hGC33-Modified en Sorafenib-Loaded Nanodeeltjes hebben een synergetisch anti-hepatoma-effect door de Wnt-signaleringsroute te remmen

Resultaten

Karakterisering van NP's en geneesmiddelafgifte In vitro

Omdat de diameter en oppervlakte-eigenschappen van NP de celopname, medicijnafgifte en NP-distributie in vivo beïnvloeden, hebben we de bereide NP gekarakteriseerd met overeenkomstige parameters. De morfologie, deeltjesgrootte en deeltjesgrootteverdeling van SFB-NP-, hGC33-null-NP- en hGC33-SFB-NP-polymeren zijn samengevat in Fig. 1. De morfologie van hGC33-SFB-NP waargenomen door transmissie-elektronenmicroscoop (Fig. . 1a) toont starre kernen met vage randen, wat aangeeft dat hGC33 aanwezig is op het oppervlak van NP's. De deeltjesgrootten van SFB NP, hGC33-null-NP en hGC33-SFB-NP varieerden van 100 tot 150 nm en hadden een typische unimodale deeltjesgrootteverdeling. De gemiddelde diameter van hGC33-SFB-NP (120,2 ± 10,2 nm) was iets groter dan die van hGC33-null-NP, SFB-NP en nul-NP (Fig. 1a, Tabel 1). Dunne bolvormige onduidelijke films met een enkel oppervlak waren aanwezig op het oppervlak van hGC33-SFB-NP en hGC33-null-NP, wat aangaf dat antilichaam hGC33 aanwezig was op het oppervlak van NP's. De toegenomen grootte voor hGC33-SFB-NP en hGC33-null-NP bevestigde het bestaan ​​van hGC33-film. De synthese van hGC33-SFB-NP werd bevestigd met ¹ H-NMR (Fig. 1b) vóór NP-bereiding. De pieken bij 5,2 ppm en 1,58 ppm werden toegewezen aan -CH3-protonen van melkzuur; de piek bij 4,8 ppm werd toegewezen aan -OCH2- van glycolzuur; en de piek bij 3,6-3,8 ppm werd toegewezen aan de -CH2CH2O- protonen van PEG-herhalingseenheden. Oppervlaktechemie van PEG-b -PLGA en Ab-PEG-b -PLGA NP's werden ook bestudeerd met FTIR-spectroscopie (figuur 2c). In het spectrum van PEG-b -PLGA-polymeer, een sterke band van ongeveer 1750 cm ⁻¹ ontstaan ​​uit het stuk van de carbonylgroepen (C = O) in de PLGA-keten. Een band van 2880 cm ⁻¹ was te wijten aan het uitrekken van een a -CH-groep in de PEG-keten. Tegelijkertijd verscheen er een piek bij 2520 cm ⁻¹ die we toeschreven aan de -SH-rekpiek van het hGC33-antilichaam. De  ¹ H NMR- en FTIR-resultaten gaven aan dat antilichaam was geënt op de ruggengraat van de PEG-b -PLGA-polymeren.

Karakterisering van NP's. een TEM-karakterisering van NP's, de schaalbalk geeft 100 nM aan; b de  ¹ H NMR-spectra van synthetisch hGC33-PLGA-b -PEG in CDC13; c FTIR-spectra van hGC33-PEG-b -PLGA en PEG-b - PLGA; d cumulatieve afgifteprofielen van SFB-NP en hGC33-SFB-NP in PBS (pH = 7.4) bij 37 °C; e grootteveranderingen van NP's geïncubeerd in DMEM-medium met 10% FBS gedurende 14 dagen; v grootteveranderingen van NP's geïncubeerd in PBS gedurende 14 d. SFB, sorafenib; TEM, transmissie-elektronenmicroscopie; NP's, nanodeeltjes; ¹ H NMR, ¹ H-nucleaire magnetische resonantiespectroscopie; FTIR, Fourier-transformatie infraroodspectroscopie

Expressie van GPC3 en opname van hGC33-coumarine6-NP in Li-7- en HepG2-cellen. De cellen, geïnoculeerd in de kweekplaat, werden gewassen met PBS en 2, 4 en 8 uur geïncubeerd met 100 μg/ml hGC33-coumarine6-NP in DMEM. Kernen werden gekleurd met DAPI en de cellen werden gefixeerd en gedetecteerd door confocale laser scanning microscopie. GPC3 werd niet gedetecteerd in Li-7-cellen, maar werd sterk tot expressie gebracht in HepG2-cellen, zoals gedetecteerd door immunocytochemie. De schaalbalk geeft 50 M

Interessant is dat hGC33-SFB-NP- en SFB-NP-nanodeeltjes in DMEM-medium met 10% FBS (pH = 7.4) een snelle geneesmiddelafgifte hadden tot ongeveer 4 dagen, daarna relatief langzame en stabiele geneesmiddelafgifte; de cumulatieve SFB-afgifte van hGC33-SFB-NP en SFB-NP gedurende 20 dagen was respectievelijk ongeveer 77% en 65% (figuur 1d). Het verschil kan te wijten zijn aan het hydrofiele molecuul op het oppervlak van de PEG-b -PLGA-matrix, die de afbraak van de nanodeeltjes kan versnellen door de hydratatie te verhogen en daardoor hydrolyse te bevorderen. Om de stabiliteit van de bereide NP's te bepalen, werden de hGC33-SFB-NP, hGC33-null NP, null-NP en SFB-NP in DMEM-medium met 10% FBS (pH = 7.4) en in PBS (pH = 7.4) geplaatst. ). De maten van de verschillende NP's bleven ruim 2 weken stabiel. SFB werd gedurende 14 dagen op een aanhoudende en stabiele manier vrijgemaakt uit hGC33-SFB-NP, maar er was een bescheiden verandering in de grootte van de deeltjes in DMEM-medium vergeleken met die in 10% FBS (Fig. 1e, f). Stabiliteit van hGC33-SFB-NP zou geschikt zijn voor SFB met een aanhoudende biologische rol.

Een groot zeta-potentiaal kan een sterke elektrostatische afstotende interactie tussen NP veroorzaken en de stabiliteit van het NP-dispersiesysteem behouden [23, 24]. Zoals weergegeven in tabel 1, zijn de zeta-potentialen van hGC33-SFB-NP, hGC33-null-NP en SFB-NP respectievelijk  − 18,2 ± 2,2 mv,  − 18,5 ± 1.8 mv en  − 15,9 ± 2.1 mv, wat kan worden veroorzaakt door de negatieve ladingen die worden gegenereerd door de aldehydegroep, carboxylgroep en fosfaatgroep in het antilichaam hGC33-glycoproteïne. De negatief geladen NP's kunnen leiden tot de hoge stabiliteit van NP-suspensie. Bovendien, omdat het oppervlak van cellen negatief geladen is in normale fysiologische omgevingen, stoten de bereide NP's cellen met een lage lading af en zijn ze minder toxisch voor weefsels en cellen. Bovendien was de grootteverdeling van nul-NP en SFB-NP (respectievelijk polydispersiteitsindex [PDI] 0,18 en 0,19) iets maar niet significant kleiner dan die van hGC33-null-NP (PDI = 0.21) en hGC33-SFB- NP (PDI = 0.23). De grootte van de nanodeeltjes heeft dus een goede uniformiteit. De deeltjesgrootte, deeltjesgrootteverdeling en zeta-potentiaal van NP worden getoond in Tabel 1 volgens de resultaten van SFB-inkapselingsefficiëntie en laadinhoud. Het ongeconjugeerde GPC3-antilichaam hGC33 werd verwijderd door ultracentrifugatie en de bindingsefficiëntie van hGC33-antilichaam aan NP's werd geëvalueerd. BCA-eiwitanalyse toonde aan dat de bindingsefficiëntie van hGC33-antilichaam aan NP's 79,5% ±-2,9% was.

hGC33-Coumarin 6-NP richt zich effectief op GPC3 ⁺ HCC-cellijn HepG2-cellen

Om erachter te komen of het hGC33-antilichaam van nanodeeltjes nog steeds het vermogen heeft om zich specifiek op GPC3 te richten, gebruikten we GPC3 ⁺ HepG2 en GPC3 ⁻ Li-7-cellen als doelcellen en hGC33-coumarine 6-NP als tracer-nanodeeltjes, en incubeerden de verschillende cellen gedurende 2 uur, 4 uur en 8 uur. De cellen werden 3 keer gewassen met PBS en reageerden met DAPI om de kern te kleuren. De cellen werden gefixeerd en gefotografeerd met de Leica fluorescentiemicroscoop (DMi8, Duitsland). Er werd gevonden dat de groene fluorescentie in HepG2-cellen significant hoger was dan die in Li-7-cellen op dezelfde incubatietijd (Fig. 2), wat aangeeft dat de hoeveelheid hGC33-coumarine 6-NP die HepG2-cellen binnenkomt significant hoger was dan dat in Li-7-cellen. De resultaten documenteerden dat het hGC33-antilichaam op hGC33-Coumarin6-NP nog steeds het vermogen had om zich op GPC3 te richten en de internalisatie van nanodeeltjes te bemiddelen. De expressie van GPC3 in HepG2-cellen en Li-7-cellen werd onderzocht met indirecte fluorescentie en cytochemische kleuring. De resultaten toonden aan dat HepG2-cellen GPC3 tot overexpressie brachten, terwijl Li-7-cellen GPC3 niet tot expressie brachten (Fig. 2).

hGC33-Null-NP remt proliferatie van HepG2-cellen

Om te bepalen of hGC33-gemodificeerde NP (hGC33-null-NP) de groei van HCC zou kunnen remmen, hebben we de celgroeiremming van GPC3-positieve HCC-cellijn HepG2 en GPC3-negatieve cellijn Li-7 gemeten. We ontdekten dat zowel hGC33-null-NP als hGC33 de groei van de GPC3-positieve HCC-cellijn HepG2 remden na 24 uur behandeling, maar hGC33 had een significant remmend effect op HepG2-cellen dan hGC33-null-NP (Fig. 3a); hGC33-null-NP en hGC33 hadden daarentegen geen invloed op de groei van de GPC3-negatieve Li-7-cellijn (figuur 3b). Het representatieve tijdsverloop van hGC33-null-NP (gelijk aan 0,1 m hgc33) en hGC33 (0,1 m) op HepG2-celproliferatie wordt geïllustreerd in figuur 3c. Omdat hGC33 een C-terminaal peptide is dat GPC3 herkent, is hGC33 superieur aan hGC33-null-NP bij het remmen van HepG2. De resultaten suggereren dat het hGC33-molecuul in hGC33-null-NP een ruimteblokkerend effect kan hebben, wat het bindingsvermogen van hGC33 aan epitopen kan beïnvloeden.

De proliferatie van HepG2- en Li-7-cellen werd geremd door hGC33, null-NP en hGC33-null-NP. een Celproliferatietest werd uitgevoerd op GPC3-positieve HepG2-cellen die waren behandeld met hGC33, null-NP of hGC33-null-NP; b celproliferatietests werden uitgevoerd op GPC3-negatieve Li-7-cellen die waren behandeld met hGC33, null-NP en hGC33-null-NP. De cellen werden gedurende 1 dag geïncubeerd met 0-2,5 μM hGC33, null-NP of hGC33-null-NP. De proliferatie van de cellen werd gemeten met de MTT-methode en gestandaardiseerd als onbehandelde cellen. Alle waarden vertegenwoordigen het gemiddelde  ± SD. Vergeleken met de controlegroep (0 μM) zonder antilichaambehandeling, *P < 0,01; c de representatieve resultaten van de respons van HepG2 op hGC33, null-NP en hGC33-null-NP in hGC33-behandeling (1,0 μM)

hGC33-Null-NP remt celcyclus van HepG2-cellen

Om het mechanisme van de moleculaire activiteit van hGC33-antilichaam gemodificeerd op hGC33-null-NP-nanodeeltjes te begrijpen, hebben we de celcyclusprogressie van HepG2 behandeld met hGC33-null-NP bestudeerd. In de HepG2-cellijn verhoogden hGC33-null-NP en hGC33 het aandeel cellen in G1 significant (Fig. 4a, b), wat aangeeft dat zowel hGC33-null-NP als hGC33 het stoppen van de celcyclus in de G1-fase zouden kunnen induceren. Bovendien zouden hGC33-null-NP en hGC33 de gereguleerde cyclinD1-expressie in HepG2-cellen aanzienlijk kunnen verlagen (Fig. 4c, d).

hGC33-null-NP en hGC33-geïnduceerde stopzetting van de celcyclus in G1-fase en remden cyclinD1-expressie in HepG2-cellen. een Representatief celcyclusdiagram van verschillende groepen behandeld met hGC33-null-NP en hGC33. b Celcyclusanalyse van verschillende groepen behandeld met hGC33-null-NP en hGC33. De HCC-cellen werden geïncubeerd met 0, 5 m hGC33 of hGC33-null-NP (met de molaire concentratie van hGC33 als referentie). *P <-0,05 werd de G1-fase van hGC33-null-NP- of hGC33-cellen vergeleken met die van 0 h-cellen. c , d Na behandeling met hGC33-null-NP of hGC33 was cyclinD1 significant lager gereguleerd in HepG2-cellen vergeleken met die in de controlegroep

Wnt-activering in HepG2-, Huh-7- en Li-7-cellen

Om de activering van het klassieke Wnt/β-Catenine-signaal in HCC-cellen te begrijpen, hebben we eerst de expressie van Wnt-ligand en receptor-crimp-eiwit (frizzled, FZD of Frz) gedetecteerd in verschillende HCC-cellijnen:HepG2 (GPC3 ⁺⁺ ), Huh-7 (GPC ⁺ ), en Li-7 (GPC3 ⁻ ). De resultaten toonden aan dat de Wnt3a- en FZD-receptor van de β-Catenine-route tot expressie werden gebracht in alle cellijnen, vooral in HepG2- en Huh-7-cellen (Fig. 5).

Expressie van Wnt3a, FZD1 en FZD3 in HCC-cellijnen

hGC33-Null-NP remt Wnt-signaaltransductie-afhankelijke celproliferatie geïnduceerd door Wnt3a

Sommige onderzoeken hebben aangetoond dat het extracellulaire deel van GPC3 een co-receptor van Wnt kan zijn, die Wnt/β-Catenine-signaalactivering en -transductie bevordert. Daarom, wanneer HepG2 (GPC3 ⁺ ), Huh-7 (GPC3 ⁺ ), en Li-7 (GPC3 ⁻ ) cells were co-incubated with hGC33 and hGC33-null-NP, the activation of Wnt/β-catenin signal was blocked by hGC33 and hGC33-null-NP, and proliferation of HepG2 and Huh-7, but not Li-7, in Wnt3a-conditioned medium was inhibited. That proliferation of Li-7 cells most likely is due to the absence of GPC3 on the surface of Li-7 cells (Fig. 6). Our results indicate hGC33 and hGC33-null-NP nanoparticles specifically bind to GPC3 molecules on cell membrane. hGC33 and hGC33-null-NP partially neutralize the mitogenic activity of Wnt3a and inhibit the Wnt/β-catenin signaling pathway. However, the inhibition of proliferation by hGC33-null-NP nanoparticles was less than that of hGC33. Perhaps the spatial structure of the nanoparticles interferes with hGC33-null-NP and limits the function of the hGC33 molecule on the nanoparticles so they cannot completely block the interaction between GPC3 and Wnt3a.

GPC3-activated Wnt signal transduction in HCC. Fifty percent Wnt3a DMEM medium was added with anti-wnt3a antibody, hGC33, or hGC33-null-NP. HepG2 (GPC3 ⁺⁺ ), Huh-7 (GPC3 ⁺ ) and Li-7 (GPC3 ⁻ ) cells were co-incubated for 48 h, and cell proliferation was measured by MTT assay. The data were expressed as mean ± SD (*P  < 0.01)

hGC33-Null-NP Inhibits Wnt3a-Induced Signal Transduction in HepG2 and Huh-7 Cells

To understand the effect of hGC33-null-NP on Wnt/β-catenin signaling in HCC cells, we extracted the proteins of HepG2 and Huh-7 cells treated with hGC33 or hGC33-null-NP. The results of western blot showed that after hGC33-null-NP treatment, the levels of pYAP and pβ-catenin were increased, but the levels of YAP and β-catenin were decreased. Furthermore, the levels of cyclinD1, CD44, VEGF, and c-MYC in the hGC33-null-NP group were lower than those in the control group, but the level was less than with hGC33 treatment. Similar effects were observed in HepG2 and Huh-7 cells, as shown in Fig. 7.

Inhibition of Wnt3a-induced β-catenin signaling by hGC33-null-NP or hGC33. een Compared with the control group, Wnt/β-catenin signaling pathway in HepG2 and Huh-7 cells treated with hGC33-null-NP or hGC33 was inhibited, and the levels of β-catenin and YAP were decreased, while the increased phosphorylated β-catenin and phosphorylated YAP molecules were unstable, and degraded in cytoplasm. The decreased β-catenin was difficult to maintain in the nucleus and drive the expression of CyclinD1, CD44, VEGF, and c-MYC, which resulted in the decrease of cyclinD1, CD44, VEGF, and c-myc protein levels. b The mechanism pattern of Wnt/β-catenin signaling pathway inhibited by hGC33-null-NP or hGC33

hGC33-SFB-NP or hGC33 Attenuates HCC Cell Migration by Inhibiting Epithelial Mesenchymal Transition (EMT)

HCC is one of the deadliest cancers in the world, and its incidence is steadily increasing. Sorafenib is the only approved standard treatment for patients with advanced HCC, as it has been shown to improve the survival rate of these patients. However, clinical and preclinical observations suggest that sorafenib therapy has limited efficacy due to the rapid development of drug resistance. Therefore, elucidating the mechanism of escape resistance to sorafenib is a major emphasis in HCC research. In recent years, more and more attention has been paid to the role of epithelial mesenchymal transition (EMT) in the progress of HCC and the development of drug resistance. EMT refers to the transformation of epithelial to mesenchymal cells, which endows cells with the ability metastasize and invade, including acquisition of stem cell characteristics, reducing apoptosis and aging, promoting immunosuppression, and participating in the occurrence and development of cancer. The loss of E-cadherin expression is considered a key step in the carcinogenesis and EMT. EMT is a developmental multi-step molecular and cellular reprogramming process that cancer cells use to achieve aggression. This is mainly through down regulating the expression of E-cadherin, keratin, mucin, ZO-1 (tight junction protein); up regulating the expression of vimentin, alpha-smooth muscle actin (α-SMA), FN fibronectin, MMPs (degradation matrix), N-cadherin, snail, slug, twist, Rho, TGF-β, FGF, type I collagen, and type II collagen to achieve the invasion, metastasis, and anti-apoptosis of EMT characteristic tumor. The changes of these protein expressions mainly involve the activation of Wnt/β-catenin and Ras/Raf/MAPK signaling pathways.

Our experiments have shown that hGC33 antibody on the surface of NP vector can inhibit Wnt3a-induced β-catenin signal transduction, and then down regulate the expression of β—catenin, CD44, vascular endothelial growth factor (VEGF), cyclin D1, and c-MYC. Furthermore, hGC33-SFB-NP inhibits the activation of Ras/Raf/MAPK signal pathway and inhibits proliferation and apoptosis of HCC cells. hGC33 and SFB have a synergistic effect, inhibiting EMT and decreasing the migration of HCC cells (Fig. 8).

Effect of hGC33-SFB-NP on EMT inhibition. een Compared with the control group, the hGC33-SFB-NP treatment group had less cell migration. Photographs were taken under an optical microscope (magnification, × 200). The error value represents the standard deviation of three independent experiments. *Compared with the control group, p < 0.01. b Compared with the control group, the EMT-related proteins snail, vimentin, and MMP-2 in HCCs treated with hGC33-SFB-NP decreased, whereas E-cadherin increased. c Molecular mechanism of EMT. EMT, epithelial–mesenchymal transition; MMP-2, matrix metalloproteinase-2; SFB, sorafenib; NP, nanoparticle

hGC33-SFB-NP Inhibits the Growth of Hepatocellular Carcinoma In Vivo and Improves the Survival Rate of Tumor-Bearing Mice

To evaluate the anti-tumor activity of hGC33-SFB-NP in vivo, HepG2 and Huh-7 cells were inoculated subcutaneously into the right abdomen and dorsal side of female BALB/c nude mice, respectively. When the tumor xenograft growth reached about 30 mm ³ , the mice were randomly divided into groups to further evaluate the inhibition of each group (hGC33-SFB-NP, hGC33-null-NP, SFB-NP, free hGC33, free SFB, and control group) HCC effect (n  = 5 per group). It can be seen from Fig. 9a, b that hGC33-SFB-NP significantly slowed tumor growth in mice compared with the PBS control and other treatments. Compared with the PBS control, hGC33-null-NP, SFB-NP, free hGC33, and free SFB also had some inhibition of HCC, which is because free hGC33 and free SFB directly inhibit Wnt signal and Ras/Raf/MAPK, respectively. Such pathways can inhibit the proliferation of HCC cells to a certain extent. Although the nanoparticle-modified hGC33 (hGC33-null-NP) is connected to the nanosurface through chemical bonds, it did not affect hGC33′s targeting of GPC3 molecules and inhibition of Wnt activity. Nanoparticle-loaded SFB (SFB-NP), after being endocytosed by cells, was degraded to release SFB from the copolymer to inhibit the growth of HCC. In all, the inhibitory effect of hGC33-SFB-NP on HepG2 cell grafts was, as expected, more than on Huh-7 cell grafts, probably because HepG2 expresses GPC3 molecules.

The effect of hGC33-SFB-NP on xenotransplantation of HCC in nude mice and the changes of mice weight. Liver cancer cells were inoculated subcutaneously on the back of each nude mouse (n  = 10). After 10 days, the tumor bearing mice were treated with PBS (control), free hGC33, free SFB, hGC33-null-NP, SFB-NP, and hGC33-SFB-NP. Tumor size (a , b ) and body weight (c , d ) of mice were monitored at designated time points

The body weight of nude mice in each treatment group also was measured, as shown in Fig. 9c, d. The body weight of the control group decreased gradually. The weight of mice in free hGC33, free SFB, SFB-NP, and hGC33-null-NP treatment groups also decreased progressively and not significantly less than in the control group. However, the weight of nude mice bearing HepG2 and Huh-7 treated with hGC33-SFB-NP only slightly decreased, and the weight remained relatively stable during the treatment cycle. These results support that the novel hGC33-SFB-NP nanodrug has no significant toxicity in nude mice, and the SFB loaded on the nanocarrier and the surface modified hGC33 can produce additive or even synergistic anti-tumor effect.