Nieuwe chemo-fotothermische therapie bij borstkanker met behulp van methotrexaat geladen foliumzuur geconjugeerde Au@SiO2 nanodeeltjes

Abstract

Lasertherapie op laag niveau (LLLT) staat bekend als een veilige vorm van fototherapie om tumorweefsel/-cellen aan te pakken. Bovendien vergroot het gebruik van gerichte nanodeeltjes het succes van kankertherapie. Deze studie was bedoeld om het gecombineerde effect van met folaat (FA)/Methotrexaat (MTX) beladen, met silica gecoat goud (Au@SiO₂) te onderzoeken. ) nanodeeltjes (NP's) en LLLT over de strijd tegen borstkanker.

NP's werden gesynthetiseerd en gekarakteriseerd met behulp van FTIR, TEM en DLS-Zeta. De NP's hadden een bolvormige morfologie met een gemiddelde diameter van ongeveer 25 nm en een positieve lading (+13,3 mV), terwijl hun nettolading na conjugatie met FA en MTX was verminderd tot ongeveer -19,7 mV.

Onze bevindingen in celopnamestudies toonden duidelijk een verhoogde cellulaire opname van NP's na met FA en MTX geladen NP's in beide borstkankercellijnen, vooral op MDA-MB-231 vanwege de hoge expressie van folaatreceptoren. De resultaten gaven aan dat LLLT een proliferatief effect had op beide borstkankercellijnen, maar in de aanwezigheid van gemanipuleerde op borstkanker gerichte nanodeeltjes, was de werkzaamheid van chemo-fotothermische combinatietherapie significant verhoogd met behulp van MTT-assay (p<0,05), DAPI-kleuring en bevindingen van de celcyclus. Het hoogste apoptotische effect op borstkankercellijnen werd waargenomen in de cellen die waren blootgesteld aan een combinatie van met MTX-FA geladen Au@SiO₂ NP en LLLT bewezen door DAPI-kleuring en celcyclus (door de celarrestatie in subG0/G1) te verhogen. Samen genomen verbetert een combinatie van chemotherapie en LLLT het potentieel van borstkankertherapie met minimale bijwerkingen.

Inleiding

Borstkanker (BC), als de meest voorkomende vorm van kanker bij vrouwen, is recentelijk gerapporteerd met 1,7 miljoen nieuwe gevallen wereldwijd [1]. Vanwege de gecompliceerde etiologie en de slechte respons op de behandeling, algemeen bekend als de centrale oorzaak van kankergerelateerde sterfgevallen bij vrouwen [2,3,4,5]. Het was voorspelbaar dat ongeveer 40.000 vrouwen in de VS in 2014 zouden overlijden aan BC [2, 6, 7] "(www.cancer.org)". Met in totaal 522.000 sterfgevallen is het de vijfde doodsoorzaak door kanker met ongeveer 800.000 gevallen in minder ontwikkelde en ongeveer dezelfde frequentie in ontwikkelde regio's [1]. In Aziatische landen ligt de grootste beginleeftijd bij volwassenen van 40 of 50 jaar in vergelijking met de westerse landen, die vaak voorkomt bij 60-70 jaar [8]. De belangrijkste risicofactoren voor BC zijn vrouwelijk geslacht, familiegeschiedenis, leeftijd en verschillende generatieve neigingen, zoals eerste bevalling op de leeftijd van meer dan 30 jaar, vroege menarche en latere menopauze, en nullipariteit [9].

Het belangrijkste doel in de strijd tegen kanker is het ontwikkelen van effectieve therapeutische plannen met lage toxiciteiten en hoge specificiteiten om tumoren, voornamelijk hun metastasen, te elimineren en om herhaling te voorkomen. Maar de momenteel gebruikte benaderingen voor kankerbehandeling, zoals chirurgie, chemotherapie en radiotherapie, vertoonden verschillende bijwerkingen [10,11,12] en slagen er allemaal niet in om dit doel te bereiken [13, 14]

De afgelopen decennia zijn er grote problemen waargenomen bij de behandeling van kanker [15, 16]. Tussen de huidige populaire therapeutische benaderingen is thermische therapie uitgegroeid tot een prospectieve behandelmethode [17]. Onlangs heeft fotothermische therapie (PTT), als een potentieel effectieve en niet-invasieve kankertherapie, veel aandacht getrokken [18, 19]. PTT op basis van foto-absorberende nanostructuren is een andere manier geworden dan de algemene methoden [20, 21]. In een typische PTT, die PTT-middelen gebruiken om de tumor te vernietigen door voldoende hyperthermie (42 °C) te krijgen onder laserbestraling (nabij-infrarood (NIR) licht in het bereik van 700-1100 nm), is bestudeerd als een zeer nauwkeurige en verwaarloosbaar invasieve methode van kankerbehandeling [22,23,24,25,26,27,28].

Een aantal nanodeeltjes is uitgebreid bestudeerd als contrastmiddelen voor beeldvorming, drager van medicijnafgifte en transformator van energiemodaliteiten zoals laser, radiogolven en ultrageluid, tot thermische verschijnselen die verantwoordelijk zijn voor therapeutische effecten [29,30,31,32,33 ,34,35,36,37,38,39].

Gouden nanodeeltjes hebben het afgelopen decennium veel aandacht getrokken vanwege hun hoge gelokaliseerde oppervlakteplasmonresonantie (LSPR) en gemakkelijke oppervlakteconjugatie met biomoleculen [40]. Ze hebben een krachtige fotothermische conversiecapaciteit onthuld in het NIR-gebied [41,42,43] zonder schadelijke bijwerkingen in biologische systemen [44].

Hoewel gouden nanodeeltjes zijn erkend als een veelbelovende fotosynthesizer, maar vanwege hun slechte fotothermische stabiliteit bij herhaalde NIR-bestraling, verliezen gouden nanodeeltjes geleidelijk hun fotothermisch omzettend vermogen dat hun gebruik in de klinische praktijk beperkte. Bovendien zijn gouden nanodeeltjes ook geen goede medicijndragers vanwege hun slechte laadcapaciteit voor medicijnen en het profiel van gecontroleerde medicijnafgifte [45, 46]. Als alternatief was bekend dat mesoporeuze silica-nanodeeltjes (MSN) een geschikte medicijn-, DNA- en eiwitdrager waren vanwege het hogere medicijnbeladingsvermogen en het ontbreken van toxische inhoud die voortkwam uit de afbraak ervan. Ze hebben ook een groot oppervlak, een regelbare grootte, een zeer goed beschikbaar porievolume en de gewenste oppervlaktekenmerken zijn van toepassing op een wijziging [47].

Nanodeeltjes kunnen na conjugatie aan een chemotherapeutisch middel en een kankergerichte ligand de nadelen van routinematige chemotherapie remmen, zoals niet-specifieke afgifte, slechte oplosbaarheid in water en lage therapeutische indexen [48, 49].

Middelen die chemotherapeutische eigenschappen vertonen, zoals doxorubicine, cyclofosfamide, methotrexaat, fluorouracil en docetaxel, worden alleen of in combinatie gebruikt als de belangrijkste kernbehandelingen, of worden ondersteund met andere behandelingen zoals PTT. De meeste kankerpatiënten ondervinden nadelige effecten van chemotherapiemedicijnen vanwege hun niet-nauwkeurige verdeling in het lichaam van de patiënt die alle organen aantast. Deze medicijnen beschadigen sommige van de snelgroeiende normale cellen, bijvoorbeeld bloedcellen, slijmvliescellen die de interne organen bedekken en haarzakjes [50,51,52,53].

Methotrexaat (MTX) is het meest gebruikte medicijn voor reumatoïde artritis en verschillende soorten tumoren zoals huid, long, hoofd en nek en borst [54, 55]. Het remt dihydrofolaatreductase (DHFR), het enzym dat bijdraagt aan de productie van tetrahydrofolaat en zijn bijproducten die nodig zijn voor de synthese van thymidylaat en purine en beide zijn essentieel voor celgroei en celproliferatie. Daarom voorkomt het blokkeren van DHFR-methotrexaat de synthese van 4 basismacromoleculen DNA, RNA, thymidylaten en eiwitten [56].

Helaas, net als bij de meeste conventionele PTT-middelen, is de belangrijkste uitdaging het bereiken van selectieve accumulatie van BNP's in het doelweefsel na systemische injectie [57,58,59]. Gerichte kankertherapie maakt de afgifte van chemotherapeutische medicijnen aan specifieke kankercellen mogelijk, terwijl de blootstelling van normale gezonde cellen wordt verminderd. Dit bracht ons ertoe een grotere dosering van het geneesmiddel aan kankercellen te leveren met een lagere systemische toxiciteit. Op ligand gerichte nanodeeltjes zijn nauwkeurig geïdentificeerde markers van kankercellen, die sterk tot expressie worden gebracht op het kankerceloppervlak [40].

Foliumzuur (folaat of vitamine B9) is een belangrijk materiaal voor celgroei en metabolisme. Vanwege de grote affiniteit van foliumzuur voor de folaatreceptoreiwitten, wordt het gebruikt als een element voor kankertargeting. Foliumzuurreceptor, als een tumorbiomarker, wordt tot overexpressie gebracht in bepaalde kwaadaardige cellen zoals borst-, eierstok-, long-, nier-, hersen- en darmkanker [60]. Met foliumzuur geconjugeerde geneesmiddelafgiftesystemen verbeteren de cellulaire opname van geneesmiddel via endocytose [61].

Materialen en methode

Reagentia en materialen

We gebruikten dubbel gedestilleerd water (Ghazi Company, Tabriz, Iran) en chemische reagentia van analytische kwaliteit voor onze experimenten. Een aantal reagentia werd gekocht bij Sigma-Aldrich Company, waaronder:tetraethylorthosilicaat (TEOS, 98%), (3-mercaptopropyl) trimethoxysilaan (MPTES, 95% zuiverheid), foliumzuur en rhodamine B. Een groep materialen werd gekocht bij Merck Co:Zoutzuur (HCl, 37%), Ammoniakoplossing (25%), tolueen Natriumhydroxide (NaOH, 98%) en andere oplosmiddelen. MTX is gekocht van Zahravi Farma Company, Tabriz, Iran.

Instrumentatie

In deze studie werd voor het analyseren van de deeltjesgrootte en morfologie transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) (LEO 906, Duitsland) gebruikt. We hebben ongeveer 100 μL van onze nanodeeltjes gesuspendeerd in een waterige oplossing bij kamertemperatuur bereid. De oplossing werd overgebracht op een koolstoffilm gecoat op een koperen rooster van TEM met daaropvolgend vriesdrogen en waargenomen bij 80 KV. Bepaling van de deeltjesgrootte werd uitgevoerd door DLS-meting (dynamische lichtverstrooiing) bij 25 ° C met behulp van een Zetasizer Nano ZS90, Malvern Instruments, Malvern, VK. De Zeta-potentiaalmetingen voor de voorbereide NP's werden uitgevoerd door fotoncorrelatiespectroscopie (Zetasizer-ZS, Malvern Instrument, VK). Een UV-Vis-spectrofotometer met dubbele bundel (UV-1601 PC-model SHIMADZU, Kyoto, Japan) werd gebruikt voor het meten van de absorptie door een kwartscuvet van 700 L met een padlengte van 10 mm. Fourier transformeert infrarood (FTIR) spectroscopie van Bruker Tensor 27 spectrometer, Duitsland werd gebruikt voor het uitvoeren van de KBr-pelletmethode. De pH-metingen zijn gedaan met een Metrohm 713 pH-meter (Herisau, Zwitserland). Voor het roeren werd de mechanische roerder Heidolph RZR 2102 Control Overhead Stirrer (Schwabach, Duitsland) gebruikt. De inkapselingsefficiëntie van FA en MTX werd berekend met behulp van het HPLC-systeem dat bestond uit Waters 2690-scheidingsmodule uitgerust met een UV-vis-detector Waters 2500 Pump 1000-detectoren (Waters, Milford, MA). De chromatografische scheiding werd uitgevoerd bij omgevingstemperatuur met behulp van een C18 m Bondapak (250 mm 4,6 mm, 10 mm, 125 A Waters, Ierland) chromatografiekolommen.

Voorbereiding van Au@SiO₂ Nanodeeltjes

De SiO₂ NP's werden gesynthetiseerd op basis van de eerder gerapporteerde sol-gel-methode [62, 63]. In de volgende stap werden thiol-gefunctionaliseerde silica-gecoate nanodeeltjes (TFSNP's) bereid volgens de methode genoemd in onze vorige studie [64]. De Au-nanodeeltjes werden geproduceerd door een citraatreductiemethode (Turkevich-methode) [65]. Ten slotte werd het oppervlak van TFSNP's bedekt door AuNP's. Aanvankelijk werden TFSNP's gedurende ten minste een uur in water gedispergeerd met behulp van de badsonicator en toegevoegd aan de AuNP's-oplossing en nog 30 minuten gesoniceerd. De reactie werd uitgevoerd onder donkere omstandigheden gedurende twee dagen onder dynamisch roeren bij 25°C. De Au@SiO₂ nanodeeltjes met een paars gekleurd uiterlijk werden verzameld door centrifugatie (10000 rpm, 10 min) en gedroogd in een vacuümoven.

MTX en FA laden

Zowel MTX als FA werden in de Au@SiO₂ . geladen nanodrager als volgt:MTX (10 mg) werd toegevoegd aan een 10 ml goed gedispergeerde suspensie van nanodrager in PBS (5 mg/ml, pH 7,4) en matig geroerd bij kamertemperatuur gedurende één dag in donkere omstandigheden. De MTX laadde Au@SiO₂ nanodrager werd verzameld door middel van centrifugatie. Het supernatant werd verzameld voor de meting van onbeladen MTX. Vervolgens laadde MTX Au@SiO₂ nanodrager werd gedispergeerd in PBS (5 mg/ml, pH 7,4) en FA (10 mg) werd aan de oplossing toegevoegd en nog een dag onder donkere omstandigheden matig bij kamertemperatuur geroerd. De FA-MTX laadde Au@SiO₂ nanocarrier werd verzameld door centrifugatie en het supernatant werd gescheiden voor de berekening van ongebonden FA in de laatste stap. De FA-MTX laadde Au@SiO₂ nanocarrier werd gevriesdroogd en bewaard voor volgende experimenten. De hoeveelheden ongebonden MTX en FA werden berekend met behulp van de HPLC-methode volgens het eerder gerapporteerde protocol [66]. Foliumzuur werd opgelost in ammoniumhydroxide (10 gew.%) en verdund met de mobiele fase. De retentietijd voor MTX en foliumzuur was respectievelijk 10,5 en 5,95 min. Er werden monsters in drievoud aangebracht. De efficiëntie van het laden van geneesmiddelen (DLE) werd berekend met de volgende formules:

$$ ee\left(\%\right)=\frac{\left( initial\ total\ drugs- Unabsorbed\ drugs\right)}{Initial\ total\ drugs}\times 100 $$ (1)

Selectie en cultuur van cellijnen

Twee interessante borstkankercellijnen met gerapporteerde oppervlakte-expressieniveaus folaatreceptor (FR) [67] waaronder MCF-7 en MDA-MB-231 werden geselecteerd en gekocht bij de Pasteur Cell Bank (Teheran, Iran) voor het cytotoxiciteitsonderzoek. De geselecteerde cellijnen werden gekweekt in compleet medium dat RPMI1640 (thermoswetenschappelijk), 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penstrep (thermoswetenschappelijk) bevat in thermische en atmosferische omstandigheden van 37°C, 5% CO₂ sub> , en 95% luchtvochtigheid.

Celcytotoxiciteitstest

Cellevensvatbaarheidstesten werden uitgevoerd voor het meten van celproliferatie na verschillende NP's-behandelingen zonder laserbestraling. In het kort:de MCF-7- of MDA-MB-231-cellen werden uitgeplaat in 96 microplaten met een celdichtheid van 1,5 × 10⁴ gedurende 24 uur, daarna werden de cellen behandeld met MTX, Au@SiO₂ en FA-MTX geladen Au@SiO₂ NP's. De cellen zonder behandeling werden als controle beschouwd. Bij de volgende stap werd de tetrazoliumkleurstof MTT (Sigma) in eindconcentraties van 5 g/ml aan de cellen toegevoegd en 4 uur bij 37°C geïncubeerd. Vervolgens werd de MTT-oplossing verwijderd en werden de bezonken Furmazan-kristallen opgelost in dimethylsulfoxide (DMSO) (BioIdea, Iran) onder zacht schudden gedurende 10 minuten. Ten slotte werd de absorptie gemeten in 570 nm door een ELISA-lezer. De levensvatbaarheid van cellen werd genormaliseerd om cellen te controleren en de achtergrond werd verwijderd door blanco metingen af te trekken.

In vitro lasertherapie

Voor Low Level Laser Therapy (LLLT) werd een NIR-laser met een golflengte van 810 nm (diodelaser Mustang 2000, Rusland) met een uitgangsvermogensdosis van 185 mW gebruikt voor de vernietiging van kankercellen. In eerste instantie MCF-7 en MDA-MB 231-cellen met een celdichtheid van 1,5×10⁴ behandeld met de Au@SiO₂ en FA-MTX geladen Au@SiO₂ NP's werden vervolgens blootgesteld aan laserbestraling met verschillende laserdoses (30, 60, 75, 90 en 105 J/cm² ) en vaste belichtingstijd (139 sec). De cellen blootgesteld aan alleen laserbestraling (zonder NP's) en de cellen zonder NP's en laserbehandelingen worden respectievelijk als positieve en negatieve controle beschouwd. Na 24 uur laserbestraling werd de levensvatbaarheid van de cellen gemeten met de MTT-assaymethode [64].

Nanodeeltjes cellulaire opname-assay

Een gedetailleerde controle van de internalisatie van de NPs-cel is essentieel om het specifieke effect van oppervlaktegemodificeerde nanocarrier voor elke cellijn te bevestigen. In het huidige werk hebben we zowel flowcytometrie als kwantitatieve en fluorescentiemicroscopie gebruikt voor het kwalitatief controleren van de opname van NP's door MCF-7- en MDA-MB-231-cellijnen.

Voor suspensie van NP's werd de rhodamine B (RhoD) -oplossing in PBS toegevoegd samen met 24 uur roeren bij omgevingstemperatuur en donkere kamer (verhindering van bleken). Vervolgens werden met RhoD geladen NP's gescheiden door Amicon-filter met een nominale molecuulgewichtslimiet (NMWL) van 30 kDa en 15 minuten bij 5000 rpm gecentrifugeerd en gewassen met PBS-buffer om de onbegrensde RhoD te elimineren. De cellen werden uitgezaaid in platen met een dichtheid van 5×10⁵ per putje en laat samenvloeien. De cellen werden behandeld met Rhodamine B-geladen NP's gedurende 30, 90 en 180 minuten, niet-behandelde cellen werden als controle gebruikt. Daarna werden de cellen getrypsiniseerd en gewassen met PBS, en vervolgens werd de fluorescentie gekwantificeerd met flowcytometrische analyse (BD Biosciences FCASCalibur flowcytometer; BD Biosciences, San Jose, CA, VS). De intracellulaire opname van rhodamine B-gelabelde NP of NPD werd verder bevestigd door fluorescentiemicroscopie. MCF-7- en MDA-MB-231-cellen werden gekweekt op dekglaasjes en na 24 uur werden de cellen behandeld met vrij Au@SiO₂ NP's en MTX-FA geladen Au@SiO₂ NP's. Na incubatie gedurende 30, 90 en 180 minuten werden de cellen gewassen met PBS en met rhodamine B gelabelde nanocarrier-opnames werden waargenomen met behulp van een fluorescentiemicroscoop (Olympus-microscoop Bh2-FCA, Japan).

Apoptose-onderzoek door fluorescentiemicroscopie

Een methode voor de nucleaire kwalitatieve studie van apoptose is een fluorescerende kleurstof DAPI die bindt aan DNA en detecteerbaar is met een geschikte microscopische microscoop. We gebruikten een protocol zoals eerder gerapporteerd voor DAPI-kleuring [68], kortweg:de MCF-7- of MDA-MB-231-cellen werden uitgeplaat in vaten met 6 putjes met een dichtheid van 5 × 10⁵ en laat ze 24 uur hechten en groeien. Na behandeling met MTX, Au@SiO₂ NP's en MTX-FA geladen Au@SiO₂ NP's met en zonder laserbehandeling werden de cellen gewassen met PBS (Sigma) en vervolgens onderworpen aan fixatie met 10% formaldehyde (Merck), vervolgens werden cellen gedurende 15 minuten permeabel gemaakt met Triton X-100 (Sigma). Na de juiste wassingen werden de cellen 5 minuten gekleurd met DAPI (sigma). Ten slotte werden de apoptotische kernen (gefragmenteerd of gerimpeld) gevisualiseerd door een fluorescentiemicroscoop (Olympus). De cellen zonder enige behandeling werden als negatieve controle beschouwd en de cellen ontvingen alleen laserbestraling als positieve controle.

Onderzoek naar celcyclusverstoringen

De MCF-7- en MDA-MB-231-celcyclusverdelingen werden bepaald door middel van flowcytometrie-analyse. Op deze manier werden de cellen gezaaid met startpopulaties van 5 × 10⁵ en toegestaan om 80% samenvloeiing te bereiken. Vervolgens werden de cellen behandeld met MTX, Au@SiO₂ NP's en MTX-FA geladen Au@SiO₂ NP's met en zonder laserbestraling werden uitgevoerd. De cellen zonder enige behandeling werden als negatieve controle beschouwd en de cellen ontvingen alleen laserbestraling als positieve controle. Vervolgens werden de cellen geoogst door trypsinisatie, gevolgd door de juiste wassingen met PBS. Vervolgens werden de cellen 48 uur gefixeerd door Ethanol (Merck). Bij de volgende stap werden de gefixeerde cellen gewassen en vervolgens behandeld met Ribonuclease A (Cinaclone), met daaropvolgende toevoeging van propidiumjodide (PI) (Sigma) in het donker. De fluorescentiesignalen werden gedetecteerd door FACS-set van Beckton Dicinson Company.

Statistieken van het onderzoek

De experimenten voor elke stap zijn uitgevoerd in drie herhalingen en de resultaten werden gerapporteerd als gemiddelde ± SD. De ANOVA werd gebruikt om de significantie tussen groepen te vergelijken. De verschillen waren gereflecteerde significanties waarbij de waarschijnlijkheidswaarde <0,05 werd berekend door SPSS-software.

Resultaten en discussie

Karakterisering van gesynthetiseerde NP's

De Au@SiO₂ NP's werden geproduceerd in vier stappen:1-synthese van SiO₂ nanodeeltjes, 2-toevoeging van thiolbevattende linker aan SiO2-NP's, 3-synthese van gouden nanodeeltjes en 4-bevestiging van de gouden nanodeeltjes aan het oppervlak van SiO2-linkercomplexen (Fig. 1). De succesvolle synthese van Au@SiO₂ werd bevestigd door FTIR (Fig. 2a). De Si-O-Si-piek verscheen rond 1088 cm^-1 . Een brede piek van 3000–3700 en 803 cm^–1 wordt toegeschreven aan respectievelijk het uitrekken en buigen van vrije silanol O-H-groepen. De alifatische C–H-rektrilling werd getoond als een sterke piek bij 2950 cm^–1 . De C–O van drie methoxysilaangroepen werd aangetoond door een piek van 1191 cm^–1 .

Het stapsgewijze synthetische schema voor de bereiding van met foliumzuur en methotrexaat geladen biocompatibel Au@SiO₂ NP's nanodeeltjes

een ) FTIR-spectra van Au@SiO₂ nanodeeltjes, b ) grootteverdeling van FA-MTX geconjugeerd Au@SiO₂ NP's gemeten door dynamische lichtverstrooiing (DLS) c ) De zeta-potentiaal van Au@SiO₂ en FA-MTX geconjugeerd Au@SiO₂ NP's gemeten door dynamische lichtverstrooiing (DLS) bij pH=7.4 en T=25 °C, d ) Chromatogram van onbelaste MTX en FA gescheiden van FA-MTX geconjugeerd Au@SiO₂ NP gelijktijdig gemeten met HPLC-methode

Dynamische lichtverstrooiing (DLS)-metingen gaven aan dat FA-MTX Au@SiO₂ vervoegde De grootte van NP's lag in het nanometerbereik (105 ± 2,3 nm) met een smalle grootteverdeling (figuur 2b).

Zeta-potentiaal is een belangrijke fysisch-chemische parameter die de stabiliteit van nanosuspensies beïnvloedt. Extreem positieve of negatieve zeta-potentiaalwaarden veroorzaken grotere afstotende krachten. Aan de andere kant zorgt de hoge lading van de deeltjes, positief of negatief, ervoor dat de NP's door de fagocyten van de lever worden geabsorbeerd en door het lichaam worden afgevoerd. Bij een gecombineerde elektrostatische en sterische stabilisatie is een minimale zeta-potentiaal van ± 20 mV wenselijk [69,70,71]. De zeta-potentiële gegevens van NP's werden vergeleken voor en na het laden met de MTX-FA bij pH =7, 4 en T =25 ° C (figuur 2c). De verkregen zeta-potentialen van Au@SiO₂ NP's waren +13,3 mV, die na dubbele medicijnbelading afnam tot -19,7 mV, wat in het gewenste bereik lag. De MTX en FA hadden een negatieve netto lading bij pH (7,4) boven de pka (3,8 en 4,8, 3,5 en 4,3), vanwege de de-protonering van twee carbonzuurgroepen in de structuur ([72], https:// pubchem.ncbi.nlm.nih.gov.). Daarom, na gelijktijdig laden van MTX en FA op Au@SiO₂ NP's, de nettolading werd negatief.

TEM-analyse geeft de definitieve individuele deeltjesgrootte. Au nanodeeltje werd gezien als donkere bollen verspreid op de SiO2 NP's als een grijze bedlaag. TEM-afbeeldingen bevestigden dat de Au@SiO2 NP's zijn gesynthetiseerd met een homogene bolvorm waarin de gemiddelde deeltjesgrootte ongeveer 25 nm was (Fig. 3).

TEM-afbeelding van Au@SiO₂ nanodeeltjes

Drugs laden

Hierin bemiddelt foliumzuur de verhoogde opname van BNP's in de bepaalde soorten kankercellen die de folaatreceptor tot overexpressie brengen via receptorgemedieerde endocytose om de lage werkzaamheid van internalisatie van BNP's te overweldigen, daarom staat de folaatreceptor bekend als een tumormarker en wordt folaat steeds meer gebruikt voor tumoren. targeting [67, 73].

Na conjugatie van MTX- en FA-moleculen in Au@SiO₂ NP's, veranderde de zeta-potentiaal van +13,3 naar -19,7 mV. De geschatte pKa-waarden van de twee carbonzuurgroepen van MTX zijn 3,8, 4,8 en FA is 3,5 en 4,3 [72], https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov. Daarom, als gevolg van de-protonering van twee carbonzuurgroepen van MTX en FA bij een pH van 7,4 die hoger is dan hun pka, werd de nettolading negatief en duidt dit op de succesvolle conjugatie van MTX en FA op Au@SiO₂ NP's. De Ying Tian et al laten zien dat MTX-belasting op Au-nanodeeltjes met een diameter van 18 en 30 mm respectievelijk 15 ± 0,4% en 10 ± 1,0% is [74]. In deze studie werden FA en MTX geladen in Au@SiO2 NP's met een inkapselingsefficiëntie van respectievelijk 22,6 en 77,5%. Chromatogram van gelijktijdige MTX- en FA-beoordelingspiek is weergegeven in Fig. 2d.

Cell-uptake

Omdat de intracellulaire fotothermische middelen de efficiëntie van fotothermische kankertherapie [75] kunnen verbeteren, werd aangenomen dat celinternalisatie van fotothermische materialen noodzakelijk is. In vitro cellulaire opnametest werd uitgevoerd met MDA-MB-231-cellen voor borstkanker, waarvan bekend is dat ze de folaatreceptor in hoge mate tot overexpressie brengen [40]. Onderzoek naar de rol van FA als targeting agent en de efficiëntie van de oppervlaktecoating op de opname van Au@SiO₂ NP's door doelcellen, MCF-7 en MDA-MB-231 cellen werden behandeld met Au@SiO2 NP's en MTX-FA geladen Au@SiO2 NP's. De resultaten van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de celopname werden getoond in Fig. 4. De resultaten toonden aan dat de opname van Au@SiO2 NP's in zowel MCF-7 als MDA-MB-231 gedurende de celkweektijd voor alle monsters was toegenomen (Fig. 4 en 5). ). Ook was na oppervlaktedecoratie van Au@SiO2 NP's met MTX en FA de celopname significant verhoogd op zowel MCF-7 als MDA-MB-231 als folaatreceptor tot expressie brengende cellen. MTX-FA-geladen Au@SiO2 NP's opname in MDA-MB-231 cellen was groter dan MCF-7. Omdat MDA-MB-231-cellen hogere niveaus van folaatreceptoren aan het oppervlak tot expressie brengen, werd een groot deel van de folaatreceptor-gerichte NP's ingevoerd via receptor-gemedieerde endocytose-mechanisme, wat resulteerde in een hogere cellulaire opname. In een andere studie vindt de verhoogde celinternalisatie van de folaat-geconjugeerde NP's alleen plaats in de kankercellen die de aHFR tot overexpressie brengen en niet in de gezonde cellen die minder celoppervlakte-expressie van aHFR's hebben [40]. Conjugatie van Au@SiO2 NP's met FA kan de celopname van NP's en methotrexaat vergemakkelijken, wat leidt tot verhoogde toxiciteit voor MDA-MB-231-cellen [76].

Kwantitatieve celopname-assay van rhodamine B-gelabeld Au@SiO₂ nanodeeltjes (NP) of rhodamine B-gelabeld MTX-FA geladen Au@SiO₂ nanodeeltjes (NPD) in MCF-7 (a ) en MDA-MB-231(b ) cellijnen voor blootstellingsduren van 0,5 uur, 1,5 uur en 3 uur verkregen door flowcytometrie. Niet-behandelde cellen van beide cellijnen werden gebruikt als negatieve controle. c Vergelijking van gemiddelde fluorescentie-intensiteit van rhodamine B-gelabeld Au@SiO₂ nanodeeltjes (NP) of rhodamine B-gelabeld MTX-FA geladen Au@SiO₂ nanodeeltjes (NPD) voor blootstellingsduren van 0,5 uur, 1,5 uur en 3 uur verkregen door flowcytometrie

A Kwalitatieve celopname-assay met behulp van Rhodamine B-gelabeld Au@SiO₂ nanodeeltjes (NP) in MCF7 met een blootstellingsduur van 30 (a .) ), 90 (b ) en 180 (c ) min of rhodamine B-gelabeld MTX-FA geladen Au@SiO₂ nanodeeltjes (NPD) met een blootstellingsduur van 30 (d .) ), 90 (e ) en 180 (f ) min en (B ) Kwalitatieve celopname-assay met behulp van Rhodamine B-gelabeld Au@SiO₂ nanodeeltjes (NP) in MDA-MB-231 met een blootstellingsduur van 30 (a ), 90 (b ) en 180 (c ) min of rhodamine B-gelabeld MTX-FA geladen Au@SiO₂ nanodeeltjes (NPD) met een blootstellingsduur van 30 (d .) ), 90 (e ) en 180 (f ) min vastgelegd door fluorescerende microscopie

Cytotoxiciteitstest

In vitro cellulaire cytotoxiciteitsstudies van het vrije MTX, blanco Au@SiO₂ NP's en MTX-FA geconjugeerd Au@SiO₂ NP's werden gedurende 24, 48 en 72 uur geëvalueerd met MTT-assay (Fig. 6). De resultaten van de MTT-assay toonden aan dat Au@SiO₂ NP's hadden geen cytotoxisch effect op de MCF-7- en MDA-MB-231-cellijnen. Bovendien, om de cytotoxiciteitseffecten van zowel vrij MTX als MTX-FA geconjugeerd Au@SiO₂ te vergelijken NP's werd dezelfde concentratie MTX (25, 50, 100 en 200 g/ml) gebruikt voor alle behandeltijden. Celcytotoxiciteitsresultaten geven aan dat vrij MTX of MTX-FA geconjugeerd Au@SiO₂ NP's vertoonden een sterftecijfer van ongeveer 10-25% in beide cellijnen na 24 uur behandeling. Eerdere studies rapporteerden het proliferatieve effect van gouden nanodeeltjes op verschillende cellijnen zoals murine osteoblast MC3T3-E1 cellen en menselijke parodontale ligamentstamcellen onder in vitro omstandigheden. Onze resultaten zijn in lijn met deze onderzoeken en figuur 6a en b toonden het proliferatieve effect van vrije Au@SiO2 NP's. Daarom kan het gelijke cytotoxische effect van met MTX en FA-MTX geladen Au@SiO2-nanodeeltjes (NPD) te wijten zijn aan dit fenomeen [77, 78].

een MCF-7 en (b ) MDA-MB-231 celgroeiremmingspercentages na behandeling met verschillende concentraties NP, MTX en FA-MTX geladen Au@SiO₂ nanodeeltjes (NPD) na blootstellingstijd van 24, 48 en 72 uur

Laserstraling

In deze studie werd de cellevensvatbaarheid van MCF-7 en MDA-MB 231-cellen behandeld met Au@SiO₂ NP's en MTX-FA geladen Au@SiO₂ NP's na laserbestraling met een dosis in het bereik van 30-105 J/cm² werd onderzocht door MTT-assay. Het sterftecijfer van MCF-7- en MDA-MB-231-cellen die zijn behandeld met met MTX-FA geladen Au@SiO₂ NP's (de MTX-concentratie was 100 g/ml) na LLLT bij een dosis van 75 J/cm² waren respectievelijk ongeveer 39 en 45,5%. Terwijl in dezelfde toestand de cellen behandeld met Au@SiO₂ NP's na laserbestraling of laser alleen vertoonden geen duidelijke celdood. Ook door de laserdosis te verhogen tot 105 J/cm² het sterftecijfer van beide cellijnen nam toe tot 60-75%, terwijl beide cellijnen werden behandeld met Au@SiO₂ NP's +laser of laser alleen bij dezelfde bestralingsdosis vertoonden geen cytotoxisch effect. De IC50-waarde voor MCF-7- en MDA-MB-231-cellen na combinatietherapie met met MTX-FA geladen Au@SiO₂ NP's (MTX-dosis van 100 g/ml) en LLLT werden verkregen bij een dosis van 90 en 75 J/cm² , respectievelijk. Aan de andere kant is het sterftecijfer van MTX en MTX-FA geladen Au@SiO₂ NP's zonder laserbestraling bij een MTX-dosis van 100 g/ml (geselecteerde dosis voor onderzoek naar lasertherapie) was tussen de 15-25% in beide cellijnen. Deze resultaten gaven aan dat de combinatie van MTX-FA geladen Au@SiO₂ NP's en lasertherapie vertoonden een synergetisch effect in beide cellijnen en verminderde de levensvatbaarheid van de cellen significant (p <0.001) compared to cells received only laser irradiation. These results indicated that NPs treatment, especially with targeting strategy can improved the efficacy of laser therapy in breast cancer cell destruction (Fig. 7).

A comparison of cell growth inhibition rates exposed to different laser powers (30, 60, 75, 90 and 105 J/cm² ) for treatment groups of laser alone, laser + Au@SiO2 nanoparticles and laser + MTX-FA loaded Au@SiO2 nanoparticles directed for two cell line MCF-7 (a ) and MDA-MB-231(b ) with subsequent checking after 24h

Apoptosis study by DAPI

The apoptosis were studied in MCF-7 and MDA-MB-231 cells after treatment with Au@ SiO₂ NPs; MTX-FA loaded Au@ SiO₂ NPs with or without laser to know if laser treatment could enhance the efficacy of chemotherapy. Our results summarized in Fig. 8 indicated that normal MCF-7 and MDA-MB-231 cells without any treatment set as control as well as cells treated with laser alone or free Au@SiO₂ NPs without laser irradiation had typical nuclei, lacking any apoptosis. However, MCF-7 and MDA-MB-231 cells treated with free MTX, Au@ SiO₂ NPs with laser irradiation and MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs without laser irradiation showed partial apoptotic nuclei (Fig. 8). The cells treated with MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs in combination with laser irradiation (810 nm, 75 J/cm² , 139 sec) showed a major drop in MCF-7 and MDA-MB-231 cell population. Therefore, laser irradiation efficacy was enhanced after MTX/FA loaded Au@SiO₂ NPs uptake on MCF-7 and MDA-MB-231 cells. Hence, the novel developed MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs has the capability of augmenting the photothermal effects by highly fragmented cell nuclei, a radical rise in cell loss and complete damage of cells.

Apoptosis assay using DAPI staining for MCF-7 or MDA-MB-231 cells, images captured using an inverted microscope. The untreated cells as the negative control (a ), cells treated with laser (75 J/cm² ) as positive control (b ) cells treated with Au@SiO₂ nanoparticles (NP (c ), cells treated with laser (75 J/cm² ) and Au@SiO₂ nanoparticles (NP) (d ), cells treated with MTX without laser irradiation (e ), cells treated with MTX and laser irradiation (f ), cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO₂ nanoparticles (NPD) without laser exposure (g ), and cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO₂ nanoparticles (NPD) with Laser exposure (h )

Cell cycle

Cell cycle distributions after treatment with MTX, Au@SiO₂ NPs and MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs either in combination with LLLT (75 J/cm² ) or without laser irradiation was studied in both MCF-7 and MDA-MB-231 cells using flowcytometry and PI staining of DNA. Our study indicated that in MDA-MB-231 or MCF-7 cells, the percentage of non-treated cells (control group) were actively in phase S (Fig. 9a, b). Using 75 J/cm² laser treatments reduced the percentage of cells in S-phase in a non-significant manner. On the other hand the cells irradiated with LLLT without NP and drug treatment showed the significant increase in Go/G1 cell population indicated the safety of LLLT alone. Also NPs treatment did not disturb the cell cycle in both cell lines. Treatment of cells with free MTX in the absence or presence of laser irradiation showed some disturbances in cell cycles, including reduction of cells in S-phase. Using NPD alone reduced the cells in S-phase. And interestingly using MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs (NPD) enhanced the cell percentage in sub Go/G1 as a sign of apoptosis [72]. Also the percentage of the MDA-MB-231 cells present in sub Go/G1 (around 18%) were significantly higher than MCF-7 cells (12%) in MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs (NPD) treatment group due to the higher uptake of NPs in MDA-MB-231 cells.

Cell cycle distributions investigated for MCF-7 (A ) or MDA-MB-231 (B ) cellen. The untreated cells as negative control (a ), cells treated with laser (75 J/cm² ) as positive control (b ) cells treated with Au@SiO₂ nanoparticles (NP) (c ), cells treated with laser (75 J/cm² ) and Au@SiO₂ nanoparticles (NP) (d ), cells treated with MTX without laser irradiation (e ), cells treated with MTX and laser irradiation (f ), cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO₂ nanoparticles (NPD) without laser exposure (g ), and cells treated with MTX-FA-loaded Au@SiO₂ nanoparticles (NPD) with Laser exposure (h ), C ) Quantitative results of cell cycle arrest and its distribution

Ramos et al , showed that in tumor cells, LLLT increases the percentage of cells in S and G2 /M phases, also they detected a reduction in proliferation and enhancing in senescence [79]. The cell cycle study after LLLT (15 J/cm2) showed a G1 arrest, which is in line with growth stopover in irradiated TK6 cells [80]. Another group reported that PTT is primarily disturbing cells in the S phase and increasing the cell population and arrest in the G2/M phase [81]. As a result, PTT can induce radio-sensitization of the cells via disturbing cell cycle [82]. Their results are in accordance with our study, which showed cell cycle disturbance and reduction of cells in S-phase. Our study also showed the increase in population of apoptotic cells (sub Go/G1) after combination chemo-photothermal therapy. Therefore, applying a combination of LLLT and MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs (NPD) as breast cancer targeted nanoparticles could enhance the breast cancer therapy efficacy.

Conclusies

In this study MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs was designed for target breast cancer therapy in combination with LLLT as noninvasive, FDA approved laser therapy. MTX and FA loaded Au@SiO₂ NPs with spherical morphology and mean diameter of 25nm and surface charge of -19.7 was obtained. This size and surface charge is in a suitable range to increase the bio-distribution of NPs. The successful targeted strategy of this novel developed NPs was approved with a higher cellular uptake percentage of MDA-MB-231 compared to MCF-7 as two breast cancer cell lines with different folate receptor expression. The MTT assay, DAPI staining and cell cycle study's results indicated that the combination of chemo-photothermal therapy showed synergistic effect and the cytotoxicity and apoptosis effect on both breast cancer cell lines especially on MDA-MB-231 cells was increased significantly(p <0.001). Since the Au@SiO₂ nanoparticles or LLLT showed no cytotoxic effects, it can be concluded that our therapeutic design has synergistic effects on targeted site. The findings of this study could be useful for designing future cancer therapy programs using bio-chemotherapy combined with low level lasers.