorzaken anders zijn. Samenvattend toonden deze resultaten aan dat blootstelling aan verse ZnO NP's verschillende apoptose-routes in verschillende soorten cellen zou kunnen activeren.

Apoptose-route was verrijkt met RNA-seq-gegevens van verse ZnO NP-behandelde Jurket- en HMDM-cellen. De verrijkingsscore van significant tot expressie gebrachte genen van de apoptose-route van verse ZnO NP-behandelde Jurket-cellen (A ) en HMDM-cellen (B ). De heatmap van apoptotische genexpressie van verse ZnO NP-behandelde Jurket-cellen (C ) en HMDM-cellen (D ) en hun controlegroepen

Verouderde ZnO-NP's reguleerden de expressie van apoptotische genen niet als verse ZnO-NP's

Onze RNA-sequencinggegevens van verouderd ZnO NP-behandeld A _L cellen toonden aan dat p53, PI3k-Akt, FoXO, Glutathione, ErbB, HIF-1, Oxytocine en Jak-STAT-signaleringsroute waren verrijkt (Fig. 5A). De apoptose-genen verrijkt in Jurket- en HMDM-cellen werden niet significant beïnvloed in de verouderde ZnO NP-behandelde cellen (Fig. 5B). Om de bevindingen verder te bevestigen, hebben we de expressie van verwante genen getest met realtime PCR. We ontdekten dat sommige van de apoptose-genen:BMP2 , PMAIP1 , IL1α , CD69 , CCNA1 , CD38 en IL1β waren niet detecteerbaar in verouderde met ZnO NP's behandelde A _L cellen (gegevens niet getoond), waarschijnlijk omdat de meeste van deze genen tot expressie worden gebracht in cellen van het immuunsysteem. De andere up-gereguleerde apoptose-genen (IL1α , IL1β en CD59 ) waargenomen in verse ZnO NP-behandelde groepen waren niet significant veranderd in expressieniveaus door behandeling met verouderde ZnO NP's. Terwijl de MT1 die als een positieve controle dienen, was significant verhoogd in een expressieniveau, de expressie van Capase 3 was niet significant veranderd (Fig. 5C). Deze gegevens suggereerden dat verouderde ZnO-NP's, in tegenstelling tot hun verse tegenhangers, minder krachtig zijn in het activeren van apoptose-pathway-genen in A _L cellen.

Apoptose-route was niet verrijkt in RNA-seq-gegevens van verouderd ZnO NP-behandeld A _L cellen. (Een ) De genontologie-analyse van verrijkte routes van verouderd ZnO NP-behandeld A _L cellen. (B ) De heatmap van apoptotische genexpressie van verouderd ZnO NP-behandeld A _L cellen en controlegroep. (C ) De expressie van geselecteerde apoptotische genen en controlegenen (MT1 ) in vers en verouderd met ZnO NP behandeld A _L cellen

Verse maar niet verouderde ZnO NP's verhoogden het expressieniveau van het geactiveerde caspase 3-eiwit

Detectie van genexpressie van Capase 3 alleen kan niet direct de activering van de apoptose-route aangeven. Om verder te analyseren of de behandeling van ZnO NP's het niveau van apoptotische eiwitten zou kunnen veranderen, werd de expressie van gesplitst Caspase 3-eiwit, een veelgebruikte biomarker om de activering van celapoptose [27] aan te geven, onderzocht met Western-blotting-analyse. Zoals getoond in Fig. 6, in vergelijking met de controlegroep, verhoogde behandeling met verse ZnO NP's (20 nm) het cellulaire niveau van gesplitst Caspase 3-eiwit met 1,31  ±  0,023-voudig, wat significant hoger was dan dat van 20 nm ZnO NP's- behandelde groep (1,12 ±  0,039-voudig). Toen de deeltjesgrootte van verse ZnO-NP's werd verhoogd tot 90-200 nm, werd de expressie van gesplitst Caspase 3-eiwit geïnduceerd door verse NP's 1,46 ± -0,078-voudig verhoogd, significant groter dan die van oude NP's (1,07   ± -0,075-voudig) . Deze gegevens illustreerden verder de hogere potentie van verse ZnO NP's bij het induceren van celapoptose, in vergelijking met hun verouderde tegenhangers.

Apoptotische niveaus in A _L cellen geïncubeerd met verse en verouderde ZnO NP's (20 en 90-200 nm). Western Blotting-analyse (A ) en kwantificering (B ) van gesplitste Caspase 3-eiwitniveaus wanneer cellen 72 uur werden geïncubeerd met 12 μg / ml verse en verouderde ZnO NP's (20 en 90-200 nm). Gegevens waren gebaseerd op ≥ 3 onafhankelijke experimenten en uitgedrukt als gemiddelde ± SD, *p < 0.05

Discussie

Van ZnO NP's werd gemeld dat ze een fysisch-chemische transformatie ondergaan in Zn₅ (CO₃ )₂ (OH)₆ met de release van Zn ²⁺ tijdens het natuurlijke verouderingsproces [23, 28]. De cytotoxiciteit die wordt veroorzaakt door de getransformeerde (verouderde) ZnO NP's en de onderliggende mechanismen blijven echter onduidelijk. Hier, om het mechanisme van diverse cytotoxiciteit tussen verse en verouderde ZnO NP's te onthullen, werden RNA-sequencing-analyse en RT-PCR-test uitgevoerd. Ook werd Western blotting toegepast om het eiwitniveau van Caspase 3, de belangrijkste uitvoerder in celapoptose, te onderzoeken.

Onze gegevens toonden aan dat verouderde ZnO NP's veel minder cytotoxiciteit induceerden dan verse ZnO NP's in A _L cellen. De LC₁₀₀ van beide verse ZnO NP's (90-200 nm en 20 nm) in onze huidige studie was lager dan 15 μg/ml (Fig. 3), wat consistent was met eerdere bevindingen dat de LC₁₀₀ van ZnO NP's met 19-36 nm tot NIH-3T3 of MSTO-cel is ongeveer 15 μg/ml [29]. We hebben bevestigd dat de omgevingstransformaties van fysisch-chemische eigenschappen in NP's hun toxiciteit drastisch kunnen veranderen. Er is gemeld dat het sulfidatieproces van ZnO NP's hun lading, hydrofobiciteit en aggregatietoestand verandert, wat resulteert in de adsorptie van sulfidetoestand NP's in menselijk speeksel, zweet en bronchoalveolaire lavagevloeistof. En het eiwit geadsorbeerd door ZnO NP's vormde een speciale eiwitkroon, die het biologische effect ervan beïnvloedde [19]. Fosfaten die wijdverbreid aanwezig zijn in fysiologische oplossingen (zoals speeksel) kunnen ZnO NP's omzetten in metastabiel ZnHPO₄ en Zn₃ (PO₄ )₂ binnen ongeveer 5-10 uur en vertoonde cytotoxiciteit voor epitheelcellen van het spijsverteringskanaal [20]. Ivask et al. bewees het optreden van volledige transformatie van ZnO NP's (≤ 3 g/ml) in het in vitro blootstellingssysteem aan menselijke T-lymfocyten (37 °C, celkweekmedium RPMI1640 met 10% FBS gedurende 24 uur) met behulp van synchrotronstraling Röntgenabsorptie near-edge structuur spectroscopie (XANES). Het spectrum en de cytotoxiciteit van de transformatieproducten waren consistent met die van ZnSO₄ [21]. Onze resultaten onthulden de dosis- en tijdsafhankelijke toxiciteit van ZnCl₂ naar A _L cellen, waar de cytotoxiciteit veel lager is dan die van zowel verse als oude ZnO NP's (Fig. 3). De waarneming verklaart verder de bevinding dat de cytotoxiciteit van vers ZnO NP niet volledig wordt toegeschreven aan het vrijgekomen Zn ²⁺ [30].

Onze eerdere studie toonde ook aan dat verouderde ZnO NP's een hogere potentie vertonen bij het opwekken van ROS (reactieve zuurstofsoorten), evenals een verzwakt vermogen om cellen te doden in vergelijking met verse ZnO NP's [23]. We redeneren dat de lagere cytotoxiciteit die wordt veroorzaakt door verouderde ZnO-NP's in zoogdiercellen draaglijker zou kunnen zijn. De huidige studie van RNA-sequencinggegevens illustreerde dat apoptotische genen zijn opgereguleerd in verse ZnO NP-behandelde cellen, waar ze veel minder werden aangetast in verouderde NP-behandelde groepen. IL1α en IL1β zijn leden van de interleukine-1-cytokinefamilie. De afgifte van IL1α en IL1β activeert Caspase 8 gedeeltelijk afhankelijke apoptose [31]. CD69 codeert voor een lid van de calciumafhankelijke lectine-superfamilie van type II transmembraanreceptoren. Verhoogde CD69-expressie was geassocieerd met een verhoogde expressie van de apoptose annexine V en CD95 (Fas) marker [32]. JUN is een subeenheid van de AP-1-transcriptiefactor. Verhoogde JUN-activiteit splitst proteolytisch alfa-fodrin, een substraat van het interleukine-1beta-converting enzyme (ICE), en de CED-3-familie van cysteïneproteasen, wat verder leidt tot geprogrammeerde celdood [33]. De verhoogde expressie van deze apoptotische genen onthulde dat verse NP's op verschillende manieren apoptose veroorzaken. After the elevation of these apoptotic gene expressions, apoptosis processes are eventually executed by apoptotic proteins (Fig. 7). Caspase 3 is the core protease for various apoptotic scenarios; cleavage of this protein is necessary to activate both extrinsic and intrinsic apoptotic pathways [34, 35]. Therefore, detection of cleaved caspase 3 is a common method for identifying apoptosis induced by a wide variety of apoptotic signals [36]. Our Western blotting data revealed that, for both 20 nm and 90–200 nm ZnO NPs, sublethal exposure did not alter the level of Pro caspase 3 in all treatment groups. In contrast, cleaved Caspase 3 was significantly elevated by fresh NPs treatment, where aged NPs showed few (if any) effects on the level of cleaved caspase 3 (Fig. 6). Combined with RNA expression analysis, our results clearly elucidated the higher potency of fresh ZnO NPs in inducing cell apoptosis.

Model for Fresh ZnO NPs but not aged ZnO NPs induces Caspase 8- and Caspase 3-dependent apoptosis. The increased expression of apoptotic gene CD69 activates Fas and apoptosis annexin V expression in fresh ZnO NP-exposed mammalian cells. The increased expression of apoptotic gene IL1α and IL1β partially activates Caspase 8-dependent apoptosis. It further causes activation of Caspase 3 and induces apoptosis. All these changes in mRNA and protein level were not detectable in aged ZnO NPs-exposed mammalian cells

Conclusies

In the present study, the natural physicochemical transformation of ZnO NPs in ultrapure water was confirmed, and variations in cytotoxicity induced by fresh &aged NPs were investigated. We focused on RNA sequencing data from our aged ZnO NP-treated A _L cells and that of fresh NPs from database. We compared those signaling pathway specifically enriched in aged NP-treated group, which are different from that of fresh NP- or ZnCl₂ -treated groups. Our data indicated that the lower cytotoxicity of aged ZnO NPs is closely related to its attenuated ability in inducing apoptosis, while the transcriptional regulation of the multiple pathways activated by NPs promotes the establishment of cellular homeostasis in mammalian cells.

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

Niet van toepassing.

Afkortingen

NPs:

Nanopowders

ZnO:

Zinkoxide

Zn₅ (CO₃ )₂ (OH)₆ :

Hydrozincite

Zn (OH)₂ :

Zinc hydroxide

ZnCl₂ :

Zinc chloride

ZnSO₄ :

Zinksulfide

ZnHPO₄ :

Zinc hydrogen phosphate

Zn₃ (PO₄ )₂ :

Zinc phosphate

A _L cells:

Human–hamster hybrid cells

CHO cells:

Chinese hamster ovary cells

Jurket cells:

Peripheral blood T lymphocyte cells

HMDM cells:

Human monocyte-derived macrophages

NIH-3T3cells:

Mouse embryonic cells

MSTO cells:

Human lung cancer cells

RPMI1640:

Roswell Park Memorial Institute 1640

ICE:

Interleukin 1beta-converting enzyme

CED-3:

Caenorhabditis elegans death gene

IL1α:

Interleukin 1alpha

IL1β:

Interleukin 1beta

mRNA:

Messenger ribonucleic acid

cDNA:

Complementary deoxyribonucleic acid

FBS:

Foetaal runderserum

TEM:

Transmissie-elektronenmicroscopie

XRD:

Röntgendiffractie

RT-PCR:

Real-time polymerase chain reaction

CPI:

The Nanotechnology Consumer Product Inventory

XANES:

Synchrotron radiation X-ray absorption near-edge structure spectroscopy

RIPA:

Radio immunoprecipitation assay

SDS-PAGE:

Polyacrylamide gel electrophoresis

PVDF:

Polyvinylideenfluoride

ECL:

Enhanced chemiluminescence

CCK-8:

Celtelkit-8