Gint4.T-gemodificeerde DNA-tetraëders geladen met doxorubicine remt de proliferatie van glioomcellen door zich te richten op PDGFRβ

Abstract

Glioma is een van de dodelijkste intrinsieke hersentumoren vanwege de invasieve groei. Het effect van glioombehandeling is slecht vanwege de aanwezigheid van de bloed-hersenbarrière en bloedtumorbarrière en onvoldoende gerichte medicatie. DNA-tetraëders (TDN) vertonen een groot potentieel voor medicijnafgifte en kunnen een nieuwe therapeutische strategie voor glioom zijn. In deze studie hebben we TDN gebruikt om doxorubicine (DOX) te leveren voor de glioomtherapie. Gint4.T, een aptameer dat van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor β op tumorcellen kon herkennen, werd gebruikt om TDN (Apt-TDN) te modificeren voor gerichte medicijnafgifte. De TDN waren zelf-geassembleerd door eenstapssynthese, die een klein formaat (10 nm) en een negatieve lading vertoonde. Foetale runderserumtest toonde zijn stabiliteit als vehikel voor medicijnafgifte. Apt-TDN kan effectief worden opgenomen door U87MG-cellen. Vergeleken met DOX en DOX@TDN (TDN geladen met DOX), vertoonde de DOX@Apt-TDN (Gint4.T-gemodificeerde TDN geladen met DOX) een hogere snelheid van apoptose, een hogere stopzetting van de celcyclus en een grotere cytotoxiciteit voor U87MG-cellen. Concluderend gaven onze bevindingen aan dat DOX@Apt-TDN een nieuwe therapie biedt met veelbelovende klinische toepassing voor gliomenpatiënten.

Inleiding

Glioom, een tumor afgeleid van het neuroepitheel, is de meest voorkomende intracraniële maligniteit. Bijna 1/3 van alle hersentumoren zijn gliomen, en ongeveer 4/5 van de primaire kwaadaardige hersentumoren zijn gliomen [1,2,3,4]. Momenteel is de meest effectieve behandeling voor glioom chirurgische resectie en postoperatieve gelijktijdige chemoradiotherapie, maar helaas blijft de prognose voor patiënten slecht. Traditionele chemotherapie voor glioma laat geen goed resultaat zien vanwege een slechte tumortargeting, complicaties als gevolg van de bloed-hersenbarrière (BBB) en bloedtumorbarrière (BTB) en onvoldoende targeting van geneesmiddelen. De BBB is de belangrijkste factor die de afgifte van bijna alle macromoleculen (inclusief medicijnen en genen) aan het hersenparenchym en hun juiste functie verhindert. Geneesmiddelen die de BBB niet kunnen passeren, moeten in voldoende hoge doses worden toegediend om een effectieve behandelingsconcentratie in het interessegebied te bereiken. Een teveel aan geneesmiddelen kan echter ernstige systemische bijwerkingen en ongewenste accumulatie van geneesmiddelen in niet-aangetaste weefsels veroorzaken. Bovendien hebben bestaande conventionele anti-glioommedicijnen onvoldoende doelgerichtheid [3, 4]. Nanodeeltjes zijn naar voren gekomen als het meest veelbelovende hulpmiddel voor het dragen van medicijnen. Vanwege hun groottevoordeel kunnen nanodeeltjes de BBB passeren en een antitumoreffect uitoefenen. Kafa et al. [5] ontwierp chemisch gefunctionaliseerde meerwandige koolstofnanobuizen (f-MWNT's) gericht op ANG en bevestigde hun vermogen om de BBB te doorkruisen via in vivo en in vitro experimenten. Deze nanomaterialen kunnen echter naar verschillende organen in het lichaam worden gedistribueerd of zelfs het centrale zenuwstelsel (CZS) binnendringen, waar ze neurotoxiciteit kunnen veroorzaken [6].

DNA is een ideaal materiaal voor constructie van nanostructuren omdat de assemblage ervan nauwkeurig kan worden gecontroleerd door Watson-Crick basenparing [7]. Tot op heden zijn een aantal tweedimensionale (2D) en driedimensionale (3D) DNA-nanostructuren ontworpen en gedemonstreerd [8,9,10]. Tetraëdrische DNA-nanostructuren (TDN) hebben veel aandacht getrokken vanwege hun biocompatibiliteit, stabiliteit, overvloedige gefunctionaliseerde modificatieplaatsen en lage immunogeniciteit [11,12,13]. Turberfield et al. gesynthetiseerde DNA-tetraëdrische nanostructuren met een hoge opbrengst met behulp van een eenstapssynthesemethode [14]. Walsh et al. ontdekte dat een DNA-tetraëder die een nucleïnezuurprobe bevat, zoogdiercellen kan binnendringen zonder dat transfectiereagens nodig is [15]. Lee et al. toonde aan dat zelf-geassembleerde tetraëdrische nanodeeltjes kunnen worden gebruikt voor gerichte siRNA-afgifte in vivo [16]. TDN heeft uitstekende toepassingsvooruitzichten laten zien in moleculaire diagnostiek, moleculaire afgifte en gerichte medicamenteuze therapie. Ze worden ook veel gebruikt bij onderzoek naar tumoren in verschillende organen, zoals borstkanker [17]. Evenzo is TDN ook gebruikt bij de studie van ziekten van het zenuwstelsel. Tian et al. [18] gebruikte DNA-tetraëders als basis en wijzigde ze met angiopep-2 (ANG) om met succes de nanoprobe ANG-TDN te construeren, die zich zou kunnen richten op low-density lipoproteïnereceptor-gerelateerd eiwit 1 (LRP-1) voor gerichte beeldvorming. Onderzoek heeft aangetoond dat ANG-TDN de BBB kan passeren. Ma et al. [19] suggereerde dat tetraëdrische DNA-nanostructuren neurale stamcellen (NSC's) kunnen binnendringen zonder de noodzaak van transfectiemiddelen, waar ze neurale stamcelmigratie, proliferatie en differentiatie bevorderen [20], en een groot potentieel hebben voor herstel en regeneratie van neuraal weefsel . Daarom hebben we de mogelijkheid onderzocht van het gebruik van TDN bij glioomtherapie en het verbeteren van het doelgerichtheidsvermogen.

Van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor β (PDGFRβ) is een belangrijk lid van de tyrosine-eiwitkinasefamilie die betrokken is bij cellulaire proliferatie, migratie en angiogenese. Verschillende onderzoeken hebben aangetoond dat PDGFβ een veelbelovend doelwit is voor antitumortherapieën vanwege zijn rol in angiogenese [21, 22]. Aptameren zijn korte, enkelstrengs DNA- of RNA-oligonucleotiden die worden geproduceerd door de systematische evolutie van liganden door middel van exponentiële verrijking (SELEX)-methode. Aptameren zijn vergelijkbaar met antilichamen, die een hoge affiniteit en specificiteit hebben voor hun doelwitten [23]. Vanwege hun unieke eigenschappen spelen aptameren een belangrijke rol bij de gerichte afgifte van chemotherapeutische middelen, siRNA's en met medicijnen beladen nanodeeltjes. Gint4.T, een RNA-aptameer dat specifiek PDGFRβ kan binden, is ook een PDGFRβ-specifieke antagonist [24]. Monaco et al. [25] suggereerde dat Gint4.T-aptameren de bloed-hersenbarrière (BBB) kunnen passeren en specifiek PDGFRa kunnen herkennen. Gint4.T-geconjugeerde polymere nanodeeltjes (PNP's) kunnen gemakkelijk worden opgenomen door glioblastoma (GBM) cellen. In deze studie rapporteren we een nieuw met medicijnen geladen systeem dat de Gint4.T-aptamer en TDN combineert. Het Gint4.T-gemodificeerde TDN (Apt-TDN) geladen met DOX (DOX@Apt-TDN) vertoonde een verhoogde specifieke cellulaire opname en cytotoxiciteit tegen U87MG-cellen.

Methoden

Materialen

Alle DNA-oligonucleotiden en 2'F-Py RNA-oligonucleotiden werden gekocht bij Sangon Biotech (Shanghai, China) en alle oligonucleotidesequenties worden vermeld in tabel 1. GelRed DNA-gelkleuringsoplossing werd gekocht bij Sangon Biotech. Zowel foetaal runderserum (FBS) als Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) werden gekocht bij Thermo Fisher (New York, VS). Doxorubicine (DOX) werd gekocht bij Mengbio Technology (Chongqing, China). U87MG-cellen werden gekocht bij de Shanghai Life Academy of Sciences Cell Library (Shanghai, China). DAPI is gekocht van Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Beijing, China).

Voorbereiding van DNA-nanostructuren

Om de DNA-tetraëder te assembleren (Tabel 1), werd 2 μL van elk oligonucleotide (S1, S2, S3 en S4) toegevoegd aan 42 μL TM-buffer (10 mM Tris-HCl, 5 mM MgCl₂ , pH =8). De DNA-oplossing werd vervolgens 5 min verwarmd tot 95 ° C en vervolgens 2 min afgekoeld tot 4 ° C met behulp van een Bio-Rad PCR-machine (California, VS) [26, 27]. De eindconcentratie van TDN was 2 M. TDN 'werd op dezelfde manier voorbereid, behalve dat S1 werd vervangen door S1'. Om het Apt-TDN te synthetiseren, werd het Gint4.T-aptameer in een gelijke molaire verhouding aan TDN toegevoegd en het mengsel werd 60 min bij 37°C geïncubeerd. Voorafgaand aan de synthese werd het aptameer onderworpen aan een korte denaturatie-renaturatiestap (85 ° C gedurende 5 minuten, snelle afkoeling gedurende 2 minuten en vervolgens opwarmen tot 37 ° C gedurende 10 minuten) [25].

Agarosegelelektroforese

Een agarosegel (3%) werd gedurende 30 min bij 100 V in 0, 5 x TEB-buffer gelopen. De temperatuur van het elektroforese-apparaat werd op 0°C gehouden door het apparaat in een ijsbad te plaatsen. Vóór elektroforese werd GelRed aan de agarosegel toegevoegd om de DNA-strengen te kleuren. Toen het proces was voltooid, werd een Bio-Rad-fluorescentiescanner (Californië, VS) gebruikt om een afbeelding van de gel vast te leggen.

Dynamische lichtverstrooiing

Een Malvern Zetasizer ZS90 (Malvern, VK) werd gebruikt om de hydrodynamische grootte en zeta-potentiaal van de TDN te meten. In totaal werd 1 mL van het TDN (100 nM) onderworpen aan dynamische lichtverstrooiing (DLS)-analyse.

Atomic Force Microscopy Imaging

De TDN werd verdund tot 100 nM met TM-buffer (Tris-HCl-buffer met MgCl₂ ). Vervolgens werd 10 L van elk TDN-monster toegevoegd aan vers gespleten mica en gedurende 10 min geïncubeerd. De monsters werden vervolgens afgebeeld op een atomaire krachtmicroscopie (AFM) -instrument in AC-modus (Agilent 5500, VS).

Meting van de medicijnlaadcapaciteit van de voorbereide TDN

Doxorubicine werd opgelost in gedeïoniseerd water om een opslagoplossing van 500 M te maken. Doxorubicine werd in verschillende concentraties (1 tot 20 M) gemengd met TDN (100 nM) of Apt-TDN (100 nM) gedurende 6 u bij kamertemperatuur (24-26 °C). De gemengde oplossingen werden vervolgens gecentrifugeerd bij 12.000 x g gedurende 10 min om de met medicijnen geladen TDN te verkrijgen. Vervolgens werd 50 L van de supernatanten verwijderd en gemengd met PBS in een verhouding van 1:1. Een Varioskan LUX microplaatlezer (Californië, VS) werd gebruikt om de fluorescentie-intensiteit van doxorubicine te meten (λ _ex =480 nm en λ _em =590 nm) om de hoeveelheid doxorubicine in de supernatanten te bepalen [28]. De concentratie van doxorubicine geladen in het TDN werd berekend door de standaardcurve en fluorescentie-intensiteit. We hebben ook doxorubicine gemengd met het TDN bij toenemende molaire verhoudingen.

Serumstabiliteit van de TDN in vitro

Het TDN werd gemengd met compleet medium en gedurende 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 of 24 uur bij 37°C geïncubeerd. De TDN-oplossingen werden gemengd met FBS in een verhouding van 1:1 en gedurende 1, 3, 5 of 7 uur bij 37°C geïncubeerd. Na incubatie werden de mengsels op een 3% agarosegel gelopen.

Cytotoxiciteit van de TDN in vitro

Om de cytotoxiciteit van het TDN te bepalen, worden U87MG-cellen in een concentratie van 1 × 10⁴ cellen/putje werden uitgezaaid op een plaat met 96 putjes. Het celkweekmedium werd verwijderd en vers medium met 0-500 nM TDN werd toegevoegd en nog eens 24 uur en 48 uur na incubatie gedurende de nacht geïncubeerd. Vervolgens werd 10 L CCK-8-oplossing aan elk putje toegevoegd en het mengsel werd gedurende 1 uur geïncubeerd. De absorptie bij 450 nm werd vervolgens gemeten met een microplaatlezer.

Fluorescentiebeeldvorming

Cellulaire opname van DOX en TDN werd bestudeerd met fluorescentiemicroscopie (Olympus, Tokyo, Japan). U87MG-cellen werden gezaaid op dekglaasjes in platen met 24 putjes met medium dat 10% door warmte geïnactiveerd foetaal runderserum en 1% penicilline en streptomycine bevatte en gedurende ten minste 1 dag bij 37 ° C gekweekt in een bevochtigde atmosfeer met 5% CO₂ totdat de cellen ten minste 75% samenvloeiing bereikten. Na incubatie werden de kweekmedia verwijderd. Volledige media met 100 nM Cy3-TDN en Cy3-Apt-TDN werden toegevoegd en gedurende 3 h geïncubeerd. TDN en Apt-TDN werden gelabeld met Cy3 om de intercellulaire opname van nanodeeltjes te detecteren. Om de cellulaire opname van DOX te beoordelen, werden DOX (DOX 2 μM), DOX@TDN (DOX 2 μM) en DOX@Apt-TDN (DOX 2 μM) toegevoegd aan U87MG-cellen en gedurende 3 uur geïncubeerd. Na 3 uur behandeling werden de cellen gedurende 20 min in het donker gefixeerd met 4% paraformaldehyde en vervolgens gedurende 5 min gekleurd met 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI). De cellen werden drie keer gewassen met PBS en bekeken onder een fluorescentiemicroscoop.

Flowcytometrie

In totaal 1 × 10⁶ U87MG-cellen werden geïmplanteerd in platen met 6 putjes. Na incubatie gedurende de nacht werden de kweekmedia verwijderd en media aangevuld met 100 nM Cy3-TDN, 100 nM Cy3-Apt-TDN of 100 nM Cy3-Apt-TDN + 1 M vrij Apt werden toegevoegd en gedurende 3 u geïncubeerd. Vervolgens werden de cellen gedurende 20 min gefixeerd met 4% paraformaldehyde en werd flowcytometrie gebruikt om de percentages Cy-3-positieve cellen te analyseren.

Celcyclus en apoptose

Na behandeling met DOX, DOX@TDN of DOX@Apt-TDN gedurende 24 h, 5 × 10⁵ cellen werden verzameld en een nacht in 75% ijskoude ethanol gefixeerd. Vervolgens werden de cellen gedurende 30 minuten bij 37 ° C in het donker geïncubeerd met RNase en propidiumjodide. De celcyclus werd onderzocht met flowcytometrie. Bovendien werden de cellen na de verschillende behandelingen gekleurd met Annexin V-FITC/DAPI en werd vroege apoptose onderzocht.

CCK-8-assays

Om de levensvatbaarheid van cellen te bepalen, gebruiken U87MG-cellen (5 × 10³ ) werden uitgezaaid op platen met 96 putjes met 100 L medium en overnacht gekweekt bij 37 °C onder een atmosfeer die 5% CO₂ bevat. . Het medium werd vervolgens verwijderd en vers medium dat DOX, DOX-TDN of DOX-Apt-TDN bevatte, werd toegevoegd. Na 24 uur incubatie werd 10 μL CCK-8-oplossing toegevoegd en werden de cellen nog eens 1 uur gekweekt. Een microplaatlezer werd gebruikt om de absorptie bij 450 nm te meten.

Statistische analyse

Alle experimenten in deze studie werden in drievoud uitgevoerd en alle gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde waarde met de standaarddeviatie (gemiddelde ± SD). Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van het SPSS 24.0-programma (IBM, VS). Significante verschillen werden bepaald met behulp van Student's t test, met P <0,05 geeft significante verschillen tussen groepen aan.

Resultaten

Synthese en karakterisering van de TDN en Apt-TDN

Het TDN werd zelf samengesteld uit vier oligonucleotiden (tabel 1) via eenstapssynthese zoals eerder gerapporteerd [18, 29]. Het tumorgerichte aptamer Gint4.T werd gebruikt om TDN te wijzigen via Watson-Crick basenparing. De DNA-tetraëder bevat vier vlakken, waarbij elk vlak wordt gevormd door één oligonucleotide. Zo hybridiseerden vier oligonucleotiden met elkaar om een DNA-tetraëder te vormen (Fig. la). Gelelektroforese-analyse toonde een enkele prominente band in lanen 4 en 5, wat suggereert dat de TDN en Apt-TDN met succes waren geconstrueerd. De mobiliteit van de Apt-TDN was afgenomen in vergelijking met die van de TDN, wat suggereert dat de Gint4.T aptamer de TDN met succes heeft gewijzigd.

een Synthese van de DNA-tetraëder en Gint4.T-TDN. Baan 1:S1; baan 2:S1+S2; baan 3:S1+S2+S3; baan 4:S1+S2+S3+S4 (TDN); baan 5:TDN gemengd met Apt-tail (Gint4.T); Apt-TDN. Baan 1 was niet zichtbaar omdat nucleïnezuurkleurstoffen enkelstrengs DNA niet goed kunnen kleuren. b AFM-afbeeldingen toonden aan dat de hoogten van de TDN en Apt-TDN ~ 2 nm waren. c Bepaling van de deeltjesgrootte en zeta-potentiaal van de TDN en Apt-TDN door dynamische lichtverstrooiing (DLS). De gemiddelde deeltjesgrootte van de TDN en Apt-TDN waren respectievelijk 10,10 nm (A) en 13,54 nm (B). De gemiddelde zeta-potentialen van de TDN en Apt-TDN waren respectievelijk − 5,69 mV (C) en − 7,3 mV (D)

De maten van de TDN en Apt-TDN zijn bepaald door DLS en AFM. De TDN en Apt-TDN vertoonden deeltjesgrootten van respectievelijk 10,1 nm en 13,5 nm, wat de toevoeging van het Gint4.T-ligand weerspiegelt (Fig. 1c (A), (B)). Omdat de hydrodynamische diameter watermoleculen omvat, waren de deeltjes groter dan hun theoretische afmetingen. De hoogten van zowel de TDN als de Apt-TDN bepaald door AFM-afbeeldingen waren ~ 2 nm (figuur 1b), wat aangeeft dat aptamer-modificatie de 3D-structuur niet veranderde. De gemiddelde zeta-potentialen van de TDN en Apt-TDN waren respectievelijk − 5.69 mV (C) en − 7.3 mV (D) (Fig. 1c (C) (D)). Op basis van deze parameters concludeerden we dat de TDN en Apt-TDN met succes waren samengesteld.

Stabiliteit en cytotoxiciteit van de TDN in vitro

Gelelektroforese-analyse toonde aan dat het TDN intact bleef wanneer het 24 uur bij 37 ° C in volledig medium werd geïncubeerd (figuur 2a (A)). Bovendien, toen de concentratie van foetaal runderserum werd verhoogd tot 50%, bleef de TDN ten minste 7 uur stabiel (Fig. 2a (B)), wat consistent is met eerdere rapporten [18, 26]. Om de cytotoxiciteit van de nanostructuur te bepalen, werd de CCK-8-assay gebruikt om de cellevensvatbaarheid van U87MG-cellen te beoordelen na behandeling met het TDN in een aantal concentraties. Zoals getoond in Fig. 2b, werd er geen significante cytotoxiciteit waargenomen in U87MG-cellen behandeld met TDN bij 0-500 nM gedurende 24 h en 48 h. Daarom kunnen DNA-nanodeeltjes worden gebruikt als stabiele en bioveilige dragers voor medicijnafgifte.

een Gelelektroforese toonde aan dat het TDN 24 uur stabiel bleef in volledig medium bij 37°C (A); de TDN bleef 7 uur stabiel toen de concentratie van foetaal runderserum werd verhoogd tot 50% (B). b U87MG-cellen werden gedurende 24 uur en 48 uur samen met het TDN in verschillende concentraties (10-500 nM) gekweekt. De CCK-8-assay toonde aan dat de activiteit van de U87MG-cellen niet werd beïnvloed, wat de bioveiligheid van de TDN aangaf

Drug-laadcapaciteit van de TDN en Apt-TDN

Doxorubicine is een breedspectrum chemotherapeutisch medicijn dat kan intercaleren in dubbele DNA-strengen. We berekenden een standaard doxorubicine-curve (figuur 3a) en onderzochten vervolgens de intercalatie van doxorubicine in het TDN. De hoeveelheid geïntercaleerd doxorubicine in de TDN en Apt-TDN nam geleidelijk toe met toenemende doxorubicineconcentratie. Toen de doxorubicineconcentratie 14 M was, piekte de hoeveelheid doxorubicine die was geïntercaleerd in de TDN en Apt-TDN bij respectievelijk 5, 5 M en 6, 0 μM, en bereikte vervolgens een plateau (figuur 3b), wat aangeeft dat de DNA-strengen volledig bezet waren. Ondertussen hebben we doxorubicine gemengd met het TDN in toenemende molaire verhoudingen. Het fluorescentiespectrum van doxorubicine werd gescand voor analyse. Zoals getoond in Fig. 3c, werd het fluorescentiespectrum van doxorubicine gedoofd met doxorubicine in een molverhouding van 0,05. Op basis van deze bevindingen concludeerden we dat ongeveer 55 moleculen doxorubicine aanwezig waren in een enkele TDN, terwijl 60 moleculen aanwezig waren in een enkele Apt-TDN.

een Een standaardcurve van DOX-concentraties in PBS-buffer; λex =480 nm en λem =590 nm. De hoeveelheid DOX die wordt vervoerd door de TDN en Apt-TDN. b DOX intercaleerde in het dubbelstrengs DNA van de TDN en Apt-TDN. Toen de DOX-concentratie 14 M bereikte en de geïntercaleerde DOX-concentratie in de TDN en Apt-TDN een piek bereikte van respectievelijk 5,5 M en 6,0 μM, kon een enkele DNA-tetraëder 55 Dox-moleculen dragen, terwijl een enkele aptameer-gemodificeerde DNA-tetraëder 60 DOX droeg moleculen. c Fluorescentiespectra van DOX in het supernatant. Doxorubicine werd gemengd met het TDN in toenemende molaire verhoudingen (0, 0,0005, 0,001, 0,005, 0,01 en 0,05 van boven naar beneden). Toen de molaire verhouding 1:20 was, werd de fluorescentie gedoofd

Gerichte cellulaire opname van de Apt-TDN

DNA is een negatief geladen macromolecuul, wat het binnendringen in het negatief geladen celmembraan bemoeilijkt. Doorgaans moeten individuele DNA-moleculen toegang krijgen tot cellen met behulp van een transfectiereagens. Hier hebben we TDN en Apt-TDN met Cy3 gelabeld om de intracellulaire opname van de nanodeeltjes te volgen. Na incubatie met U87MG-cellen gedurende 3 h, verscheen een rood Cy3-fluorescentiesignaal in het cellulaire cytoplasma, wat aangeeft dat het TDN het cytomembraan bond en in de cel werd opgenomen zonder de hulp van transfectiemiddelen (Fig. 4a). Het Apt-TDN vertoonde een hogere rode fluorescentie, wat suggereert dat de aanwezigheid van het Gint4.T-aptameer de opname van DNA-tetraëder door U87MG-cellen significant verhoogde. Toen echter vrij aptameer werd toegevoegd, nam de Cy3-fluorescentie af tot het niveau dat alleen voor de TDN werd waargenomen. Als gevolg van competitieve remming door het vrije aptameer, concluderen we dat het aptameer op het TDN de opname van het TDN niet kon vergemakkelijken. Op basis van deze competitieve remming hebben we bewezen dat de Apt-TDN zich kan richten op U87MG-cellen. Flowcytometrie bewees verder dat het percentage Cy3-positieve U87MG-cellen hoger was in de Apt-TDN-groep dan in de TDN-groep. Free Apt verlaagde het percentage Cy3-positieve U87MG-cellen in de Apt-TDN-groep (Fig. 4b).

een U87MG-celopname van de TDN en Apt-TDN (TDN-Gint4.T). Het TDN ging rechtstreeks de U87MG-cellen binnen zonder transfectiemiddelen, en de opname van Apt-TDN (gekoppeld aan het aptamer Gint4.T) was significant verhoogd en competitief geremd door vrij Apt (Gint4.T), wat aangeeft dat het aptamer Gint4.T een belangrijke rol speelt. belangrijke rol bij cellulaire targeting. De schaalbalk vertegenwoordigt 50 m. b Flowcytometriecurves tonen de intracellulaire opname van de TDN, Apt-TDN en Apt-TDN+Apt na incubatie gedurende 3 h

Mobiele opname van DOX@TDN en DOX@Apt-TDN

We gebruikten het karakteristieke fluorescentiespectrum van doxorubicine om de efficiëntie van de geneesmiddelopname te beoordelen. Na 3 uur behandeling werd intracellulair doxorubicine afgebeeld met fluorescentiemicroscopie (figuur 5a). Vrij doxorubicine kon U87MG-cellen binnendringen en bevond zich in de kern. Met de toevoeging van DOX@TDN was de fluorescentie hoger dan die van vrij doxorubicine. Dit resultaat suggereerde dat DNA-nanodeeltjes de cellulaire opname van doxorubicine verbeterden. Toen DOX@Apt-TDN werd toegevoegd, was het rode signaal in de kern zelfs hoger dan dat van cellen waaraan DOX@TDN was toegevoegd. Semi-kwantitatieve analyse van de intracellulaire opname van DOX bevestigde verder dat de Apt-TDN een meer dan tweevoudige toename van de intracellulaire DOX-opname mogelijk maakte in vergelijking met die voor het enkele medicijn. We concluderen dat dit te wijten is aan Gin4.T-specifieke binding aan receptoren, waarna meer nanodeeltjes de cel kunnen binnendringen. Na vertering in lysosomen kan doxorubicine worden afgegeven aan het cytoplasma en verder functioneren in de kern.

een Cellulaire opname van DOX, de DOX@TDN en de DOX@Apt-TDN. Gemodificeerd met de aptamer Gint4.T, zou de Apt-TDN meer doxorubicine aan U87MG-cellen kunnen leveren dan de TDN. Bovendien zou het TDN meer medicijn naar de cellen kunnen vervoeren dan het medicijn alleen. De schaalbalken geven 50 m aan. b Semi-kwantitatieve analyse van de fluorescentie-intensiteit van doxorubicine met PBS-, DOX-, DOX@TDN- en DOX@Apt-TDN-behandeling (vergeleken met blanco:*p <0,05, **p <0,01)

Cytotoxiciteit van DOX, de DOX@TDN en de DOX@Apt-TDN

Voor de cytotoxiciteitsstudie werden drie groepen U87MG-cellen behandeld met verschillende concentraties doxorubicine (figuur 6a). De IC₅₀ waarden voor doxorubicine waren 13,39 M voor DOX-behandeling, 7,826 M voor DOX@TDN-behandeling en 4,205 M voor DOX@Apt-TDN-behandeling. Van de drie behandelingen vertoonde de DOX@Apt-TDN de hoogste cytotoxiciteit bij 24 h, wat de specificiteit van de Apt-TDN voor U87MG-cellen aangaf. Na 24 uur werden cellen in de DOX-, DOX@TDN- en DOX@Apt-TDN-groepen verzameld en gebruikt om vroege apoptose te onderzoeken. Onze gegevens toonden aan dat de vroege apoptose-snelheid hoger was in de DOX@Apt-TDN-groep dan in de andere twee groepen (Fig. 6b). Bovendien was het aandeel cellen in de G0/G1-fase verhoogd in de DOX-Apt-TDN-groep vergeleken met de DOX- en DOX-TDN-groepen (p <0,01) en de verhouding van cellen in de S-fase was verlaagd in de DOX-Apt-TDN-groep (p <0,01) (Fig. 6c). Het percentage cellen in de G2-fase is niet gewijzigd (gegevens niet getoond).

een Cytotoxiciteit van DOX, de DOX@TDN en de DOX@Apt-TDN bij verschillende concentraties. De remmingssnelheid van de U87MG-cellen was significant verhoogd met toenemende DOX-concentratie, maar de DOX@TDN- en DOX@Apt-TDN-groepen vertoonden significant verhoogde cytotoxiciteit in vergelijking met de DOX-groep. De celremmingssnelheid van de DOX@Apt-TDN-groep was ook significant hoger dan die van de DOX@TDN-groep (vergeleken met DOX, **p < 0,05; vergeleken met DOX, ***p <0,01; vergeleken met DOX@Apt-TDN, ^# p <0,05). b Apoptose van U87MG-cellen na incubatie met PBS, DOX, de DOX@TDN en de DOX@Apt-TDN gedurende 24 h. c Flowcytometriehistogrammen van de U87MG-celcyclus na incubatie met PBS, DOX, de DOX@TDN en de DOX@Apt-TDN gedurende 24 h (vergeleken met controle, **p < 0,05; vergeleken met controle, ***p <0,01; vergeleken met DOX@Apt-TDN, ^# p <0,01)

Discussie

Of het nu via in vitro of in vivo experimenten is, de stabiliteit van een geneesmiddel en zijn drager moet worden bepaald. Na assemblage van het TDN werd de stabiliteit eerst in vitro bepaald. Deze studie toonde aan dat de 3D-structuur van DNA-nanodeeltjes hun stabiliteit in serum kan verbeteren door enzymbinding te remmen. De biologische veiligheid van de betreffende nanostructuur is de belangrijkste voorwaarde voor de toepassing ervan. Er werd geen significante cytotoxiciteit waargenomen in U87MG-cellen die gedurende 24 uur of 48 uur samen waren gekweekt met verschillende concentraties van het TDN. Geen van de DNA-sequenties die in dit onderzoek zijn gebruikt, codeert voor genetische informatie en er werden geen bijwerkingen gemeld in de cytotoxiciteitstest. Daarom kan de TDN dienen als een veilige en stabiele medicijndrager.

De doelgerichtheidsefficiëntie van een door aptamer gemodificeerde nanostructuur is cruciaal voor selectieve medicijnafgifte aan kankercellen. In tegenstelling tot antilichamen zijn aptameren chemisch stabiel, goedkoop en kunnen ze in massa worden geproduceerd. Bovendien kunnen aptameren, in tegenstelling tot andere materialen, gemakkelijk een DNA-tetraëder binden met behulp van het principe van complementaire basen. De combinatie van aptameren en DNA-tetraëders legt dus de basis voor gerichte medicijnafgifte en behandelingen van de volgende generatie. Onze resultaten toonden aan dat de TDN cellen kon binnendringen zonder transfectiemiddelen, wat vergelijkbaar is met de resultaten van Walsh et al. en Ma et al. [15, 19]. Vergeleken met die van de TDN was de opname van de Apt-TDN door U87MG-cellen significant verhoogd. Na toevoeging van vrij aptamer verdween deze toename. Dit resultaat suggereert dat Gint4.T een PDGFRa-specifieke antagonist is [25]. Onze studie toonde aan dat het Gint4.T-aptameer zich zou kunnen richten op U87MG-cellen vanwege de hoge expressie van PDGGRβ op het oppervlak van glioomcellen. Camorani et al. [24] toonde ook aan dat het Gint4.T-aptameer zich op tumorcellen kan richten door specifiek te interageren met het extracellulaire domein van PDGFRa. De voordelen van Gint4.T aptamer targeting zijn tot op zekere hoogte aangetoond via in vitro studies, maar verdere in vivo testen zijn nodig om deze bevindingen te bevestigen. Deze studie bevestigde ook dat de DOX@Apt-TDN meer cytotoxisch is dan DOX of de DOX@TDN, wat waarschijnlijk door twee factoren wordt veroorzaakt. Ten eerste kan het Gint4.T-aptameer specifiek binden aan extracellulaire domeinen van PDGFR, waardoor tumorcelproliferatie wordt geblokkeerd en tumorcelgroei wordt geremd [24]. Dit komt overeen met onze experimentele resultaten. In vergelijking met de controlegroep nam de verandering van de U87MG-celcyclus na behandeling met DOX, DOX@TDN en DOX@Apt-TDN significant toe in de tumorcellen in de G0/G1-fase, nam af in de cellen in de S-fase en blokkeerde tumorcellen op G0 /G1-fase, wat aangeeft dat ze de celcyclus van U87MG-cellen kunnen remmen en hun proliferatie kunnen remmen. Vergeleken met de DOX- en DOX@TDN-groepen had de DOX@Apt-TDN-groep een significant sterker vermogen om de proliferatie van U87MG-cellen te remmen. Bovendien bindt Gint4.T specifiek aan tumorcellen en verbetert het de celtargeting van het DOX@Apt-TDN-complex. Zo kunnen we de efficiëntie van de medicijntargeting verhogen en de systemische toedieningsdosis van antitumormiddelen verlagen om hun systemische bijwerkingen te voorkomen.

Conclusies

Modificatie met Gint4.T verhoogde de specificiteit en efficiëntie van TDN bij glioombehandeling door zich te richten op de PDGFRa die in grote hoeveelheden tot expressie wordt gebracht op glioomcellen. Bovendien kan het, wanneer het wordt geladen met Apt-TDN, de anti-glioma-effecten van DOX aanzienlijk bevorderen. Daarom kan DOX@Apt-TDN dienen als een veelbelovende therapeutische strategie tegen glioom voor patiënten. De tekortkoming van dit onderzoek is dat het alleen in vitro is geverifieerd. In de latere studie zullen we dit verder onderzoeken in diermodellen.

Beschikbaarheid van gegevens en materialen

De relevante gegevens zijn opgenomen in het artikel.

Afkortingen

BBB:: Bloed-hersenbarrière
BTB:: Bloedtumorbarrière
TDN:: Tetraëdrische DNA-nanostructuren/DNA-tetraëders
DOX:: Doxorubicine
PDGFRβ:: Van bloedplaatjes afgeleide groeifactorreceptor β
Apt-TDN:: Gint4.T-gemodificeerde TDN
DOX@ TDN:: TDN geladen met DOX
DOX@Apt-TDN:: Gint4.T-gemodificeerde TDN geladen met DOX
CNS:: Centraal zenuwstelsel
ANG:: Angiopep-2
LRP-1:: Low-density lipoproteïne-receptor-gerelateerd eiwit 1
SELEX:: Exponential enrichment
PNPs:: Polymeric nanoparticles
GBM:: Glioblastoma
FBS:: Foetal bovine serum
DMEM:: Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium
DLS:: Dynamische lichtverstrooiing
AFM:: Atoomkrachtmicroscopie
CCK-8:: Cell Counting Kit-8
Cy3:: Sulfo-Cyanine3
DAPI:: 4′,6-Diamidino-2-phenylindole

De structureel-afhankelijke fotokatalytische antibacteriële activiteit begrijpen:een case study van Ag-gemodificeerde BiVO4 Theoretisch en experimenteel onderzoek naar AlGaN/GaN Schottky-barrièrediode op Si-substraat met dubbele heterojunctie

Nanomaterialen

Metaal

Hars

vezel

Samengesteld materiaal